基于LncRNA H19/miR-675信号通路调控软骨基质合成探讨荣筋拈痛方治疗膝骨关节炎的作用机制

摘要

目的 从LncRNA H19/miR-675信号通路调控软骨基质合成的角度探讨荣筋拈痛方治疗膝骨关节炎（KOA）的作用机制。 方法 取40只8周龄SPF级雄性SD大鼠随机分生理盐水组和荣筋拈痛方组各20只，分别对应灌胃生理盐水和荣筋拈痛方制备空白血清和含药血清。提取4周龄SPF级雄性SD大鼠膝关节进行软骨细胞培养、传代，待软骨细胞生长状态良好时采用10 ng/mL白细胞介素-1β（IL-1β）干预24 h复制退变软骨细胞模型，再通过慢病毒转染构建长链非编码RNA H19 （LncRNA H19）沉默病毒、微小RNA-675（miR-675）沉默病毒、miR-675过表达病毒模型，采用qPCR检测LncRNA H19、miR-675 mRNA相对表达水平情况进行鉴定。鉴定成功后再分别进行LncRNA H19沉默、miR-675沉默以及miR-675过表达3个实验研究。LncRNA H19沉默实验中将LncRNA H19沉默病毒转染退变软骨细胞分为NC-K-1组、NC-R-1组、H19 Down-K组和H19 Down-R组；miR-675沉默实验中将miR-675沉默病毒转染退变软骨细胞NC-K-2组、NC-R-2组、miR-675 Down-K组和miR-675 Down-R组；miR-675过表达实验中将miR-675过表达病毒转染退变细胞分为NC-K-3组、NC-R-3组、miR-675 Up-K组和miR-675 Up-R组。其中NC-K-1组、H19 Down-K组、NC-K-2组、miR-675 Down-K组、NC-K-3组和miR-675 Up-K组采用含10%空白血清的DMEM培养基干预24 h；NC-R-1组、H19 Down-R组、NC-R-2组、miR-675 Down-R组、NC-R-3组和miR-675 Up-R组采用含10%含药血清的DMEM培养基干预24 h。干预后LncRNA H19沉默实验中采用qPCR法检测各组miR-675、Aggrecan和Collagen mRNA相对表达水平；Western blot检测各组Aggrecan、Collagen蛋白表达量。miR-675沉默和过表达实验中分别采用qPCR法和Western blot检测Aggrecan和Collagen Ⅱ mRNA相对表达水平和蛋白表达量。 结果 ① LncRNA H19沉默实验中，与NC-K-1组比较，NC-R-1组中miR-675 mRNA相对表达水平升高（P＜0.05），Aggrecan和Collagen Ⅱ mRNA相对表达水平、蛋白表达量均升高（P＜0.05）；与H19 Down-K组比较，H19 Down-R组miR-675 mRNA相对表达水平升高（P＜0.05），Aggrecan和Collagen Ⅱ mRNA相对表达水平、蛋白表达量均升高（P＜0.05）。② miR-675沉默实验中，与NC-K-1组比较，NC-R-2组中Aggrecan和Collagen Ⅱ mRNA相对表达水平、蛋白表达量均升高（P＜0.05）；与miR-675 Down-K组比较，miR-675 Down-R组Aggrecan和Collagen Ⅱ mRNA相对表达水平、蛋白表达量均升高（P＜0.05）。③ miR-675过表达实验中，与NC-K-3组比较，NC-R-3组中Aggrecan、Collagen Ⅱ蛋白表达量均升高（P＜0.05）；与miR-675 Up-K组比较，miR-675 Up-R组Aggrecan、Collagen Ⅱ mRNA相对表达水平、蛋白表达量均升高（P＜0.05）。 结论 荣筋拈痛方可以通过LncRNA H19/miR-675通路促进Aggrecan和Collagen Ⅱ mRNA mRNA mRNA相对表达水平和蛋白表达量，达到促进软骨基质合成、治疗KOA的作用。

