推拿按揉法对坐骨神经损伤大鼠运动功能及NF-κB、c-Fos表达的影响

Effects of Tuina Pressing and Kneading Method on Motor Function and Expression of NF-κB and c-Fos in Rats with Sciatic Nerve Injury

摘要

目的 观察推拿按揉法对坐骨神经损伤大鼠运动功能及核因子（NF）-κB、c-Fos表达的影响。 方法 采用随机数字表法将36只SPF级大鼠分为空白组、模型组和推拿组，每组12只。空白组未进行任何处理，模型组和推拿组建立坐骨神经慢性压迫性损伤大鼠模型。推拿组造模成功后第4天于近似“委中穴”处进行有节律地按压揉动，每次按揉10 min，每日1次，连续干预14 d。采用TreadScan步态分析系统检测造模前和干预7、14 d大鼠坐骨神经功能指数和步态参数；HE染色法观察大鼠坐骨神经病理改变；Western blot检测大鼠坐骨神经NF-κB、c-Fos蛋白表达量。 结果 HE染色结果显示：模型组大鼠坐骨神经纤维连续性差、排列紊乱，纤维间隙增大，部分髓鞘脱失，轴突肿胀、变性甚至断裂，炎性细胞分布增多；推拿组坐骨神经纤维排布较模型组整齐且紧密，可见部分髓鞘和轴突再生，炎性细胞减少。与空白组比较，模型组干预7、14 d坐骨神经功能指数以及患肢步幅、平均步行速度、站立相压力均明显降低（P＜0.05），站立相时间明显缩短（P＜0.05），坐骨神经NF-κB、c-Fos蛋白表达量均明显升高（P＜0.05）。与模型组比较，推拿组干预7、14 d坐骨神经功能指数以及患肢步幅、平均步行速度和站立相压力均明显升高（P＜0.05），站立相时间明显延长（P＜0.05），坐骨神经NF-κB、c-Fos蛋白表达量均明显降低（P＜0.05）。 结论 推拿可能通过下调NF-κB、c-Fos蛋白表达，减轻坐骨神经损伤后局部炎症水平，促进受损神经修复，从而改善患侧下肢运动功能。

Abstract

Objective To observe the effect of tuina pressing and kneading method on motor function and the expression of NF-κB and c-Fos in rats with sciatic nerve injury. Methods A total of thirty-six SPF rats were randomly divided into blank group, model group and tuina group, with 12 rats in each group. A rat model of chronic constriction injury was established in the model and tuina groups, while the blank group did not receive any intervention. On the fourth day after successful modeling, the tuina group rhythmically pressed and kneaded the area around the "Weizhong acupoint" for 10 minutes each time, once a day for 14 days, while the blank and model groups did not receive any intervention. The TreadScan gait analysis system was used to detect sciatic nerve function index and gait parameters in rats before modeling and at 7 and 14 days of intervention; HE staining method was used to observe pathological changes in the sciatic nerve; Western blot was used to detect the protein expression of NF-κB and c-Fos in the sciatic nerve. Results The HE staining results showed that the sciatic nerve fibers in the model group had poor continuity, disordered arrangement, enlarged fiber gaps, partial demyelination, axonal swelling, degeneration, and even rupture, and increased distribution of inflammatory cells; the arrangement of sciatic nerve fibers in the tuina group was neat and tight compared to the model group, with some myelin sheaths and axons regenerating and a decrease in inflammatory cells. Compared with the blank group, the model group showed a significant decrease in sciatic nerve function index, affected limb stride, average walking speed, and standing pressure on the 7th and 14th day of intervention (P<0.05), a significant reduction in standing time (P<0.05), and a significant increase in sciatic nerve NF-κB and c-Fos protein expression (P<0.05). Compared with the model group, the tuina group showed a significant increase in sciatic nerve function index, affected limb stride, average walking speed, and standing pressure on the 7th and 14th day of intervention (P<0.05), a significant prolongation of standing time (P<0.05), and a significant decrease in sciatic nerve NF-κB and c-Fos protein expression (P<0.05). Conclusion Tuina pressing and kneading method may reduce local inflammation level after sciatic nerve injury by downregulating the protein expression of NF-κB and c-Fos, and promote the repair of the injured nerve, so as to improve the motor function of the affected lower limb.

