基于TLR4/NF-κB通路探讨梅花入骨丹水提取物改善膝骨关节炎大鼠软骨基质代谢的作用机制

Mechanism of Bauhinia championii Aqueous Extract to Improve Cartilage Matrix Metabolism in Knee Osteoarthritis Rats Based on TLR4/NF-κB Signaling Pathway

摘要

目的 基于TLR4/NF-κB通路探讨梅花入骨丹水提取物（BCAE）改善膝骨关节炎（KOA）大鼠软骨基质代谢失衡的作用机制。 方法 将42只2月龄SPF级SD大鼠按随机数字表法分为空白组13只和造模组29只。造模组采用关节腔注射木瓜蛋白酶法建立大鼠右膝KOA模型，2组各随机抽取5只通过肉眼和光镜下观察软骨组织切片评分进行模型鉴定。模型鉴定成功后，再将造模组按随机数字表法分为模型组、BCAE组和扶他林组，每组8只。BCAE组按体质量每天1 mL/100 g灌胃0.09 g/mL梅花入骨丹水提取物，扶他林组按体质量每天1.0 mL/100 g灌胃0.675 mg/mL扶他林混悬液，空白组和模型组分别给予等剂量生理盐水灌胃，连续28 d。观察干预后4组大鼠一般情况及体质量、右膝关节直径、右下肢行走足迹及行走疼痛的变化情况。取大鼠膝关节软骨组织，HE染色后在光镜下观察软骨组织病理变化并进行改良Mankin's评分，Western blot检测软骨组织TLR4、MyD88、p-p65/p65、MMP-1、MMP-3、MMP-13、Col Ⅱ及Aggrecan蛋白表达量。 结果 与空白组比较，模型组大鼠出现体质量下降，行走疼痛，右膝关节肿胀，软骨退变，Mankin's评分显著增高（P＜0.05）；与模型组比较，BCAE组和扶他林组大鼠体质量增加，行走疼痛及右膝关节肿胀减轻，软骨退变程度较轻，Mankin's评分均明显降低（P＜0.05）。与空白组比较，模型组大鼠膝关节软骨TLR4、MyD88、p-p65/p65、MMP-1、MMP-3及MMP-13蛋白表达量明显增加，Col Ⅱ及Aggrecan蛋白表达量显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，BCAE组和扶他林组软骨TLR4、MyD88、p-p65/p65、MMP-1、MMP-3及MMP-13蛋白表达量明显降低，而Col Ⅱ及Aggrecan蛋白表达量显著增加（P＜0.05）。 结论 梅花入骨丹可抑制TLR4/NF-κB信号通路促进KOA大鼠软骨组织MMP-1、MMP-3、MMP-13的蛋白表达量，改善KOA大鼠软骨基质代谢失衡，减轻关节炎症反应，延缓软骨退变。

