基于NF-κB信号通路探讨八宝丹对乳腺癌小鼠移植瘤生长与炎症反应的抑制作用

Inhibition of Babaodan on Growth and Inflammatory Response of Transplanted Tumor in Breast Carcinoma Mice Based on NF-κB Signaling Pathway

摘要

目的 基于核因子（NF）-κB信号通路探讨八宝丹（BBD）对乳腺癌移植瘤小鼠的影响。 方法 选择SPF级6周龄雌性BALB/c裸鼠12只，采用皮下注射乳腺癌细胞MDA-MB-231构建乳腺癌移植瘤小鼠模型，并随机分为对照组与干预组各6只。干预组按5 g/（kg·d）给予 BBD灌胃液灌胃，对照组按0.1 mL/（kg·d）给予生理盐水灌胃，连续灌胃28 d。干预后每2 d测量小鼠体质量和肿瘤体积，并测量干预前后肿瘤重量；HE染色法观察心、肝、肾组织病理学变化；ELISA检测血清肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）、天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）的含量；免疫组化法检测肿瘤组织抗原性核增殖因子Ki67、增殖细胞核抗原（PCNA）、NF-κB p65亚基（p65）、p-p65、NF-κB抑制蛋白-α（IκB-α）、p-IκB-α的阳性表达率。 结果 HE染色结果显示：2组心、肝、肾组织形态学正常，细胞形态正常，未观察到炎症细胞浸润、细胞坏死或其他毒性相关病理学改变。2组小鼠不同时间段体质量比较差异无统计学意义（P＞0.05）。2组小鼠14 d内肿瘤体积差异无统计学意义（P＞0.05），第16天开始，干预组小鼠肿瘤体积较对照组明显减小（P＜0.05）。与对照组比较，干预组干预后小鼠肿瘤重量明显降低（P＜0.05）；血清LDH含量明显降低（P＜0.05），CK、AST、ALT含量比较差异无统计学意义（P＞0.05）；肿瘤组织Ki67、PCNA阳性表达率和p-p65/p65、p-IκB-α/IκB-α均明显降低（P＜0.05）。 结论 BBD可抑制乳腺癌小鼠移植瘤生长和炎症反应，其机制可能与调控NF-κB信号通路相关。

Abstract

Objective To investigate the effect of Babaodan (BBD) on xenografted breast tumor in mice based on nuclear factor-κB (NF-κB) signaling pathway. Methods A total of twelve 6-week-old female BALB/c nude mice with SPF grade were subcutaneously injected with breast cancer cells MDA-MB-231 to construct a xenografted breast tumor mouse model and were randomly divided into control group and intervention group, with 6 mice in each group. The intervention group was given BBD by gastric lavage at a dose of 5 g/(kg·d), while the control group was given physiological saline by gavage at a dose of 0.1 mL/(kg·d) for 28 consecutive days. The body weight and tumor volume of mice were measured every 2 days after intervention, and the tumor weight was measured before and after intervention. HE staining method was used to observe pathological changes in heart, liver, and kidney tissues; ELISA was used to detect the levels of serum creatine kinase (CK), lactate dehydrogenase (LDH), aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), tumor necrosis factor-α (TNF-α), and interleukin-6 (IL-6); immunohistochemistry was used to detect the protein expression of antigenic nuclear proliferation factor Ki67, proliferating cell nuclear antigen (PCNA), NF-κB p65 subunit (p65), p-p65, NF-κB inhibitory protein-α (IκB-α), and p-IκB-α in breast tumor tissues. Results The HE staining results showed that the morphology of the heart, liver, and kidney tissues in both groups was normal, with normal cell morphology. No inflammatory cell infiltration, cell necrosis, or other toxicity related pathological changes were observed. There was no significant difference in body weight between the two groups of mice at different time periods (P>0.05). There was no significant difference in tumor volume between the two groups within 14 days (P>0.05), and the tumor volume of the intervention group decreased significantly compared to the control group from day 16 onwards (P<0.05). Compared with the control group, the tumor weight and serum LDH content in the intervention group significantly reduced (P<0.05), and the positive expression rates of Ki67 and PCNA and the ratios of p-p65/p65 and p-IκB-α/IκB-α in tumor tissues significantly decreased (P<0.05). There was no significant difference in the contents of CK, AST and ALT between the two groups (P>0.05). Conclusion BBD can inhibit the growth and inflammatory reaction of xenografted breast tumor in mice, and its mechanism may be related to the regulation of NF-κB signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

