不同产地莲子心HPLC指纹图谱建立及6个黄酮成分含量测定

摘要

目的 建立莲子心HPLC指纹图谱，并测定6个黄酮成分的含量，结合聚类分析和主成分分析综合评价不同产地莲子心质量。 方法 采用Ultimate XB-C₁₈色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；检测波长：350 nm。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”建立指纹图谱，用对照品指认部分共有峰，采用SPSS 18.0软件进行聚类分析和主成分分析。采用HPLC法同时测定莲子心6个黄酮成分含量。 结果 建立了10批不同产地莲子心HPLC指纹图谱，提取了14个共有峰，指认了6个共有峰（夏佛塔苷、异荭草苷、荭草苷、异夏佛塔苷、牡荆素、芦丁），并测定了这6个成分含量；10批莲子心可聚为3类；提取了2个主成分，累积方差贡献率达到86.784%。夏佛塔苷、异荭草苷、荭草苷、异夏佛塔苷、牡荆素、芦丁的线性范围分别为0.160～3.200、0.017～0.340、0.014～0.280、0.040～0.800、0.010～0.200、0.024～0.480 μg，相关系数r＞0.999 5，精密度、重复性、稳定性均符合有关规定。10批样品中夏佛塔苷、异荭草苷、荭草苷、异夏佛塔苷、牡荆素、芦丁的含量范围分别为3.27～5.95、0.23～0.50、0.38～0.80、0.44～1.00、0.14～0.33、0.51～0.71 mg/g，平均加样回收率为98.58%～101.17%。 结论 本方法操作简便、准确可靠，为综合评价不同产地莲子心质量提供了实验依据。

Graphical abstract

关键词

莲子心 / 黄酮 / HPLC / 指纹图谱 / 聚类分析 / 主成分分析

莲子心为睡莲科植物莲Nelumbo nucifera Gaertn.成熟种子中的干燥幼叶及胚根，性寒味苦，归心、肾经，具清心安神、交通心肾、涩精止血之功效，用于热入心包、神昏谵语、心肾不交、失眠遗精、血热吐血的治疗^［1］。莲子心在全国各地均有分布，主产于湖南、湖北、福建、江西、浙江等地。莲子心重要活性成分包括生物碱和黄酮两大类。莲子心生物碱成分包含莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱等，《中华人民共和国药典》曾以莲心碱为质控成分，2020年后改为甲基莲心碱，莲子心指纹图谱和含量测定的研究也仅聚焦于生物碱成分^［2-4］。莲子心黄酮成分具有抗氧化^［5］、降血糖^［6］、抑菌^［7］、抗敏^［8］等生物活性，而以莲子心黄酮成分作为质量评价的研究较少。例如夏佛塔苷具有抑制高脂饮食诱导的胆固醇结石^［9］以及保护非酒精性脂肪肝^［10］的作用；牡荆素可改善血液循环，降低胆固醇，并具有抗心肌梗死、抗菌、抗肿瘤等药理作用^［11］。因此，本研究针对黄酮类成分建立莲子心药材HPLC指纹图谱和含量测定方法，并进行聚类分析和主成分分析，旨在为综合评价不同产地莲子心质量提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪（G7167B四元泵，G7167自动进样器，G1316A柱温箱，G1315D二极管阵列检测器，Chemstation工作站），色谱柱为Ultimate XB-C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm）；MS105DU十万分之一电子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；KQ-500DE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；PALL Cascada超纯水机（美国PALL公司）。

1.2 试药

对照品夏佛塔苷（批号：51938-32-0，纯度≥98%）、异夏佛塔苷（批号：52012-29-0，纯度≥98%）、牡荆素（批号：3681-93-4，纯度≥98%）均购自成都埃法生物科技有限公司；异荭草苷（批号：MUST-18020610，纯度≥98%）、荭草苷（批号：MUST-17052203，纯度≥98%）均购自中国科学院成都生物研究所；芦丁（中国食品药品检定研究院，批号：10080-202207，纯度≥98%）。乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。莲子心样品采自全国各主产地，编号分别为S1（浙江）、S2（四川）、S3（河北）、S4（广东）、S5（安徽）、S6（广西）、S7（福建）、S8（湖北）、S9（湖南）、S10（江西），均经福建中医药大学黄泽豪教授鉴定为睡莲科植物莲Nelumbo nucifera Gaertn.成熟种子中的干燥幼叶及胚根。