Abstract

Objective Based on TLR4/NF-κB pathway, to explore the mechanism of Bauhinia championii aqueous extract (BCAE) in improving the cartilage matrix metabolism in rats with knee osteoarthritis (KOA). Methods A total of 42 SPF level SD rats aged two months were randomly selected using random number table, with 13 rats in the blank group and the remaining 29 rats in the modeling group. The rat models of KOA were established by intra-articular injection of papain. Five rats were randomly selected from each of the two groups for model verification by visually inspecting and scoring cartilage tissue sections under optical microscope. After successful modeling, the modeling group was further divided into the model group, the BCAE group, and the Voltaren group using a random number table method, with 8 rats in each group. The BCAE group was gavaged daily with 0.09 g/mL Bauhinia championii herbal liquid at a dose of 1 mL/100 g of body weight. The Voltaren group was gavaged daily with 0.675 mg/mL Voltaren suspension at a dose of 1.0 mL/100 g of body weight. The blank group and the model group were gavaged with an equivalent volume of saline, respectively, for 28 consecutive days. The changes of general condition, body weight, diameter of the right knee joint, walking footprints of the right hind limb, and walking pain of the rats in the four groups were observed after the intervention. The cartilage tissues of the knee joints were cut to observe the pathological changes under the optical microscope and the modified Mankin's score were performed. Western blot analysis was used to detect the protein expression of TLR4, MyD88, p-P65/P65, MMP-1, MMP-3, MMP-13, Col II and Aggrescan in the cartilage. Results Compared with the blank group, rats in the model group showed decreased body mass, walking pain, swelling of the right knee joint, cartilage degeneration, and a significant increase in Mankin's score (P<0.05). Compared with the model group, rats in the BCAE group and Voltaren group showed an increase in body mass, a decrease in walking pain and swelling of the right knee joint, and a lesser degree of cartilage degeneration, and Mankin's scores were significantly lower (P<0.05). Compared with the blank group, the model group showed significantly increased protein expression of cartilage TLR4, MyD88, p-P65/P65, MMP-1, MMP-3 and MMP-13 in rat knee joints, while Col II and Aggrecan protein expression was significantly reduced (P<0.05). In contrast, the protein expressions of TLR4, MyD88, p-P65/P65, MMP-1, MMP-3 and MMP-13 were significantly lower in the BCAE group and the Voltaren group than that of the model group, while the expression of Col II and Aggrecan was higher than that of the model group (P<0.05). Conclusion Bauhinia championii aqueous extract can inhibit the TLR4/NF-κB signaling pathway, reducing the expression of MMP-1, MMP-3, and MMP-13 in the cartilage tissue of KOA rats, while increasing the expression levels of Col II and Aggrecan proteins, so as to improves the metabolic imbalance of cartilage matrix in KOA rats, alleviates joint inflammation, and delays cartilage degeneration.

Graphical abstract

关键词

膝骨关节炎 / 梅花入骨丹 / 软骨退变 / 基质代谢 / TLR4/NF-κB信号通路

Key words

knee osteoarthritis / Bauhinia championii aqueous extract / cartilage degeneration / matrix metabolism / TLR4/NF-κB signaling pathway

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是一种常见的以膝关节软骨退变降解为特征的中老年关节退行性疾病。相关研究表明，膝关节软骨组织中的细胞外基质的合成和降解失衡是引起关节软骨退变的重要原因之一。在一般条件下，关节软骨基质的生物合成和分解处于一种稳定的状态，但是在KOA的病理条件下，这一平衡被破坏，软骨基质的分解速率显著高于合成^［1-2］。KOA的软骨基质代谢是一个复杂且受多因素调节的过程，而炎症在引起软骨基质代谢紊乱过程中起着重要作用，是导致KOA发病的重要原因。在各种炎症因子的刺激下，关节软骨细胞表达分泌基质金属蛋白酶（matrixmetallo proteinases，MMPs）增加，引起软骨基质成分的降解，导致关节软骨基质代谢失平衡，最终引起KOA的发生和发展^［3-5］。Toll样受体4（toll-like receptor 4，TLR4）作为TLRs蛋白质家族中最重要的成员之一，可通过识别并结合脂多糖等相应配体，激活胞浆内的核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路，引起大量前炎因子、生长因子、黏附分子及多种MMP的表达和释放，是调节炎症反应及MMPs表达的重要通路，与KOA软骨基质代谢密切相关^［6-8］。

中医药治疗KOA具有疗效可靠、花费低廉、方式多样、不良反应少的独特优势，正日益引起国内外学者的兴趣和关注。梅花入骨丹又名龙须藤，为一种多年生藤本植物，属于豆科羊蹄甲属，主要分布在福建闽东南，还有江西、贵州、广东、广西、湖南、湖北等省，尤其在福建仙游、永泰山林地区资源丰富。其性平，味苦涩，无毒，具有祛风除湿、活血止痛、健脾理气等功效，可单味或与其他中药配伍使用，在福建闽东南长期用于治疗KOA，特别适用于早期风寒湿阻、气滞血瘀或痰湿阻络型KOA，疗效确切，是福建地区治疗KOA的特色药^［9-10］。然而目前关于梅花入骨丹治疗KOA的具体机制方面研究较少，课题组前期通过网络药理学分析梅花入骨丹的药效机制，表明梅花入骨丹治疗KOA的主要活性成分为黄酮类，涉及TLR4、NF-κB、MAPK及多种MMP等关键靶点^［11］。体外实验也表明梅花入骨丹水提取物（Bauhinia championii aqueous extract，BCAE）能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路，延缓IL-1β诱导的软骨细胞退变^［12］。

