南方红豆杉果实的毒理学安全性评价

Toxicological Safety Evaluation of Fruits of Taxus Wallichiana Zucc

摘要

目的 采用南方红豆杉果实（TCF）提取物对小鼠进行急性毒性试验，评价TCF的安全性。 方法 选取雌性、雄性C57BL/6小鼠各20只，根据性别随机分为正常组和TCF组。TCF组按生药量6 g/（kg·d）给予TCF提取物溶液灌胃，正常组按照10 mL/（kg·d）给予生理盐水灌胃，连续给药14 d。观察和记录小鼠行为、精神状态以及死亡情况，每周称重1次。解剖并观察各脏器情况并进行称重，并计算肝脏、脾脏、肾脏、脑指数；检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、尿素氮（BUN）、肌酐（CREA）、葡萄糖（GLU）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）含量；HE染色观察肝、心、肾、大肠、小肠组织病理形态变化。 结果 灌胃期间各组小鼠生长发育良好，未出现明显异常行为和中毒症状，未出现死亡。2组不同性别小鼠干预前和干预7、14 d体质量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；2组不同性别小鼠肝脏、脾脏、肾脏、脑指数比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。2组不同性别小鼠血清ALT、AST、TP、ALB、BUN、CREA、GLU、TG、TC、HDL、LDL 含量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。HE染色结果显示：2组小鼠肝脏、肾脏、心脏、大肠、小肠组织形态完整，结构清晰，未发现明显病理变化。 结论 TCF在6 g/（kg·d）剂量下，未观察到明显的毒副作用，表明其具有良好的安全性。

Abstract

Objective To evaluate the safety of Taxus wallichiana Zucc fruit (TCF) extract by acute toxicity test in mice. Methods A total of twenty female and twenty male C57BL/6 mice were randomly divided into normal group and TCF group based on gender. The TCF group was given TCF extract solution by gavage at a dose of 6 g/(kg·d), while the normal group was given physiological saline solution by gavage at a dose of 10 mL/(kg·d) for 14 consecutive days. The growth, development and mortality of mice were observed and recorded, and weighed once a week. The organs were dissected and weighed, and the indexes of liver, spleen, kidney and brain were calculated. Serum alanine transaminase (ALT), aspartate transaminase (AST), total protein (TP), albumin (ALB), blood urea nitrogen (BUN), creatinine (CREA), glucose (GLU), high density lipoprotein (HDL), low density lipoprotein (LDL), triglyceride (TG) and total cholesterol (TC) were detected; HE staining was used to observe the pathological changes in liver, heart, kidney, large intestine, and small intestine. Results During the period of gavage, the mice in each group grew and developed well without obvious abnormal behavior, poisoning symptoms, and death. There was no significant difference in body weight of different genders between the two groups before intervention and on the 7th and 14th day of intervention (P>0.05). There were no significant differences in the indexes of liver, spleen, kidney and brain between the two groups of different genders (P>0.05). HE staining showed that the liver, kidney, heart, large intestine, and small intestine tissues of the two groups were intact and structurally clear, and no obvious pathological changes were found. Conclusion At a dose of 6 g/(kg·d), no significant toxic side effects were observed with TCF, indicating its good safety.