2 方法与结果

2.1 混合对照品溶液制备

精密称取夏佛塔苷、异荭草苷、荭草苷、异夏佛塔苷、牡荆素、芦丁对照品适量，分别置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成质量浓度约为1 mg/mL单一对照品溶液；再精密吸取上述各单一对照品溶液适量，加流动相稀释，配制成质量浓度分别为17、14、40、10、24、10 μg/mL混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液制备

取莲子心粉末（过四号筛）1.0 g，精密称定，置于100 mL具塞锥形瓶中，精密加入30%乙醇50 mL，密塞，称定重量，浸泡30 min，功率250 W、频率40 kHz下超声30 min，取出，放冷，再次称定重量，用30%乙醇补足减失的重量，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3 色谱条件

Ultimate XB-C₁₈色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）；梯度洗脱（0～20 min，14%A；20～30 min，14%A→16%A；30～45 min，16%A→40%A）；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；检测波长：350 nm。

2.4 指纹图谱的建立及化学模式识别分析

2.4.1 专属性试验

分别取“2.1”项下混合对照品溶液和“2.2”项下供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样测定，记录HPLC图，见图1。

2.4.2 精密度试验

取同一供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件，连续进样6 次，记录各共有峰的保留时间和峰面积，以峰面积较大且相对稳定的夏佛塔苷（1号峰）为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间RSD＜0.42%，相对峰面积RSD≤1.50%，表明该仪器的精密度良好。

2.4.3 稳定性试验

取同一供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件，分别于0、2、4、8、12、24 h进样，记录各共有峰的保留时间和峰面积，以夏佛塔苷（1号峰）为参照峰（S），计算各共有峰的相对保留时间RSD＜0.65%，相对峰面积RSD≤2.16%，表明供试品溶液在24 h 内保持稳定。

2.4.4 重复性试验

取同一批莲子心药材，按“2.2”项下方法制备6份供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进行测定，记录各共有峰的保留时间和峰面积，以夏佛塔苷（1号峰）为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间RSD＜0.82%，相对峰面积RSD≤2.91%，表明该检测方法重复性良好。

2.4.5 指纹图谱建立和相似度评价

取10批来自不同产地莲子心药材，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进行分析，记录各产地莲子心HPLC色谱图，依次导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”，以色谱图S1为参照图谱，采用中位数法，时间窗为0.1 min，系统自动标定了14个共有峰，经多点校正、Mark峰匹配后，生成莲子心HPLC指纹图谱和对照图谱（R），见图2，计算相似度为0.997～1.000，见表1。14个共有峰的峰面积RSD为8.47%～36.06%，说明不同产地莲子心黄酮成分的种类虽然相似，但含量相差甚大。

2.4.6 部分共有峰的指认

为进一步指认共有峰成分，经与对照品比对，根据峰的保留时间和紫外吸收光谱图，确定指纹图谱中的5、6、7、8、9、10号色谱峰分别为夏佛塔苷、异荭草苷、荭草苷、异夏佛塔苷、牡荆素、芦丁。见图3。

2.4.7 聚类分析

将10批不同产地莲子心药材HPLC指纹图谱的14个共有峰峰面积作为变量，导入SPSS 18.0软件，采用组间联接法，以平方欧氏距离为度量标准进行系统聚类分析。结果表明：平方欧氏距离为5时，10批莲子心样品可聚为3类：河北（S3）独自聚为第一类；福建（S7）和湖南（S9）聚为第二类；其他7个产地聚为第三类。因此，莲子心产地的聚类分析结果与地理位置无明显相关性，见图4。

