全真一气汤对慢性阻塞性肺疾病大鼠氧化应激和炎症反应的影响

摘要

目的 探讨全真一气汤对慢性阻塞性肺疾病（COPD）大鼠氧化应激和炎症反应的作用及机制。 方法 采用随机数字表法将24只雄性SD大鼠分为空白组、模型组、中药组和西药组，每组6只，除空白组外，其余3组采用香烟烟雾熏吸法建立COPD大鼠模型。中药组按生药量40.86 g/（kg·d）予全真一气汤药液灌胃，西药组按3.23 g/（kg·d）予氨茶碱溶液灌胃，空白组和模型组按3 mL/（kg·d）予生理盐水灌胃，每日1次，连续干预3周。采用HE染色观察大鼠肺组织病理变化；ELISA检测血清白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）含量；免疫组化法检测肺组织小窝蛋白-1（Cav-1）蛋白表达；Westen blot检测肺组织核因子E2相关因子2（Nrf2）蛋白表达。 结果 ① 大鼠一般情况：空白组大鼠神志清醒，行动灵活，食欲正常，皮毛光亮，呼吸均匀，呼吸道内未见明显分泌物；模型组大鼠精神不振、食欲减退、毛发暗淡、呼吸道分泌物增多、气短、便溏等；与模型组比较，中药组及西药组大鼠临床症状及体征均有一定程度的改善。② HE染色结果：空白组肺泡结构基本正常，支气管壁无增厚，无炎症细胞浸润；模型组肺泡结构被破坏，大量炎症细胞浸润及渗出，支气管管壁增厚，管腔变形狭窄；中药组和西药组肺组织整体情况较模型组改善，可见少量炎症细胞渗出浸润，支气管管腔稍变形，管壁轻微增厚。③ 与空白组比较，模型组血清IL-6、TNF-α含量均明显升高（P＜0.05），肺组织Cav-1平均光密度值和Nrf2蛋白表达量均明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，中药组和西药组血清IL-6、TNF-α含量均明显降低（P＜0.05），肺组织Cav-1平均光密度值和Nrf2蛋白表达量均明显升高（P＜0.05）；与西药组比较，中药组肺组织Nrf2蛋白表达量明显升高（P＜0.05）。 结论 全真一气汤通过上调Cav-1以及Nrf2水平改善COPD大鼠肺组织结构，减轻炎症反应，缓解氧化应激损伤。

Graphical abstract

关键词

慢性阻塞性肺疾病 / 全真一气汤 / 炎症反应 / 氧化应激 / Cav-1 / Nrf2

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是以慢性咳嗽、咳痰、呼吸困难和不完全可逆性气流受限等为特征的呼吸系统疾病^［1］。COPD已成为我国重大公共卫生问题之一，统计表明全球30～79岁人群中COPD的患病率为10.3%，约3.9亿人^［2］；我国20岁及以上人群的COPD患病总数已达1亿多人^［3］。气道、肺实质和肺血管的慢性炎症及氧化应激损伤是COPD的主要发病机制之一。由于接触香烟烟雾（CS）等有害气体所吸入的氧化剂使机体内氧自由基大量堆积，氧化还原平衡失调，进入氧化应激状态，同时激活相关炎症因子表达，加剧了肺组织异常慢性炎症反应，在双重作用下进一步加剧细胞凋亡和肺组织损伤。前期临床研究发现：经全真一气汤干预的COPD患者，其肺功能、临床症状及体征均得到显著改善^［4］，但具体作用机制尚不明确。本研究拟构建COPD大鼠模型，研究全真一气汤对COPD大鼠抗氧化应激及炎症的功效和机制。

1 实验材料

1.1 实验动物

24只2月龄健康雄性SD大鼠，体质量（200±5）g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SXCK（京）2019-0010。饲养于福建中医药大学动物实验中心，实验动物使用许可证号：SYXK（闽）2019-007），饲养温度25 ℃，相对湿度40%～70%。

1.2 实验药物

全真一气汤药物组成：生晒参15 g，麦冬15 g，熟地黄15 g，淡附子6 g，白术6 g，牛膝15 g，五味子6 g，由福建中医药大学附属第二人民医院中药房提供药材并煎煮，将中药液浓缩至生药浓度为0.5 g/mL；氨茶碱注射液（生产批号：1702061）购自天津金耀药业有限公司，配置为6 mg/mL的氨茶碱溶液，置于4 ℃冰箱保存备用。七匹狼牌香烟（批号：6901028141130，每支香烟焦油量8 mg、烟气烟碱量0.8 mg、烟气一氧化碳量9 mg）购自福建中烟工业有限责任公司。

1.3 实验试剂

大鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）ELISA试剂盒（货号：EK0526）、大鼠白细胞介素-6（IL-6）ELISA试剂盒（货号：EK0412）、增强型RIPA裂解液（货号：AR0102）、蛋白酶抑制剂（货号：AR1178）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（货号：AR0146）、核因子E2相关因子2（Nrf2）抗体（货号：16396-1-AP）、小窝蛋白-1（Cav-1）抗体（货号：M00179-1）、GAPDH抗体（货号：60004-1-Ig）均购自武汉博士德生物技术公司；特超敏化学发光检测试剂盒（苏州优逸兰迪生物科技有限公司，货号：S6010L）。