乳腺癌 / 八宝丹 / NF-κB / 炎症 / 增殖

Key words

breast carcinoma / Babaodan / NF-κB / inflammation / proliferation

乳腺癌（breast carcinoma，BC）是女性最常见的恶性肿瘤之一，在全世界女性恶性肿瘤中发病率位居首位，并呈现逐年加重的趋势^［1］。BC早期症状多表现为乳房肿块、乳头溢液、腋窝淋巴结肿大等症状，晚期则可因肿瘤细胞发生远处转移，出现全身多器官病变，直接威胁生命。慢性炎症是多种癌症发生和发展的重要推动因素，在炎症微环境中，持续的细胞应激、免疫细胞浸润和促炎因子释放会导致DNA损伤、基因突变和异常的细胞增殖，从而增加癌变的风险。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）等促炎性细胞因子水平升高会激活下游的核因子（nuclear factor，NF）-κB炎症信号通路，推动细胞的增殖和存活，并抑制细胞凋亡，从而促进肿瘤的发展。因此，调控NF-κB信号通路是治疗BC的重要途径。中药复方通过多种机制发挥抗肿瘤作用，调节机体免疫功能，增强患者自身的抗癌能力，体现了中医药在肿瘤治疗中的综合优势^［2-3］。八宝丹（BBD）属于国家相关文件规定的特效药、关键药之一，可以抑制肿瘤细胞生长、调控肿瘤细胞周期和诱导肿瘤细胞凋亡^［4-5］。已有研究表明八宝丹能抑制乳腺癌细胞增殖^［6］，但其具体分子作用机制有待进一步研究完善。因此本研究以NF-κB信号通路为切入点，研究八宝丹对乳腺癌的治疗机理，为临床治疗乳腺癌提供更多的用药依据。

1 实验材料

1.1 实验动物和细胞

SPF级6周龄雌性BALB/c裸鼠15只，体质量20～22 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2017-0005。裸鼠饲养于福建中医药大学动物实验中心，实验动物使用许可证号：SYXK（闽）2023-0004，恒温22～25 ℃，固定湿度为45%～65%，明暗交替，自由饮水。试验过程严格按照2006年中华人民共和国科技部《关于善待实验动物的指导性意见》的有关要求进行，并经福建中医药大学动物伦理委员会审定（FJTCM IACUC 2023295）。人乳腺癌MDA-MB-231细胞（货号：CL-0150）购自武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.2 实验药物

BBD（批号：230402，0.3 g/粒）购自厦门中药厂有限公司，取10粒BBD胶囊包装中的粉末，加入15 mL PBS溶液，超声助溶，配制成浓度为200 mg/mL的 BBD母液，灭菌摇匀后，于-20 ℃放置备用。

1.3 实验试剂

DMEM培养基（货号：PM150210）、青霉素-链霉素溶液（货号：PB180120）、胎牛血清（FBS，货号：164210）均购自武汉普诺赛生命科技有限公司；胰蛋白酶（美国Gibco公司，货号：25200056）；台盼蓝染色液（北京索莱宝科技有限公司，批号：C0040）；表阿霉素（大连美仑生物技术有限公司，货号：MB1094）；多西他赛（美国MCE公司，货号：HY-B0011）；免疫组化试剂盒（货号：KIT-9720）、DAB试剂盒（货号：KIT-0031）均购自福州迈新生物技术开发有限公司；TNF-α（货号：MM-0132M2）、IL-6（货号：MM-0163M1）、肌酸激酶（CK，货号：MM-0734M1）、乳酸脱氢酶（LDH，货号：MM-43732M1）均购自江苏酶免实业有限公司；丙氨酸转氨酶（ALT，货号：C009-2-1）、天冬氨酸转氨酶（AST，货号：C010-2-1）均购自南京建成生物工程研究所；NF-κB p65亚基（p65，货号：YT3108）、p-p65（货号：YP0191）、NF-κB抑制蛋白-α（IκB-α，货号：YT2419）、p-IκB-α（货号：YP0151）均购自北京安诺伦生物科技有限公司；抗原性核增殖因子 Ki67（货号：A20018）、增殖细胞核抗原（PCNA，货号：A12427）均购自武汉爱博泰克生物科技有限公司。

1.4 实验仪器

智能细胞分析仪（美国Luminex公司，型号：MUSE）；多功能酶标仪（奥地利Tecan公司，型号：TECAN SPARK）；超薄切片机（型号：UC6）、生物显微镜（型号：DM2700P）均购自德国Leica公司。

2 实验方法

2.1 细胞培养

MDA-MB-231细胞应用含有10% FBS、1%青霉素-链霉素双抗的DMEM完全培养液，置于37 ℃、5% CO₂培养箱中进行培养。当细胞生长密度达到90%，使用胰蛋白酶消化后进行细胞计数，收集细胞，1 000 r/min离心3 min，PBS溶液冲洗5 min，弃去上清液，用PBS溶液稀释至浓度为1×10⁷个/mL的细胞悬浮液，用于下一步的动物模型制作。