Graphical abstract

关键词

红豆杉果实 / 毒理学 / 安全性评价

Key words

fruits of Taxus wallichiana Zucc / toxicology / safety evaluation

南方红豆杉（Taxus wallichiana Zucc. var. mairei）是国家一级保护树木，拥有极高的药用价值。《本草纲目》和《现代中药大辞典》记载红豆杉具有杀虫、消肿散结、通经利尿的功效，可治疗霍乱、伤寒等疾病。现代研究表明：红豆杉含有紫杉醇，具有抗肿瘤活性，可抑制癌细胞生长，广泛应用于乳腺癌、卵巢癌、肺癌等治疗^［1-3］。此外，红豆杉能增强免疫应答，抑制炎症反应，并通过抗氧化作用减少自由基产生，减轻氧化应激损伤^［4-6］。目前红豆杉的研究部位主要侧重在树皮、树枝和树叶，对于红豆杉果实研究相对较少。红豆杉果实（Taxus chinensis fruit，TCF）是红豆杉的重要产物之一，含有紫杉醇、多糖、氨基酸等活性成分，体外酶抑制实验初步证实其乙醇提取物具有抗氧化、清除自由基和降血糖的作用^［7-8］。课题组前期研究表明TCF提取物具有抗抑郁、抗炎等作用，但对其毒副作用尚未了解透彻^［9］。本实验旨在通过急性毒性试验，观察TCF对受试动物的毒性反应，评价其安全性，为今后TCF药物以及保健食品开发进一步提供科学依据。

1 实验材料

1.1 实验动物

SPF级雌性、雄性C57BL/6各20只，体质量（20±2）g，购自上海斯莱克动物有限责任公司，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2017-0005。饲养于福建中医药大学动物实验中心SPF级动物实验室，实验动物使用许可证号：SYXK（闽）2019-007，饲养环境湿度40%～60%，温度（22±2）℃，12 h明暗交替。本实验已通过福建中医药大学动物伦理委员会审批（3W2022054）。

1.2 实验药物

TCF提取物由福建中医药大学药学院实验室制备，取200 g TCF，加入2 L 85%乙醇，混合后超声处理60 min，进行3次提取，将所有提取液合并，通过抽滤后离心的方式分离出上清液。采用减压浓缩法将上清液浓缩，然后进行冷冻干燥，最终得到TCF提取物。溶解于蒸馏水，4 ℃保存。

1.3 实验试剂

丙氨酸转氨酶（ALT，批号：S03030）、天冬氨酸转氨酶（AST，批号：S03040）、总蛋白（TP，批号：S03022）、白蛋白（ALB，批号：S03043）、高密度脂蛋白（HDL，批号：S03027）、低密度脂蛋白（LDL，批号：S03042）、甘油三酯（TG，批号：S03025）、总胆固醇（TC，批号：S03029）、尿素氮（BUN，批号：S03038）、肌酐（CREA，批号：S03076）、葡萄糖（GLU，批号：S03039）测定试剂盒均购自深圳雷杜生命科技有限公司；苏木素伊红染色液（批号：J06HR183515）、Scott蓝化液（批号：A04HR190452）、酸性乙醇分化液（批号：M02IR15022A）均购自上海源叶生物科技有限公司。

1.4 实验仪器

全自动生化分析仪（深圳雷杜生命科技有限公司，型号：Chemray 240、Chemray 420、Chemray 800）；台式高速冷冻离心机（北京大龙兴创实验仪器有限公司，型号：D3024R）；正置荧光显微镜（德国Carl Zeiss公司）。

2 实验方法

2.1 急性毒性实验

选取雌性、雄性C57BL/6小鼠各20只，试喂养1周后，分别随机分为正常组和TCF组，依据《急性经口毒性试验》最大效应限量法，TCF组按生药量6 g/（kg·d）给予TCF提取物溶液灌胃，正常组按照10 mL/（kg·d）给予生理盐水灌胃，连续给药14 d。

2.2 取材

取材前禁食不禁水8 h，于干预第15日上午取材。对小鼠进行称重后，采用摘除小鼠眼球法进行取血，4 ℃下3 000 r/min离心10 min，分离血清用于生化检测。经5%异氟醚吸入麻醉后处死。解剖检查小鼠的各脏器有无异常，分别取小鼠肝脏、肾脏、心脏、大肠、小肠组织，称重后置于4%多聚甲醛中固定，用于HE染色。