1.4 实验仪器

恒温振荡器（上海一恒科学仪器有限公司，型号：THZ-98C）；酶联免疫分析仪（杭州奥盛仪器有限公司，型号：AMR-100）；超微量紫外可见分光光度计（杭州米欧仪器有限公司，型号：ND-100c）；冷冻离心机（广州吉迪仪器有限公司，型号：JID-17R）。

2 实验方法

2.1 分组、造模及干预

采用随机数字表法将24只大鼠分为空白组、模型组、中药组和西药组，每组6只。所有大鼠均以常规动物饲料及清洁水源饲养。模型组、中药组和西药组置于120 cm×80 cm×80 cm的自制烟熏箱中，每日予香烟烟雾熏吸15～30 min，每次使用30支香烟，每周5次，连续造模9周，以大鼠外观行为及组织病理学作为评价COPD模型是否成功的依据^［5］。造模成功后中药组按生药量40.86 g/（kg·d）予全真一气汤药液灌胃，西药组按3.23 g/（kg·d）予氨茶碱溶液灌胃，空白组和模型组按3 mL/（kg·d）予生理盐水灌胃，每日1次，连续干预3周。

2.2 取材

干预结束后按1 g/kg予20％乌拉坦腹腔注射麻醉，麻醉后沿腹面正中线剪开腹腔，心脏取血2 mL，用于ELISA实验；迅速留取全肺标本，置于4%多聚甲醛溶液中固定，用于后续HE染色、免疫组化和Westen blot实验。

2.3 HE染色法观察大鼠肺组织病理变化

将大鼠肺组织经4%多聚甲醛溶液固定24 h，然后进行石蜡包埋、切片、染色等常规操作，置于光学显微镜下观察组织大体的外观改变及炎性细胞浸润情况。

2.4 ELISA检测大鼠血清IL-6、TNF-α含量

大鼠心脏取血2 mL，经4 000 r/min离心8 min后，取上清，按照IL-6、TNF-α ELISA试剂盒操作说明书进行操作，检测IL-6、TNF-α含量。

2.5 免疫组化法检测大鼠肺组织Cav-1蛋白表达

将固定后的大鼠肺组织常规石蜡包埋、切片，按照Cav-1免疫组化检测试剂盒说明书进行染色。染色封片后置于200倍电镜下观察，选取5点/片，用Image Pro Plus 6.0图像分析软件测定Cav-1的平均光密度值。

2.6 Westen blot检测大鼠肺组织Nrf2蛋白表达量

取出大鼠肺组织，加入RIPA裂解液进行匀浆并裂解蛋白，用BCA试剂盒检测蛋白浓度并稀释蛋白样本，冷冻保存备用。制备分离胶和浓缩胶，取蛋白样本进行上样、电泳、转膜，并用5%脱脂奶粉封闭，置于Nrf2（1∶4 000）、GAPDH（1∶20 000）抗体中4 ℃孵育过夜；次日经TBST溶液洗涤后，二抗（1∶5 000）室温孵育1.5 h，洗涤后加入显影剂曝光显影。采用ImageJ图像分析软件测定条带灰度值，并计算蛋白表达量。

2.7 统计学方法

采用SPSS 26.0软件进行数据分析。计量资料符合正态分布以（\overline{x}±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，若方差齐两两比较采用LSD-t检验，若方差不齐则采用Games-Howell检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结　果

3.1 4组大鼠一般情况

空白组大鼠神志清醒，行动灵活，食欲正常，皮毛光亮，呼吸均匀，呼吸道内未见明显分泌物；模型组大鼠精神不振、食欲减退、毛发暗淡、呼吸道分泌物增多、气短、便溏等；与模型组比较，中药组及西药组大鼠临床症状及体征均有一定程度的改善。

3.2 4组肺组织HE染色病理变化情况

空白组肺泡结构基本正常，支气管壁无增厚，无炎症细胞浸润；模型组肺泡结构被破坏，大量炎症细胞浸润及渗出，支气管管壁增厚，管腔变形狭窄；中药组和西药组肺组织整体情况较模型组改善，可见少量炎症细胞渗出浸润，支气管管腔稍变形，管壁轻微增厚。见图1。

3.3 4组血清IL-6、TNF-α含量比较

与空白组比较，模型组血清IL-6、TNF-α含量均明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，中药组和西药组血清IL-6、TNF-α含量均明显降低（P＜0.05）。见表1。

3.4 4组肺组织Cav-1蛋白表达比较

与空白组比较，模型组Cav-1平均光密度值明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，中药组和西药组Cav-1平均光密度值明显升高（P＜0.05）。见图2、图3。

3.5 4组大鼠肺组织Nrf2蛋白表达量比较

与空白组比较，模型组Nrf2蛋白表达量明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，中药组和西药组Nrf2蛋白表达量均明显升高（P＜0.05）；与西药组比较，中药组Nrf2蛋白表达量明显升高（P＜0.05）。见图4、图5。