2.2 动物造模及干预

15只小鼠适应性喂养1周后，选取体质量接近、状态较好的12只小鼠进行造模，尽量减少实验开始前动物的基本差异性。将0.1 mL MDA-MB-231细胞悬浮液接种于小鼠右腋皮下，制备乳腺癌移植瘤小鼠模型。植入后第7天，将裸鼠随机分为对照组与干预组各6只，干预组按生药量5 g/（kg·d）给予BBD灌胃液灌胃^［7-8］，对照组按0.1 mL/（kg·d）给予生理盐水灌胃，连续灌胃28 d。

2.3 小鼠体质量与移植瘤体积测量

干预后每隔2 d测量小鼠体质量，并应用游标卡尺测量裸鼠瘤体的长（L）与宽（W），计算肿瘤体积。

肿瘤体积＝π/6×L×W²

2.4 动物取材

实验结束时，使用3%～4%异氟烷处死动物，经腹主动脉取得的全血，切除肿瘤，取心、肝、肾组织，测量肿瘤体积与重量，并拍照。全血在EP管中室温静置1 h以上，12 000 r/min离心20 min，取上清，分装后置于-80 ˚C保存备用。切取部分肿瘤、心、肝、肾组织放入4%多聚甲醛中固定，用于HE染色和免疫组化实验。

2.5 HE染色观察小鼠心、肝、肾组织病理情况

将固定后的心、肝、肾组织用乙醇脱水后常规石蜡包埋，进行石蜡切片，切片厚度为4 μm。将石蜡切片按顺序分别在二甲苯Ⅰ、Ⅱ中放置15 min，随后在无水乙醇Ⅰ、Ⅱ中各放置5 min，95%、80%、70%乙醇各放置5 min，最后用纯水清洗5 min，对石蜡切片进行脱蜡。随后，使用苏木精染液染色切片5 min，并使用0.5%伊红染液质染色15 s。吹干后用中性树胶封片，显微镜下观察拍照。

2.6 免疫组化法检测肿瘤组织增殖和NF-κB信号通路相关蛋白表达

石蜡包埋组织切片后，使用二甲苯、梯度乙醇脱蜡，随后用柠檬酸钠溶液进行抗原修复，免疫组化笔圈出组织。按照免疫组化试剂盒说明书依次滴加试剂，随后滴加Ki67、PCNA、p-p65、p65、p-IκB-α、IκB-α一抗（均为1∶500），放入4 ℃冷库过夜，第2天孵育二抗，滴加DAB显色，随后苏木素染核。显微镜下观察并拍照，使用ImageJ软件测量肿瘤组织中Ki67、PCNA、p-p65、p65、p-IκB-α、IκB-α的阳性表达面积，并计算阳性表达率。

阳性表达率＝阳性表达面积/总面积×100%

2.7 ELISA检测血清TNF-α、IL-6、CK、LDH、AST、ALT含量

采用ELISA法测定血清中TNF-α、IL-6、CK、LDH、AST、ALT含量，按照试剂盒说明书，于波长450 nm处，读取OD值，绘制标准曲线，并根据该曲线计算相应指标的浓度。

2.8 统计学方法

采用SPSS 26.0软件对数据进行处理。计量资料符合正态分布以（\overline{x}±s）表示，组间比较采用两独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结　果

3.1 2组小鼠体质量、肿瘤体积与肿瘤重量比较

2组小鼠不同时间段体质量比较差异无统计学意义（P＞0.05）。2组小鼠14 d内肿瘤体积差异无统计学意义（P＞0.05），第16天开始，干预组小鼠肿瘤体积较对照组明显减小（P＜0.05）。与对照组比较，干预组干预后小鼠肿瘤重量明显降低（P＜0.05）。见图1~图3。

3.2 2组小鼠心、肝、肾组织病理学情况比较

2组心、肝、肾组织形态学正常，细胞形态正常，未观察到炎症细胞浸润、细胞坏死或其他毒性相关病理学改变。见图4。

3.3 2组血清心、肝功能指标比较

与对照组比较，干预组血清LDH含量明显降低（P＜0.05），CK、AST、ALT含量比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