2.3 观察指标

2.3.1 一般情况

每天观察记录小鼠的行为、精神状态和死亡情况，每周测量小鼠的体质量，并计算肝脏、脾脏、肾脏、脑指数。

脏器指数＝脏器湿质量/小鼠体质量×100%

2.3.2 生化检测

根据试剂盒说明书进行工作试剂配制，应用全自动生化仪检测血清ALT、AST、TP、ALB、BUN、CREA、GLU、TG、TC、HDL、LDL含量。

2.3.3 HE染色观察组织病理形态学

将肝脏、肾脏、心脏、大肠、小肠组织在4%多聚甲醛中固定24 h，冲水6 h，进行梯度脱水，在二甲苯中透明45 min，浸蜡1 h，进行包埋、切片及捞片。将切片置于二甲苯中各15 min进行脱蜡，水化5 min，放入苏木素中染3 min，分化1～3 s，返蓝50 s，再染伊红40～50 s，置于二甲苯中2 min，滴加中性树脂封片，晾干后显微镜下观察。

2.4 统计学方法

采用SPSS 26.0软件对数据进行分析。计量资料符合正态分布以（\overline{x}±s）表示，组间比较采用两独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结　果

3.1 一般情况

灌胃期间各组小鼠生长发育良好，未出现明显异常行为和中毒症状，未出现死亡。

3.2 2组不同性别小鼠体质量比较

2组不同性别小鼠干预前和干预7、14 d体质量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

3.3 2组不同性别小鼠脏器指数比较

2组不同性别小鼠肝脏、脾脏、肾脏、脑指数比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

3.4 2组不同性别小鼠血清生化指标比较

2组不同性别小鼠血清ALT、AST、TP、ALB、BUN、CREA、GLU、TG、TC、HDL、LDL含量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

3.5 2组不同性别小鼠各脏器组织病理形态学变化

2组小鼠解剖后肉眼观察，心、肺、脑、肝、脾、肾、大肠、小肠等脏器形状、大小、颜色均无明显异常改变。HE染色结果显示：2组小鼠肝脏、肾脏、心脏、大肠、小肠组织形态完整，结构清晰，未发现明显病理变化。肝脏组织肝细胞大小均匀，排列有序，细胞核呈椭圆形或圆形，未出现核偏移，胞质丰富，肝板和肝索结构完整，中央静脉和门静脉清晰可见，无明显病理改变，肝窦未见充血，未观察到炎症反应。肾脏组织肾小球结构完整，毛细血管清晰可见，肾小球周围分布着肾小管无肿胀和变性，肾间质无明显的炎症或纤维化病变。心脏组织心肌和心腔结构完整，无病理性改变。小肠黏膜层呈绒毛状，有整齐排列的绒毛丛，小肠腺体呈圆形或椭圆形，无炎症反应。大肠黏膜和腺体结构保持完整，无炎症反应或其他病变。见图1。

4 讨　论

红豆杉提取物的毒理学研究和药用研究已经得到广泛报道，但对于TCF的研究相对较少。本研究结果显示：在以TCF提取物最大给药量6 g/（kg·d）干预后，小鼠未出现异常症状或死亡，这表明在6 g/（kg·d）剂量内，TCF对小鼠无急性毒性作用。

研究结果显示：各组小鼠生长、发育良好，正常组和TCF组体质量、各脏器指数比较差异无统计学意义，肝功能、肾功能、血糖、血脂等指标比较差异无统计学意义。进一步观察了肝脏、肾脏、心脏、小肠和大肠的病理切片，结果显示与实验因素相关的病理组织学变化均未见。这表明在6 g/（kg·d）剂量内，TCF对小鼠肝脏和肾脏无明显影响。

综上所述，经过连续14 d以6 g/（kg·d）剂量给予小鼠TCF灌胃，对小鼠的影响处于正常范围之内。这一结果对TCF在药物研发和临床应用中提供实验基础，以及在食品和保健品领域的开发提供参考。然而，TCF应用于更高剂量或长期使用的情况下，仍需要进行更多的研究以确保其安全性和有效性，以满足不同用途和剂量的需求。

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基金资助

福建省省直属单位教育科研专项（X2022005-财政专项）

福建省自然科学基金项目(2022J01361)