本研究拟进一步通过动物体内实验，观察梅花入骨丹对KOA模型大鼠膝关节软骨组织退变的改善作用，探讨BCAE对TLR4/NF-κB信号通路的调控作用及改善KOA软骨基质代谢、延缓软骨退变的机制，为临床推广使用梅花入骨丹治疗KOA提供实验依据。

1 实验材料

1.1 实验动物

2月龄SPF级SD大鼠42只，体质量为（280±10）g，购自于上海斯莱克实验动物有限责任公司［合格证号：SCXK（沪）2018-0006］。由福建医科大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK（闽）［2016-0002］。动物中心饲养条件：室温22~26 ℃，5只/笼饲养，给予自由饮水、标准饲料喂养，实验过程及方法均符合动物伦理要求（伦理审批号：FJMU IACUC 2020-0081）。

1.2 实验药物

梅花入骨丹由福建中医药大学附属人民医院中药房提供，产地为福建屏南县。经福建中医药大学附属人民医院中药房吴学辉主任中药师鉴定为豆科苏木亚科羊蹄甲属植物龙须藤的干燥藤茎。

1.3 主要试剂

木瓜蛋白酶（80万U/g）（货号：9001-73-4，北京索莱宝科技有限公司）；L-半胱氨酸（货号：52-90-4，上海源叶生物科技有限公司）；双氯酚酸钠缓释片（规格：75 mg/片）（货号：7250572CN-b，北京诺华制药有限公司）；多聚甲醛（货号：1001-0212，天津永大化学试剂有限公司）；免疫组化试剂盒（货号：SA1028，武汉博士德生物工程有限公司）；兔抗MMP-1（货号：10371-2-AP）、MMP-3（货号：17873-1-AP）、MMP-13（货号：18165-1-AP）、p-p65（货号：Ab76302）、p65（货号：Ab16502）抗体均购自美国Proteintech公司；兔抗ColⅡ（货号：Ab217274）、Aggrecan（货号：Ab3773）、TLR4（货号：Ab217274）、MyD88（货号：Ab219413）、GAPDH（货号：Ab8245）抗体均购自美国Abcam公司；羊抗兔二抗（货号：ZDR-5308，北京中杉金桥生物技术有限公司）；RIPA裂解液（货号：B100020）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（货号：Pt0001）及ECL显影液（货号：A38554）均购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.4 主要仪器

石蜡包埋机（湖北亚光医用电子技术有限公司）；蜡块切片机（德国Leica公司）；恒温干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；光学显微镜（德国Leica公司）；高速冷冻离心机（艾本德中国有限公司）；多功能酶标仪（瑞士TECAN公司）；基础电泳仪（美国Bio-Rad公司）；化学发光成像系统（美国Bio-Rad公司）。

2 实验方法

2.1 大鼠KOA模型的建立及鉴定

大鼠适应性饲养7 d后，采用随机数字表法随机抽取13只为空白组，其余29只为造模组。造模组采用关节腔注射法造模，分别在第1、4、7天在大鼠右膝关节腔内注射4%木瓜蛋白酶与0.03 mol/L L-半胱氨酸混合溶液，每次0.2 mL，空白组于相应时间点右膝关节腔注射等量生理盐水。造模日起，每天驱赶动物活动2次，每次20 min，制备大鼠KOA模型。空白组自由活动。造模后随机抽取5只造模组大鼠，判定造模情况，并与随机抽取的5只空白组比较。

2.2 BACE制备

将梅花入骨丹按照固液比1∶10加入水，煎煮3次，每次1.5 h，每次药液进行过滤去除药渣后再合并混匀，进行旋转蒸发，获得梅花入骨丹水提取物，将BCAE浓缩至含0.9 g/mL生药量后置于4 ℃冰箱存储备用。