Graphical abstract

关键词

膝骨关节炎 / 荣筋拈痛方 / 软骨基质代谢 / 软骨退变 / LncRNA H19 / miR-675

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是以软骨退变、滑膜炎症和骨赘形成等为特征的慢性退行性疾病，其发生发展与年龄、性别、肥胖、遗传、生活习惯等因素密切相关^［1］。近年来的研究显示KOA年轻化趋势加剧^［2］。研究发现长链非编码RNA（LncRNA）和微小RNA（miRNA）在细胞外基质（ECM）降解和软骨组织中异常表达对骨关节炎进展发挥重要作用^［3-5］。Ⅱ型胶原蛋白（Collagen Ⅱ）是软骨细胞产生的主要结构蛋白之一^［6］，是软骨降解的重要指标。关节软骨中的Collagen Ⅱ主要为α1型，其表达的变化反映了软骨细胞的代谢活性，间接表明了软骨的退化程度^［7］。聚集蛋白聚糖（Aggrecan）合成受到抑制时，关节软骨会因失去营养而受损，最终发生骨关节相关疾病。在骨关节炎软骨中，长链非编码RNA H19（LncRNA H19）的表达水平下降，并且它通过其衍生的微小RNA675（miR-675）来抑制Collagen Ⅱ的转录，从而抑制了软骨基质的合成^［8］。荣筋拈痛方拟自《清宫配方集成》中核心用药，前期研究表明，荣筋拈痛方可通过LncRNA H19/miR-675通路，促进Collagen Ⅱ和Aggrecan表达，延缓软骨基质降解^［9］，且证实荣筋拈痛方可从多靶点延缓KOA进展，显现出良好疗效^［10-12］。本研究拟通过LncRNA H19沉默实验、miR-675沉默实验和miR-675过表达实验3个体外实验探讨荣筋拈痛方对LncRNA H19/miR-675的调控作用及其对下游Collagen Ⅱ和Aggrecan表达水平的影响，旨在完善荣筋拈痛方通过LncRNA H19/miR-675通路治疗KOA的具体机制，为临床应用提供数据支撑。

1 材　料

1.1 实验动物

42只4周龄SPF级雄性SD大鼠、40只8周龄SPF级雄性SD大鼠，均由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，实验动物合格证号：SCXK（沪）2017-0005。实验过程及方法均符合福建中医药大学实验动物伦理委员会要求（FJTCM IACUC-2020053）。

1.2 实验药物

由牛膝、当归、独活等组成，上述药材购于福建中医药大学附属第三人民医院中药房。

1.3 实验试剂

胎牛血清（货号：10099141C）、0.25%胰蛋白酶（货号：25200-056）、TRIzol（货号：15596018）均购自美国Thermofisher公司；Mir-X^TM miRNA逆转录试剂盒（货号：638313）、PrimeScript^TM RTmRNA逆转录试剂盒（货号：R0047A）、TB Green^TM Premix ExTaq^TM Ⅱ试剂盒（货号：639676）均购自日本Takara公司；Ⅱ型胶原酶（货号：V900892-100MG）、无水乙醇（货号：459844-500mL）均购自美国Sigma公司；GAPDH抗体（货号：ab181602）、Collagen Ⅱ抗体（货号：ab307674）、Aggrecan抗体（货号：ab36861）均购自美国Abcam公司；Western封闭液（货号：P0252-500mL）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（货号：P0012S）均购自上海碧云天生物技术有限公司；低糖DMEM培养基（上海源培生物科技股份有限公司，货号：H210811）；氯仿（西陇科学股份有限公司，货号：106005）；异丙醇（国药集团化学试剂公司，货号：80109218）；Western转膜液（广州道一科学技术有限公司，货号：20019522）。

2 方　法

2.1 含药血清制备

40只8周龄SPF级雄性SD大鼠，用于制备空白和含药血清。空白血清以及含药血清具体制备过程参照前期研究^［13］。

2.2 大鼠软骨细胞体外培养

4周龄SD大鼠经2%戊巴比妥钠麻醉后于无菌条件下取出双侧膝关节，用刀片削下软骨组织，于无菌PBS溶液中充分漂洗3次后用眼科小剪刀剪碎至1 mm³大小，移至干净培养皿中用PBS溶液充分清洗3次，吸去PBS残余液体，加入0.2% Ⅱ型胶原酶溶液5 mL消化2 h，收集上清液至离心管，加入4 mL完全培养基移液器吹打重悬细胞，接种于T25培养瓶中，置于37 ℃、含5%CO₂的培养箱中进行培养、传代。