2.4.8 主成分分析

利用SPSS 18.0软件对10批莲子心指纹图谱所得到的14个共有峰进行主成分因子分析，以特征值＞1为提取标准，共得到2个主成分，累积方差贡献率达86.784%，提示这2个主成分可代表莲子心指纹图谱中14个共有峰，见表2。主成分载荷矩阵是原始变量与主成分之间的相关系数，反映了各峰对主成分的贡献程度，除峰13外，其余各峰均与主成分1呈正相关，其中以峰5、4、6、2、9、7、11对其贡献较大；峰1、3、6、8、11、13、14与主成分2呈正相关，其中以峰13、14、3对其贡献较大，见表3。以主成分分析法对莲子心药材进行综合评价，通过成分得分系数矩阵，按方差贡献率加权计算各主成分得分及综合得分，结果显示综合得分排名前3依次为江西（S10）、湖南（S9）、广东（S4），见表4。

2.5 HPLC法同时测定莲子心中6个黄酮成分

2.5.1 专属性试验

分别取“2.1”项下混合对照品溶液和“2.2”项下供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样测定，记录HPLC图，见图1。

2.5.2 线性关系考察

精密吸取“2.1”项下混合对照品溶液1、5、10、15、20 μL进样，按“2.3”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以进样质量（μg）为横坐标X，峰面积（A）为纵坐标Y，进行线性回归，见表5。

2.5.3 精密度试验

取“2.1”项下混合对照品溶液，按“2.3”项下色谱条件测定，连续进样6次，测定峰面积，计算夏佛塔苷、异荭草苷、荭草苷、异夏佛塔苷、牡荆素、芦丁峰面积的RSD分别为0.87%、1.21%、1.36%、1.13%、0.57%、0.92%，表明仪器的精密度良好。

2.5.4 稳定性试验

取湖南（S9）样品粉末按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.3”项下色谱条件分别于0、2、4、6、8、10 h进样分析，测定夏佛塔苷、异荭草苷、荭草苷、异夏佛塔苷、牡荆素、芦丁的峰面积，结果RSD分别为2.33%、1.86%、2.11%、1.72%、1.50%、1.28%，表明供试品溶液在10 h内稳定。

2.5.5 重复性试验

取湖南（S9）样品粉末6份，每份1.0 g，精密称定，按“2.2”项下方法制备6份供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样分析，结果样品中夏佛塔苷、异荭草苷、荭草苷、异夏佛塔苷、牡荆素、芦丁的平均含量分别为5.958、0.510、0.796、0.895、0.333、0.698 mg/g，RSD分别为1.86%、1.60%、1.49%、1.52%、1.25%、1.37%，表明该方法的重复性良好。

2.5.6 回收率试验

取已知含量的湖南（S9）莲子心样品粗粉9份，每份0.5 g，精密称定，分别加入相当于药材含量80%、100%和120%的夏佛塔苷、异荭草苷、荭草苷、异夏佛塔苷、牡荆素、芦丁对照品，按“2.2”项下方法制备9份供试品溶液，按“2.3”项下条件进样分析，夏佛塔苷、异荭草苷、荭草苷、异夏佛塔苷、牡荆素、芦丁的平均回收率分别为98.83%、99.61%、101.17%、100.30%、99.36%、98.58%，RSD分别为1.76%、1.31%、2.42%、1.24%、1.73%、2.31%，见表6。

2.5.7 含量测定

按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件，对10批药材进行含量测定，每个批次平行取样3份。结果显示：10批样品中夏佛塔苷、异荭草苷、荭草苷、异夏佛塔苷、牡荆素、芦丁的含量范围分别为3.27～5.95、0.23～0.50、0.38～0.80、0.44～1.00、0.14～0.33、0.51～0.71 mg/g。见表7。