3.4 2组肿瘤组织Ki67、PCNA表达比较

与对照组比较，干预组肿瘤组织Ki67、PCNA阳性表达率均明显降低（P＜0.05）。见图5。

3.5 2组血清TNF-α、IL-6含量比较

与对照组比较，干预组血清TNF-α、IL-6含量均明显降低（P＜0.05）。见表2。

3.6 2组肿瘤组织NF-κB信号通路相关蛋白表达比较

与对照组比较，干预组肿瘤组织p-p65/p65、p-IκB-α/IκB-α均明显降低（P＜0.05）。见图6。

4 讨　论

BC作为女性常见恶性肿瘤之一，严重威胁着女性健康。中医学认为BC的发生与气滞血瘀密切相关，情志不畅、外感风寒或湿热等因素可导致气机阻滞，进而引发血液循环不畅，形成瘀血，从而诱发肿瘤的形成。BBD的主要成分包括牛黄、麝香、三七、羚羊角和珍珠等，具有清利湿热、祛瘀散结的作用。诸多研究证明BBD可以诱导乳腺癌细胞生长停滞和细胞凋亡，诱导骨肉瘤细胞凋亡，在防治恶性肿瘤中有其独特的疗效优势^［9-12］，本研究也证实了BBD能明显抑制乳腺癌肿瘤的增长。

接受不同剂量的药物会对机体产生不同的作用，其中毒副作用，特别是毒性作用对机体有较大的损害。在各种毒性作用中，心、肝、肾毒性是较多且影响严重的毒性。为确保药物的安全性，在药物开展临床试验之前，都需要进行毒性研究。本研究HE染色结果显示：2组心、肝、肾组织并无明显的病理学改变，提示BBD并无明显毒副作用。CK和LDH是心肌酶，能够反映心肌损伤及其严重程度，ALT和AST常用来评价肝脏损伤程度^［13］，可进一步观察BBD对心、肝是否有损伤。本研究结果表明：2组血清CK、AST、ALT含量比较差异无统计学意义，干预组LDH含量明显降低，提示BBD不会损伤心、肝功能，还能有效改善肿瘤进展中的心肌功能损伤。

在肿瘤形成过程中，肿瘤细胞失去了细胞正常的生长调控机制，不断地增殖和扩散，且不受体内信号的限制。Ki67是一种细胞周期相关蛋白，可反映乳腺癌细胞增殖情况，在评估病情和制定治疗方案中具有重要作用^［14］；PCNA是细胞增殖的标志物，在增殖细胞核中特异性表达，与乳腺癌细胞增殖呈正相关^［15］。本研究表明，干预组肿瘤组织Ki67、PCNA较对照组明显降低，提示BBD能够有效抑制BC肿瘤细胞的增殖。

NF-κB信号通路是常见的肿瘤炎症信号通路，被广泛认为是乳腺癌细胞存活、增殖、侵袭和迁移的重要调控机制。p65是经典NF-κB的组成亚基之一，在NF-κB活化后进入细胞核，结合DNA启动靶基因转录；IκB-α是NF-κB的抑制蛋白，与NF-κB（如p65/p50）复合存在于细胞质中，防止NF-κB自由进入细胞核 ^［16］。因此，p-p65/p65是NF-κB信号通路活化的核心标志，p-IκB-α/IκB-α是判断通路抑制或激活的重要指示蛋白。激活的NF-κB转录因子进入细胞核，促进与细胞存活、增殖和炎症相关基因的表达，导致细胞持续增殖、逃避凋亡，并加速癌变^［17-19］。本研究结果表明：干预组肿瘤组织p-p65/p65、p-IκB-α/IκB-α较对照组明显降低，提示BBD可抑制NF-κB信号通路的激活。

德国病理学家Rudolf Virchow发现肿瘤组织中有大量炎症细胞的浸润，提出肿瘤起源于慢性炎症的猜想。近年来，随着炎症和肿瘤研究的不断深入，炎症已被认为是肿瘤的特征之一^［20］，是肿瘤微环境的重要组成部分。炎症微环境中的促炎因子如TNF-α、IL-6可激活NF-κB信号通路，激活的NF-κB通路进一步产生更多的TNF-α、IL-6，形成正反馈循环^［21］。本研究结果显示：干预组血清TNF-α、IL-6含量较对照组明显降低，提示BBD能有效抑制肿瘤进展过程中的炎症反应。

综上所述，BBD可能通过调控NF-κB信号通路抑制裸鼠乳腺癌肿瘤生长和增殖，抑制炎症反应，从而发挥治疗乳腺癌的作用。同时，本实验未使用相关通路抑制剂进行对比，也未从分子生物学角度进一步揭示BBD作用于NF-κB信号通路的确切机制，有待今后进一步探索。

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基金资助

福建省自然科学基金项目(2023J01828)

福建省卫生健康中青年骨干人才培养项目(2022GGA047)