2.3 构建退变软骨细胞模型

选择10 ng/mL白细胞介素-1β（IL-1β）干预软骨细胞24 h，诱导退变软骨细胞模型^［13］。

2.4 慢病毒转染与鉴定

构建LncRNA H19沉默病毒、miR-675沉默病毒、miR-675过表达病毒后进行转染，采用qPCR检测LncRNA H19、miR-675 mRNA相对表达水平情况以鉴定转染效果。引物序列见表1。实验结果如下：与空白1组比较，H19沉默组中LncRNA H19 mRNA相对表达水平降低（P＜0.05）；与空白2组比较，miR-675沉默组中miR-675 mRNA相对表达水平降低（P＜0.05）；与空白3组比较，miR-675过表达组中miR-675 mRNA相对表达水平升高（P＜0.05），提示实验病毒转染成功，可进行后续相关实验。见图1。

2.5 实验分组与干预

慢病毒转染退变软骨细胞鉴定成功后，分别进行LncRNA H19沉默实验、miR-675沉默实验和miR-675过表达实验。

2.5.1 LncRNA H19沉默实验

LncRNA H19沉默病毒转染退变软骨细胞分为NC-K-1组、NC-R-1组、H19 Down-K组、H19 Down-R组，其中NC-K-1组和H19-Down-K组采用含10%空白血清的DMEM培养基干预24 h，NC-R-1组和H19 Down-R组采用含10%含药血清的DMEM培养基干预24 h。

2.5.2 miR-675沉默实验

miR-675沉默病毒转染退变软骨细胞分为NC-K-2组、NC-R-2组、miR-675 Down-K组、miR-675 Down-R组，其中NC-K-2组和miR-675 Down-K组采用含10%空白血清的DMEM培养基干预24 h，NC-R-2组和miR-675 Down-R组采用含10%含药血清的DMEM培养基干预24 h。

2.5.3 miR-675过表达实验

miR-675过表达病毒转染退变细胞分为NC-K-3组、NC-R-3组、miR-675 Up-K组、miR-675 Up-R组，其中NC-K-3组和miR-675 Up-K组采用含10%空白血清的DMEM培养基干预24 h，NC-R-3组和miR-675 Up-R组采用含10%含药血清的DMEM培养基干预24 h。

2.6 qPCR检测Aggrecan和Collagen Ⅱ mRNA相对表达水平

各组干预后采用TRIzol法提取各组退变软骨细胞中的总RNA；用分光光度计检测各组样本总RNA浓度。根据试剂盒要求逆转录合成cDNA，通过PCR仪进行扩增，miRNA以U6为内参，miRNA以β-actin为内参，均采用2^-ΔΔCt法分析Aggrecan、Collagen Ⅱ mRNA相对表达水平。引物序列见表1。

2.7 Western blot检测各组细胞Aggrecan和Collagen Ⅱ蛋白表达量

提取各组退变软骨细胞蛋白并进行浓度测量；后进行电泳、转膜、封闭处理后，加入一抗于4 ℃孵育过夜；洗膜，加入二抗于37 ℃孵育1 h，显影，Image lab软件对数据进行分析。

2.8 统计学方法

采用SPSS 26.0软件对所得数据进行统计学分析。LncRNA H19沉默验证、miR-675沉默验证以及miR-675过表达验证采用独立样本t检验，计量资料符合正态分布采用（\overline{x}±s）表示。当4组之间的miR-675、Aggrecan和Collagen Ⅱ mRNA相对表达水平符合正态分布特征时，实施单因素方差分析，方差齐则采纳LSD-t检验进行各组间两两对比；方差不齐则采用Games-Howell检验来进行组间的两两比较。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 结　果