4 讨　论

根据咳嗽、咳痰、气短的临床表现可将COPD归属于中医学“喘证”“肺胀”等范畴，《灵枢·胀论》曰：“肺胀者，虚满而喘咳。”《临证指南医案·喘》载：“喘症之因，在肺为实，在肾为虚。”《类证制裁》曰：“肺为气之主，肾为气之根。”认为COPD病位在肺、肾二脏，病性属本虚标实。五脏经脉循行中，唯肾足少阴之脉与肺手太阴之脉相连，二者如水天之气互交^［6］，故COPD的治疗应围绕肺、肾二脏展开。明代医家冯兆张所创载于《冯氏锦囊秘录》的全真一气汤，兼具补肾调肺之功，方中熟地黄滋肾水补真阴；淡附子壮肾阳；生晒参大补元气；麦冬保心润肺；五味子敛肺滋肾；牛膝益肝肾；白术补益中气、健脾祛湿，诸药合用，三焦同调，以达益肺补肾之效。

接触CS是造成COPD发病的主要危险因素之一。本研究通过香烟烟雾熏吸法建立COPD大鼠模型，造模后大鼠肺组织病理见肺泡壁增厚破裂，肺泡形态不规则，气管壁增厚，大量炎性细胞浸润及渗出，结合大鼠出现呼吸道分泌物增多、咳嗽、气短、胸廓运动次数增加等症状，可判定COPD大鼠模型建立成功^［5］，同时炎性因子IL-6、TNF-α含量明显升高，符合COPD炎症反应特征^［7］，进一步证实COPD模型构建成功。

慢性炎症是COPD发生、发展的核心机制，过度的炎症反应造成肺泡附着物破坏、黏液分泌过多、气道重塑等一系列的病理变化。因此，治疗COPD的关键之一在于减轻肺部炎症反应。细胞质膜中的内陷小窝，具有介导内吞、调节信号转导、脂质代谢等多种功能^［8］。Cav-1作为小窝的主要功能蛋白，在调节炎症反应、减轻细菌负荷及抑制胸腺细胞凋亡等方面发挥重要作用。研究发现，Cav-1能够下调促炎信号的传导，抑制IL-6、TNF-α等促炎性细胞因子的产生^［9-11］，有助于延缓COPD患者的气管重塑及血管内皮损伤^［12］。本研究结果显示：经全真一气汤及氨茶碱干预的COPD大鼠，其病理染色图片提示肺组织炎症细胞浸润较COPD模型组改善，TNF-α、IL-6水平明显下降，Cav-1水平明显升高，提示全真一气汤可改善COPD大鼠肺组织炎症反应，其机制可能与上调COPD大鼠Cav-1水平，抑制炎性因子IL-6及TNF-α的释放有关。

氧化应激也是COPD的主要发病机制之一。氧化应激与炎症反应密切相关，局部或全身持续的炎症反应都会导致机体发生氧化应激，而氧化应激所产生的过量氧自由基对气道黏膜及软组织造成进一步损伤，加重COPD患者的气流受限程度^［13］。肺进行气体交换时与空气中的有毒物质接触，其中的氧化剂会导致肺中氧化产物水平升高，破坏氧化/抗氧化平衡，致肺组织产生氧化应激损伤^［14］。研究显示：Nrf2在调节COPD的氧化应激方面占据重要地位，Nrf2/抗氧化反应元件信号（ARE）是调控人体氧化还原平衡的关键通路，Nrf2作为细胞抗氧化应激反应主要的调节因子，通过易位至细胞核与ARE相结合，启动下游抗氧化酶表达，发挥抗氧化作用^［15］。研究表明，当Nrf2基因被敲除或其表达水平降低时，细胞内的活性氧（ROS）水平显著增加^［16］。此外，激活Nrf2/ARE信号通路能够减轻由CS引起的肺巨噬细胞吞噬功能下降，并发挥抗氧化应激的保护效果^［17］。本研究结果显示：与模型组比较，全真一气汤提高COPD大鼠的Nrf2水平，起到了抗氧化的作用。

本研究选取的阳性对照药物氨茶碱是目前广泛应用COPD的药物，具有减轻COPD大鼠炎性反应、改善氧化-抗氧化失衡的作用^［18］。本研究结果显示：氨茶碱灌胃后COPD大鼠IL-6、TNF-α水平下降，Cav-1表达水平升高，与中药组比较差异无统计学意义，这说明二者改善炎症的作用效果相当，且与激活Cav-1信号通路有关。而中药组Nrf2水平较氨茶碱组明显升高，表明全真一气汤在改善氧化应激方面具有独特作用，但全真一气汤具体通过何种途径激活Nrf2发挥抗氧化作用还有待进一步后续研究。

综上所述，全真一气汤通过上调Cav-1以及Nrf2水平改善COPD大鼠肺组织结构，达到减轻炎症反应、抵抗氧化应激损伤的目的。

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基金资助

福建省卫生健康委员会中医药科研项目(2021ZYJC16)