3 讨　论

本研究比较了回流提取和超声提取2种方法，考察了甲醇、水和10%、30%、50%、70%、100%乙醇共7种提取溶剂，10∶1、25∶1和50∶1这3种液料比，20、30、40 min这3种提取时间。结果表明，以50倍30%乙醇溶液超声提取30 min，6个黄酮成分的提取效率较高，整体峰形和分离度较好。故供试品溶液制备方法确定为：取1.0 g莲子心粉末，加入30%乙醇溶液50 mL，超声提取30 min。

本研究采用二极管阵列检测器，记录每个峰在200～400 nm范围内的光谱图，通过2D和3D图谱分析发现，绝大部分峰在210、270、350 nm处均有吸收峰，但210、270 nm下的峰形因有杂质峰干扰，不如350 nm的峰形好，故选择350 nm为检测波长。流动相选择乙腈-0.1%磷酸水溶液，优化梯度洗脱程序，使目标峰尽可能达到最佳分离效果。

本研究针对莲子心黄酮类成分建立的HPLC指纹图谱，相似度为0.997～1.000，说明莲子心黄酮成分具有相似性；而14个共有峰的峰面积RSD为8.47%～36.06%，表明各产地黄酮成分的含量差异较大。因此，对共有峰中已指认的6个黄酮成分进一步测定了含量，并以6个成分含量之和作为黄酮总含量。其中，夏佛塔苷含量最高，接近总含量的2/3。以6个黄酮成分总含量高低分成3类：第一类含量最低（5 mg/g）只有河北，第二类含量＞9 mg/g有湖南和福建，其余7个产地归为第三类，这与聚类分析结果刚好吻合。另外，主成分分析通过降维的方法，从指纹图谱14个共有峰中提取了2个主成分，载荷代表了各峰对主成分的贡献度，各产地的综合得分排名代表了莲子心品质优劣，这与6个黄酮成分总含量高低不完全一致，可能还与生物碱成分有关。

参考文献

[1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典：一部［M］. 北京：中国医药科技出版社，2020：285-286.

[2] 王珊，时伟朋，田文月，等. 莲子心HPLC指纹图谱研究及不同产地生物碱含量测定［J］. 中华中医药学刊，2018，36（6）：1454-1457.

[3] 王协和，顾超，周雁玲，等. 基于指纹图谱及一测多评法的莲子心质量评价研究［J］. 中药材，2020，43（10）：2493-2498.

[4] 曾建伟，褚剑峰，李西海，等. 莲子心的HPLC指纹图谱研究［J］. 实用中西医结合临床，2017，17（3）：155-157.

[5] 刘坤，黄智霖，陈鸿庚，等. 莲子心中黄酮苷类化合物分离鉴定及其抗氧化活性研究［J］. 中华中医药学刊，2023，41（2）：97-100，265.

[6] 李秋哲. 莲子心黄酮结构分析及其降血糖活性研究［D］. 福州：福建农林大学，2015：98.

[7] 吴梅青. 莲子心黄酮提取测定及其抗氧化和抑菌活性进展［J］. 医药导报，2015，34（7）：919-922.

[8] 郝晴，吴二敏，毕永贤，等. 莲子心总黄酮多元醇提取工艺筛选及其性能研究［J］. 日用化学工业（中英文），2023，53（4）：398-407.

[9] 刘美静，刘昌辉，黄小桃，等. 夏佛塔苷对高脂饮食诱导C57BL/6小鼠胆固醇结石形成的抑制作用［J］. 中药新药与临床药理，2016，27（4）：497-502.

[10] 刘美静，张郭慧，黄小桃，等. 夏佛塔苷对高脂饮食诱导小鼠非酒精性脂肪肝的保护作用［J］. 中华中医药杂志，2017，32（11）：5078-5081.

[11] 盛亚男，王长远. 牡荆素预防和治疗疾病作用机制研究进展［J］. 中国现代应用药学，2021，38（17）：2156-2161.

基金资助

福建省高校产学合作项目(2024Y4009)

国家自然科学基金项目(82374359)

福建省自然科学基金项目(2022 J01879)