Graphical abstract

关键词

坐骨神经损伤 / 推拿 / 按揉 / 运动功能 / NF-κB / c-Fos

Key words

sciatic nerve injury / tuina / pressing and kneading / motor function / NF-κB / c-Fos

周围神经损伤（peripheral nerve injuries，PNI）是一种临床常见且多发的神经损伤类疾病，其发病率在我国以200万人次/年的速度逐年攀升，其中青壮年人群占比高达83%^［1］。坐骨神经损伤是PNI最主要的类型之一，由于坐骨神经纤维受到挤压、牵拉等外力影响，造成下肢神经支配区域的感觉功能和运动功能障碍，出现以疼痛、麻木、肢体活动受限等为主的临床表现，严重影响患者的长期生活质量和心理健康^［2］。目前，PNI的治疗根据神经损伤程度，采用显微神经外科手术或联合促进神经修复再生类药物，神经功能恢复周期长且疗效不显著，而组织工程技术和基因治疗的安全性和有效性尚不明确，未能广泛应用于临床。推拿手法凭借疏经通络、活血化瘀的作用，可消除神经、肌肉与周围组织肿胀，促进局部神经细胞的代谢和循环，有效缓解疼痛，增强周围神经和肌肉功能的恢复^［3］。课题组前期多项研究证实：推拿能显著提高坐骨神经损伤大鼠机械痛、热痛和自发痛的阈值，恢复PNI感觉功能障碍^［4-5］，但关于推拿对PNI运动功能的相关影响及机制尚未明确。因此，本研究建立坐骨神经慢性压迫性损伤（CCI）模型^［6］，观察推拿对CCI模型后肢运动功能的作用，及坐骨神经损伤组织的形态病理变化，探索其潜在的修复机制，为推拿治疗PNI提供更全面的依据。

1 实验材料

1.1 实验动物

SPF级健康雄性SD大鼠36只，体质量（200±20）g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物生产许可证号：SYXK（沪）2020-0009。由福建中医药大学动物实验中心供应和喂养，实验动物使用许可证号：SYXK（闽）2020-0002。动物自由进食和饮水，其饲养过程中室温22～25 ℃，湿度50%，每日光照12 h。本研究通过福建中医药大学动物伦理委员会审批（FJTCM IACUC 2021049）。实验过程严格遵照学校实验动物保护相关制度和规定执行。

1.2 实验试剂

苏木精-伊红染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号：G1120）；RIPA裂解液（批号：WB0101）、BCA蛋白定量试剂盒（批号：WB0123）、GAPDH（批号：WB0197）均购自上海威奥生物科技有限公司；核因子（NF）-κB抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，批号：10745-1-AP）；即刻早期基因c-Fos抗体（美国Abcam公司，批号：ab222699）。

1.3 实验仪器

TreadScan步态分析系统（美国CleverSys公司）；电子光镜（日本olympus公司）；台式高速冷冻离心机（美国Thermo公司）；大鼠推拿操作指套装置（专利号201821318407.9）；大鼠推拿操作固定器（专利号201821139321.X）。

2 实验方法

2.1 分组与造模

将36只SD大鼠适应性饲养1周，采用随机数字表法将大鼠随机分为空白组、模型组和推拿组，每组12只。模型组和推拿组参照文献［6］建立坐骨神经慢性压迫性损伤（CCI）大鼠模型，该模型制备由同一位人员操作，保持造模稳定。麻醉状态下将大鼠一侧后肢大腿备皮、消毒后切开皮肤，通过钝性分离将坐骨神经充分暴露，用4.0可吸收羊肠线从近端向远端每间隔1 mm进行打结，每个结的松紧程度依据能够诱发大鼠腿部肌肉或足趾轻微抽动为准，逐层缝合后放回鼠笼饲养。大鼠次日出现术侧后足轻度外翻，并时常伴随舔舐、悬空等后肢保护现象，则表示模型制备成功。空白组不予任何处理。

2.2 干预

推拿组在造模成功后1～3 d，每天置于大鼠推拿操作固定器内15 min以适应环境。造模成功后第4天正式进行按揉手法干预，右手拇指带上大鼠推拿操作指套装置，放置于大鼠术侧腘窝处，近似“委中穴”位置吸定，进行有节律地按压揉动，同时根据指套装置的可视化动态参数调节按揉手法的施加力度，设定按揉力度为5 N，频率为120次/min，每次按揉10 min，每日1次，连续干预14 d^［7］。空白组和模型组不进行任何干预。