2.3 分组、干预及取材

将剩余的24只造模组大鼠采用随机数字表法分为模型组、BCAE组和扶他林组，每组各8只。从造模成功后第14天起，灌胃给药。BCAE组及扶他林组根据人的药物常用口服剂量按等效剂量关系换算成大鼠的给药剂量^［13］，参照梅花入骨丹人的常用剂量为10 g，经换算BCAE组大鼠梅花入骨丹的用量为0.9^{g/kg，使用前将配制的梅花入骨丹浓缩液用生理盐水稀释成0.09 g/mL溶液，并按体质量1 mL/100 g灌胃；扶他林组大鼠给予双氯酚酸钠缓释片溶于生理盐水中配制成0.675 mg/mL混悬液，按体质量1 mL/100 g灌胃；空白组和模型组分别给予等剂量生理盐水1 mL/100 g灌胃。4组每天灌胃1次，连续28 d。取材：将大鼠麻醉后固定，逐层暴露大鼠右膝关节，刀片切取厚度3 mm×5 mm×5 mm股骨髁和胫骨平台全层软骨组织，将一部分软骨组织置于4%多聚甲醛内固定用于组织切片及HE染色，一部分置于-80 ℃冰箱中保存备用，用于组织蛋白检测。}

2.4 观察指标

2.4.1 一般情况

肉眼观察4组大鼠毛色、光泽度、饮食、活动等情况，分别在灌胃后第0、7、14、21、28天肉眼观察4组大鼠右膝关节形态，检测并记录大鼠体质量及右膝关节直径。

2.4.2 患肢行走足迹及行走疼痛计分

参照文献［14］的方法，将大鼠左右脚掌上均匀印上颜色深浅一致的印泥，并在铺有白纸的限定区域空间行走一段距离，此时如果大鼠患肢疼痛，为减轻患肢压力，左右脚着力不均，则表现为脚掌颜色深浅不一。于治疗后第28天拍下脚掌在纸上的印记，由2人独立就印记照片进行疼痛反应计分。计分规则：将脚掌分为4个区域，若左脚掌的1个区域颜色深于右脚掌，计1分；若有2个，计2分；依次累计，总分4分。

2.4.3 软骨组织形态变化

大鼠的软骨组织进行常规脱水、石蜡包埋切片，进行苏木素-伊红（HE）染色，二甲苯透明，中性树胶封片并于光镜下观察，就软骨组织结构、细胞数量、基质染色和潮线完整性，根据改良Mankin's法进行评分。

2.4.4 Western blot检测软骨TLR4/NF-κB通路相关蛋白表达量

按每20 mg软骨组织加200～400 μL的比例加入RIPA裂解液提取软骨组织蛋白，BCA蛋白定量法测定样本蛋白浓度；吸取20 μg蛋白样品上样，经电泳、转膜后室温封闭1 h，弃封闭液，4 ℃下分别与TLR4、MyD88、p-p65、MMP-1、MMP-3、MMP-13、ColⅡ、Aggrecan和GAPDH（1∶1 000）一抗孵育过夜，用TBST洗膜；孵二抗（1∶2 000），摇床室温孵育1 h，用TBST摇床洗膜；于ECL显影液下反应1～2 min，凝胶成像分析系统进行显色并拍照。用Image Lab软件分析获取各蛋白条带灰度值，以GAPDH为参照计算目的蛋白相对表达量。

2.5 统计学方法

采用SPSS 24.0软件进行统计分析。计量资料符合正态分布以（\overline{x}±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法；计量资料不符合正态分布以［M（P₂₅，P₇₅）］表示，多组间比较采用Kruskal-Wallis分析，组间两两比较采用Dunn's test法。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 结　果

3.1 4组大鼠一般情况比较

与空白组比较，模型组大鼠精神状态、饮食情况、活动能力有所降低，毛发粗糙无光泽，活动迟缓，右膝关节明显肿胀，关节直径较空白组明显增加，而体质量较空白组明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，BCAE组和扶他林组大鼠精神状态改善，食欲增加，毛发较有光泽，活动较灵敏，右膝关节肿胀减轻，至给药第21天起，右膝关节直径较模型组明显降低，而体质量较模型组明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表1和表2。

3.2 4组大鼠患肢足迹情况及行走疼痛计分比较

空白组双侧后足行走对称，模型组行走时右后脚主要以前脚掌着地，右后足印迹明显浅于左后足，BCAE组和扶他林组右后足印迹稍浅于左后足，双侧后足行走欠对称，其对称性好于模型组。见图1。行走疼痛计分结果见表3。