3.1 LncRNA H19沉默实验

3.1.1 4组细胞miR-675、Aggrecan和Collagen Ⅱ mRNA相对表达水平比较

见图2。

3.1.2 4组细胞Aggrecan和Collagen Ⅱ蛋白表达量比较

见图3。

3.2 miR-675沉默实验

3.2.1 4组细胞Aggrecan和Collagen Ⅱ mRNA相对表达水平比较

见图4。

3.2.2 4组Aggrecan和Collagen Ⅱ 蛋白表达量比较

见图5。

3.3 miR-675过表达实验

3.3.1 4组大鼠细胞Aggrecan和Collagen Ⅱ mRNA相对表达水平比较

见图6。

3.3.2 4组细胞Aggrecan和Collagen Ⅱ蛋白表达量比较

见图7。

4 讨　论

KOA是临床常见的一种膝关节慢性退行性疾病，由多种因素共同作用所致，膝关节疼痛、肿胀、僵硬、活动受限甚至畸形是其常见临床症状^［14］。目前西医治疗主要是消炎、手术恢复膝关节功能等，可快速减轻患者的疼痛，但存在胃肠道反应、费用高等缺点。中医将KOA归属于“痹证”范畴，本虚标实、虚实夹杂的病性贯穿疾病始终，肝脾肾亏虚、筋骨失衡为根本病机^［15］。荣筋拈痛方由牛膝、独活等药物组成，具有补肝肾、壮筋骨、止痹痛等功用。课题组前期研究发现荣筋拈痛方可有效促进关节软骨胶原蛋白及蛋白多糖的合成，维持软骨基质代谢平衡，缓解KOA滑膜炎症等^［16-17］。

研究表明，LncRNA是RNA转录后调控和蛋白质翻译调控等多种生理病理过程中的重要调控因子^［18］。miRNA是多种疾病病理过程中的重要生物标志物与关键调节因子^［19-20］。LncRNA可通过多途径影响KOA进展，如通过抑制COX-2、iNOS和MMP等炎症介质的表达调控软骨细胞外基质的合成与分解代谢，通过调控TGF-β/SMAD2/3与NF-κB途径、NF-κB与MAPK途径缓解炎症，通过调控自噬过程改善滑膜炎症^［21-22］。近年来越来越多研究表明LncRNA与miRNA之间可以互相调控、密切联系。LncRNA H19是位于小鼠7号染色体上的父系印记基因的发育调控产物，其第一个外显子编码miR-675的前体^［23-24］。研究表明沉默LncRNA H19或者miR-675时，Collagen Ⅱ表达水平显著下调，过表达时则与之相反^［8-9］。前期研究发现，Collagen Ⅱ和Aggrecan的表达与LncRNA H19/miR-675表达水平的变化密切相关^［12］。

miR-675是LncRNA H19的重要衍生片段，其过表达可以逆转LncRNA H19耗尽导致的COL2A1表达降低，对关节软骨合成代谢起促进作用，能有效延缓KOA进展^［8］。本研究结果显示，LncRNA H19/miR-675沉默实验提示，沉默LncRNA H19/miR-675可以抑制Collagen Ⅱ和Aggrecan基因蛋白表达，荣筋拈痛方在一定程度内可以逆转抑制倾向，促进软骨基质合成，延缓骨关节炎进展；miR-675过表达实验提示，过表达miR-675可以促进Collagen Ⅱ和Aggrecan基因蛋白表达，基于以上，荣筋拈痛方仍可在一定程度内促进Collagen Ⅱ和Aggrecan基因蛋白表达。结合这3个部分实验，发现miR-675对下游Collagen Ⅱ和Aggrecan具有良好调控作用，沉默LncRNA H19后下游miR-675并未完全沉默，且叠加荣筋拈痛方干预之后miR-675、Collagen Ⅱ和Aggrecan表达上升，说明荣筋拈痛方是同时对LncRNA H19和miR-675起作用。验证了中医药多靶点、多方向的治疗作用。

参考文献

[1] MICHAEL J W P， SCHLÜTER-BRUST K U， EYSEL P. The epidemiology，etiology，diagnosis，and treatment of osteoarthritis of the knee ［J］. Dtsch Arztebl Int，2010，107（9）：152-162.

[2] YU D H， PEAT G， BEDSON J，et al. Annual consultation incidence of osteoarthritis estimated from population-based health care data in England ［J］. Rheumatology，2015，54（11）：2051-2060.

[3] ALNAJJAR F A， SHARMA-OATES A， WIJESINGHE S N，et al. The expression and function of metastases associated lung adenocarcinoma transcript-1 long non-coding RNA in subchondral bone and osteoblasts from patients with osteoarthritis ［J］. Cells，2021，10（4）：786.

[4] 王玺，王永成，王长海. MicroRNA在骨关节炎中对关节软骨的调控作用［J］. 中国医学创新，2023，20（12）：178-182.

[5] STECK E， BOEUF S， GABLER J，et al. Regulation of H19 and its encoded microRNA-675 in osteoarthritis and under anabolic and catabolic in vitro conditions ［J］. J Mol Med，2012，90（10）：1185-1195.

[6] HUANG K， WU L D. Aggrecanase and aggrecan degradation in osteoarthritis：a review ［J］. J Int Med Res，2008，36（6）：1149-1160.