2.3 取材

干预结束后进行行为学检测，按体质量0.6 mL/100 g应用25%乌拉坦腹腔注射麻醉大鼠，逐层分离取出模型组和推拿组患侧的坐骨神经，以及空白组一侧的坐骨神经，迅速置于冰上用生理盐水冲洗后，将一部分放入冻存管并储存在-80 ℃冰箱，用于Western blot检测；另一部分置于4%多聚甲醛中固定，用于HE染色观察。

2.4 观察指标

2.4.1 行为学检测

应用TreadScan步态分析系统检测造模前和干预7、14 d的大鼠坐骨神经功能指数和步态参数，评估大鼠坐骨神经损伤后的功能恢复情况。造模前1～7 d，3组大鼠以20 m/min速度在步态分析仪上连续跑动，进行跑道环境适应训练，每次10 min，每日1次。检测时设定跑带速度为15 m/min，当大鼠在跑道上自主跑动时，采用高速彩色摄像机完整记录活动过程，每只大鼠每次录像10 s，并选取3段跑动清晰的录像导入系统分析软件，最终计算平均值。通过选取患侧足（E）和健侧足（N）的足印长度（PL）、足印宽度（TS）和中间足趾距离（IT），计算坐骨神经功能指数^［8］。该坐骨神经功能指数以0为正常值，-100为神经完全断离。通过步幅、平均步行速度、站立相压力和站立相时间等相关参数进行行为学分析。

坐骨神经功能指数＝-38.3×（EPL-NPL）/NPL＋109.5×（ETS-NTS）/NTS＋13.3×（EIT-NIT）/NIT-8.8

2.4.2 HE染色法观察大鼠坐骨神经病理改变

大鼠坐骨神经组织经4%多聚甲醛中固定后，经梯度脱水、石蜡包埋进行切片、脱蜡、苏木精和伊红染色，放置光镜下观察大鼠坐骨神经病理情况。

2.4.3 Western blot检测大鼠坐骨神经NF-κB、c-Fos蛋白表达量

大鼠坐骨神经组织经裂解、匀浆处理后，采用BCA法测定蛋白浓度。蛋白经过变性、电泳和转膜后，置于5%脱脂奶粉室温摇床封闭2 h。洗膜后加入NF-κB（1∶1 500）、c-Fos（1∶500）和GAPDH（1∶2 000）一抗，4 ℃摇床孵育过夜。次日漂洗后加入二抗（1∶2 000），在室温下孵育2 h，上机曝光成像，运用ImageJ图像分析软件进行条带分析。

2.5 统计学方法

采用SPSS 25.0软件进行数据分析。计量资料符合正态分布以（\overline{x}±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，若方差齐两两比较采用LSD-t法，若方差不齐则采用Games-Howell法。P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结　果

3.1 3组不同时间点坐骨神经功能指数比较

与空白组比较，模型组干预7 d和干预14 d坐骨神经功能指数均明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，推拿组干预7 d和干预14 d坐骨神经功能指数均明显提高（P＜0.05）。见表1。

3.2 3组不同时间点步态参数比较

与空白组比较，模型组干预7 d和干预14 d患肢步幅、平均步行速度、站立相压力均明显降低（P＜0.05），站立相时间明显缩短（P＜0.05）；与模型组比较，推拿组干预7 d和干预14 d患肢步幅、平均步行速度和站立相压力均明显提高（P＜0.05），站立相时间明显延长（P＜0.05）。见表2。

3.3 3组大鼠坐骨神经病理变化

空白组大鼠坐骨神经纤维呈紧密有序排布，髓鞘结构完整地包绕神经突起；模型组大鼠坐骨神经纤维连续性差、排列紊乱，纤维间隙增大，部分髓鞘脱失，轴突肿胀、变性甚至断裂，炎性细胞分布增多；推拿组坐骨神经纤维排布较模型组整齐且紧密，可见部分髓鞘和轴突再生，炎性细胞减少。见图1。

3.4 3组坐骨神经NF-κB、c-Fos蛋白表达量比较

与空白组比较，模型组坐骨神经NF-κB、c-Fos蛋白表达量均明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，推拿组坐骨神经NF-κB、c-Fos蛋白表达量均明显降低（P＜0.05）。见图2、表3。