3.3 4组大鼠软骨组织形态变化

给药28 d后，打开关节腔肉眼可见：空白组大鼠右膝关节面光滑、有光泽，股骨髁及胫骨平台软骨均完整；模型组右膝关节面粗糙，股骨髁及胫骨平台软骨局部出现剥脱并退变，软骨周围骨质出现增生，并可见软骨结节；BCAE组和扶他林组大鼠关节面欠光滑，颜色变暗，股骨髁及胫骨平台软骨局部可见细小裂隙，但其软骨退变程度轻于模型组。见图2和图3。

3.4 4组大鼠右膝关节软骨组织显微结构情况及改良Mankin's评分比较

软骨组织HE染色光镜下观察显示：空白组软骨组织基质染成粉红色，软骨细胞可见由表层、移行层、辐射层及钙化层4层结构分布，层次分明，表层软骨细胞较小，形态不规则，钙化层软骨细胞体积最大，呈类柱状，潮线清晰；模型组软骨组织基质染色变浅，表层裂隙成型，软骨层变薄，软骨层次紊乱，软骨细胞数量变少，潮线消失；BCAE组和扶他林组软骨细胞数量较模型组增加，软骨基质染色加深，软骨层次欠清，潮线尚能辨认，局部有断裂。见图4。改良Mankin's评分见表4。

3.5 4组大鼠右膝关节软骨组织MMP-1、MMP-3、MMP-13、Col Ⅱ和Aggrecan蛋白表达量比较

见图5、表5。

3.6 4组大鼠右膝关节软骨组织TLR4、MyD88、p-p65/p65蛋白表达量比较

见图6、表6。

4 讨　论

本研究表明，KOA模型大鼠经梅花入骨丹中药灌胃治疗后，其大鼠毛色、活动能力及膝关节肿胀程度均有不同程度改善，体质量也较模型组有所恢复，膝关节疼痛也有改善，膝关节软骨磨损程度较模型组减轻，改良Mankin's评分降低。说明梅花入骨丹能够减轻大鼠KOA的炎症反应，延缓关节软骨退变。

软骨基质的代谢失衡是导致KOA软骨退变的重要因素，MMPs作为降解细胞外基质成份的重要蛋白水解酶，在KOA软骨基质的代谢转换过程中起重要作用。多种MMP参与了KOA的发生、发展，主要包括MMP-1、MMP-3和MMP-13等^［15-18］。本实验结果显示梅花入骨丹能够抑制KOA模型大鼠软骨组织中MMP-1、MMP-3、MMP-13的高表达，而软骨基质成分Col Ⅱ和Aggrecan表达量较模型组显著升高。表明梅花入骨丹能够通过抑制软骨组织中多种重要MMP的表达，增加软骨基质主要成分Col Ⅱ及Aggrecan表达量，改善KOA大鼠软骨基质代谢失衡，进而减缓KOA大鼠的关节软骨退变。

TLR4/NF-κB信号通路是调节MMPs表达和软骨基质代谢的重要通路。TLR4可与相应配体结合，通过依赖MyD88途径激活下游的NF-κB信号通路，而NF-κB信号通路的激活主要通过促进p65蛋白磷酸化，进一步刺激特定基因的转录，诱导多种MMP的表达增加，导致软骨基质成分的进行性降解，引起软骨破坏^［19-21］。通过检测p-p65/p65的比值可反映p65蛋白的磷酸化水平，从而反映NF-κB信号通路的激活情况。本实验结果显示：相比于模型组，梅花入骨丹能够明显下调KOA大鼠膝关节软骨组织中TLR4、MyD88蛋白表达及降低p-p65/p65比值，显示出对TLR4/NF-κB信号通路的抑制效应，提示梅花入骨丹对MMPs表达调控可能与抑制TLR4/NF-κB信号通路有关，从而减少软骨基质成分降解，改善由炎症介导的KOA软骨基质代谢失衡。

综上，梅花入骨丹可抑制TLR4/NF-κB信号通路促进KOA大鼠软骨组织MMP-1、MMP-3、MMP-13表达，改善KOA大鼠软骨基质代谢失衡，减轻关节炎症反应，从而延缓关节软骨退变。

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基金资助

福建省自然科学基金项目(2023J01838)

福建省卫生健康科技计划项目(2023GGA070)

福建中医药大学医学技术学科专项课题（X202304-医技）