[7] TRZECIAK T， CZARNY-RATAJCZAK M. MicroRNAs：important epigenetic regulators in osteoarthritis ［J］. Curr Genomics，2014，15（6）：481-484.

[8] DUDEK K A， LAFONT J E， MARTINEZ-SANCHEZ A，et al. Type Ⅱ collagen expression is regulated by tissue-specific miR-675 in human articular chondrocytes ［J］. J Biol Chem，2010，285（32）：24381-24387.

[9] 戴雨婷，郑若曦，王鹤，等. 荣筋拈痛方调控LncRNA H19/miR-675延缓大鼠膝骨关节炎软骨退变的作用机制［J］. 福建中医药，2023，54（1）：37-41.

[10] 陈俊，郑若曦，张婷，等. 荣筋拈痛方含药血清对骨关节炎大鼠SDF-1/CXCR4信号通路的影响［J］. 福建中医药，2021，52（7）：26-29.

[11] 赵忠胜. 从LncRNA GAS5/miR-21调控软骨基质代谢角度探讨荣筋拈痛方治疗膝骨关节炎的作用机制［D］. 福州：福建中医药大学，2020：65-66.

[12] 黄艳峰，陈俊，林洁，等. 荣筋拈痛方对白细胞介素-1β诱导大鼠退变软骨细胞增殖的影响［J］. 中华中医药杂志，2021，36（4）：2077-2082.

[13] 赵忠胜，陈振沅，黄云梅，等. 荣筋拈痛方对膝关节软骨细胞外基质代谢的作用及机制［J］. 中国组织工程研究，2023，27（28）：4448-4455.

[14] 范少勇，周明，胡梁深，等. 膝骨关节炎治疗方法研究进展［J］. 江西中医药，2023，54（10）：86-88.

[15] 林洁，赵忠胜，黄艳峰，等. 荣筋拈痛方对骨关节炎作用靶点的分析及验证［J］. 中华中医药杂志，2019，34（8）：3743-3746.

[16] HASHEMI M， DANEII P， ZANDIEH M A，et al. Non-coding RNA-mediated N6-methyladenosine （m6A） deposition：a pivotal regulator of cancer，impacting key signaling pathways in carcinogenesis and therapy response ［J］. Non Coding RNA Res，2024，9（1）：84-104.

[17] WAHEED A， RAI M F. Osteoarthritis year in review 2023：genetics，genomics，and epigenetics ［J］. Osteoarthritis Cartilage，2024，32（2）：128-137.

[18] FELEKKIS K， PIERI M， PAPANEOPHYTOU C. Exploring the feasibility of circulating miRNAs as diagnostic and prognostic biomarkers in osteoarthritis：challenges and opportunities ［J］. Int J Mol Sci，2023，24（17）：13144.

[19] MA X， CAI D C， ZHU Y K，et al. L-Glutamine alleviates osteoarthritis by regulating lncRNA-NKILA expression through the TGF-β1/SMAD2/3 signalling pathway ［J］. Clin Sci，2022，136（13）：1053-1069.

[20] SCHONROCK N， HARVEY R P， MATTICK J S. Long noncoding RNAs in cardiac development and pathophysiology ［J］. Circ Res，2012，111（10）：1349-1362.

[21] HEINEGÅRD D. Fell-Muir lecture：proteoglycans and more：from molecules to biology ［J］. Int J Exp Pathol，2009，90（6）：575-586.

[22] CAI X Z， CULLEN B R. The imprinted H19 noncoding RNA is a primary microRNA precursor ［J］. RNA，2007，13（3）：313-316.

[23] 李永津，林涌鹏，侯宇，等. 龙鳖胶囊与骨髓间充质干细胞移植对膝骨关节炎大鼠软骨修复作用的比较研究［J］. 广州中医药大学学报，2018，35（1）：123-128.

[24] DEY A. Structural modifications and novel protein-binding sites in pre-miR-675-explaining its regulatory mechanism in carcinogenesis ［J］. Noncoding RNA，2023，9（4）：45.

基金资助

国家自然科学基金项目(82074465)

福建省自然科学基金面上项目(2022J01843)

中西医结合基础福建省高校重点实验室开放课题(KLIM2022003)

中西医结合基础福建省高校重点实验室开放课题(CKJ2022003)