4 讨　论

推拿在临床广泛应用于坐骨神经损伤引起的腰椎间盘突出症、梨状肌综合征、坐骨神经痛等疾病^［9］。委中穴作为古今腰腿部疾患应用频率最高的穴位之一，应用推拿按揉法进行干预，可缓解肌肉紧张对坐骨神经造成的刺激，减轻坐骨神经疼痛，还能促进局部神经、血管组织的微循环，减轻坐骨神经卡压，提高下肢活动范围，提升坐骨神经功能^［10-11］。并且，近年研究表明，按揉委中穴能有效调节坐骨神经传导速度，修复神经损伤^［3，12］。但上述研究缺乏较为客观、精确的方法对推拿修复坐骨神经损伤程度和功能恢复情况进行评价，对其内在的取效机制未进行探讨。

运动功能障碍是周围神经损伤的主要表现，坐骨神经损伤造成该神经分布沿线区域如臀部后侧和大腿后外侧的肌肉，因神经的营养和支配作用缺失而逐渐发生萎缩，患侧下肢膝关节、踝关节和足趾活动功能受损，诱发异常步态^［13］。步态不仅能够直接反映人类和动物在日常活动中最基本的运动方式——行走的特征，同时也是坐骨神经损伤修复的重要行为学证据^［14］。本研究通过检测大鼠在不同时间节点自由活动状态下的步态参数，发现模型制备前，3组坐骨神经功能指数和步态参数基线一致，坐骨神经损伤后CCI大鼠患侧后肢的站立相压力下降、站立相时间缩短，提示行走过程中CCI大鼠通过分配患肢局部的支撑力到健侧，起到患肢保护作用，这与本病临床患者的避痛步态相类似；平均步行速度和步幅均降低，表明CCI大鼠因坐骨神经受损，肢体运动的协调性明显下降。随着推拿干预的时间累积，CCI大鼠的运动模式明显改善。同时观察了双侧后足的足印长度、宽度及中间足趾距离，结果表明介入推拿治疗第7天起就能明显提升CCI大鼠的坐骨神经功能指数，恢复神经和肌肉功能，改善后肢精细动作。

坐骨神经功能损伤最终功能恢复程度与神经损伤的程度密切相关，本研究观察坐骨神经损伤附近的组织形态和病理变化，结果表明：推拿干预能恢复坐骨神经纤维的合理结构、有序排列，缩小纤维间隙，修复部分髓鞘、轴突使之再生，减少炎性细胞分布，从形态学上证实推拿具有良好的神经修复作用。

NF-κB是一种多效性因子，其控制许多编码炎症相关分子的基因，维护周围神经系统稳态^［15］。c-Fos广泛表达于神经细胞，是反应神经病理受损状态的关键指标^［16］。NF-κB和c-Fos参与受损周围神经的再生修复^［17］。CCI术后坐骨神经损伤区域NF-κB表达上调并发生核转位，驱动多种炎症因子并激活c-Fos，破坏神经修复相关微环境，而抑制NF-κB能缓解受损坐骨神经炎症，有助于轴突的修复^［18］。坐骨神经损伤早期c-Fos表达增加，与NF-κB形成正反馈回路相互促进，逐渐放大损伤信号，严重影响后期坐骨神经纤维的病理学变化和神经传导恢复。本研究结果显示：推拿组坐骨神经NF-κB、c-Fos蛋白表达量较模型组明显降低，从分子学水平证实推拿具有抑制损伤后炎症反应，创造适宜的神经生长微环境。

综上所述，推拿按揉法可能通过下调坐骨神经NF-κB、c-Fos的表达，降低损伤周围微环境的炎症水平，积极促进受损坐骨神经的修复，恢复患侧下肢的运动功能。然而，周围神经损伤后的修复是多个机制参与的复杂过程，后期将以本研究为锚点，进一步完善推拿与坐骨神经损伤相关信号通路的相互联系，以期为临床更大范围的推广应用提供有力依据。

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基金资助

福建省自然科学基金项目(2023J01880)

福建省自然科学基金项目(2022J01881)

福建省卫健委中青年人才骨干项目(2023GGA075)

国家自然科学基金青年科学基金项目(82105039)