理气通便方对气滞型功能性便秘患者的疗效及肠道菌群的影响

Effect of Liqi Tongbian Decoction on the Efficacy and Intestinal Flora of Patients with Qi-Stagnation Type Functional Constipation

摘要

目的 探讨理气通便方对气滞型功能性便秘（FC）患者的疗效及肠道菌群的影响。 方法 选取2021年1—12月在福建中医药大学附属第二人民医院确诊的气滞型FC门诊和住院患者34例作为治疗组，采用理气通便方治疗4周后评估患者总的完全自主排便次数（CSBMs）应答率、中医证候疗效、便秘患者生活质量评估量表（PAC-QOL）评分与不良反应发生情况，另招募20名健康人作为正常组。采用16S rDNA测序技术对治疗组治疗前后及正常组肠道菌群进行Alpha多态性分析测定Chao1指数和Simpson指数，测定肠道菌群相对丰度并进行物种组成、产丁酸菌属差异性、特征性微生物群和肠道菌群基因功能预测分析。 结果 治疗组总的CSBMs应答率为61.76%，中医证候疗效总有效率为88.24%，治疗组治疗后PAC-QOL评分较治疗前改善（P＜0.05），且均不良反应。治疗组治疗前后及正常组肠道菌群相对丰度在门水平排名前3的物种为厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门，在属水平排名前3物种为拟杆菌属、栖粪杆菌属和志贺埃希菌属。与正常组比较，治疗组治疗前Chao1指数、Simpson指数升高（P＜0.05），产丁酸菌属相对丰度水平降低（P＜0.05），以普雷沃氏菌科、戴阿利斯特杆菌属、颤螺旋菌科、乳杆菌属、乳杆菌科、韦荣氏菌科等为特征菌，肠道菌群蔗糖降解Ⅲ（PWY-621）、丙酮酸发酵成乙酸和乳酸（PWY-5100）功能降低（P＜0.05）。与治疗前比较，治疗组治疗后Chao1指数、Simpson指数差异无统计学意义（P＞0.05），产丁酸菌属相对丰度水平升高（P＜0.05），以梭菌纲、毛螺菌科、毛螺菌目、厚壁菌门、布劳特氏菌属为特征菌，肠道菌群蔗糖降解Ⅲ（PWY-621）、丙酮酸发酵成乙酸和乳酸（PWY-5100）功能水平升高（P＜0.05）。 结论 肠道菌群紊乱可能是气滞型FC的重要发病机制，布劳特氏菌属、产丁酸菌属可能是理气通便方治疗气滞型FC患者药物作用的关键菌属。

Abstract

Objective To explore the effect of Liqi Tongbian Decoction on functional constipation (FC) patients with Qi-stagnation type functional constipation (FC) and its effect on intestinal flora. Methods A total of 34 outpatients and inpatients with FC of Qi-stagnation type diagnosed in the Second People's Hospital Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine from January to December 2021 were selected as the treatment group. The response rate of complete spontaneous bowel movements (CSBMs), efficacy of traditional Chinese medicine (TCM) syndromes, the Patients' Assessment of Quality of Life in Constipation (PAC-QOL) score, and the occurrence of adverse reactions were assessed after 4 weeks of treatment with Liqi Tongbian Decoction, and 20 healthy individuals were recruited as the normal group. 16S rDNA sequencing technology was used to analyze the Alpha polymorphism of the intestinal flora of the treatment group before and after treatment and the normal group to determine the Chao1 index and Simpson index, and to determine the relative abundance of the intestinal flora for the analysis of the species composition, variability of butyric acid-producing bacterial genera, characteristic microbiota, and the analysis of the prediction of the gene function of the intestinal flora. Results The total CSBMs response rate of the treatment group was 61.76%, the total effective rate of TCM syndrome was 88.24%, and the PAC-QOL score of the treatment group improved after treatment (P<0.05), and there were no adverse reactions. The top 3 species in terms of relative abundance of intestinal flora at the phylum level in the treatment group before and after treatment and in the normal group were Firmicutes, Bacteroidetes and Proteobacteria, and the top 3 species at the genus level were Bacteroidetes, Faecalibacterium and Escherichia Shigella. Compared with the normal group, the pre-treatment Chao1 index and Simpson's index of the treatment group increased (P<0.05), and the relative abundance level of butyric acid-producing bacterial genera decreased (P<0.05), with Prevotellaceae, Dialistella, Oscillospiraceae, Lactobacillaceae, Lactobacillus, Veillonellaceae, etc. as characteristic bacteria. The function of intestinal flora reduced by sucrose degradation Ⅲ (PWY-621), pyruvate fermentation into acetic acid and lactic acid (PWY-5100) (P<0.05). Compared with the pre-treatment period, the differences in Chao1 index and Simpson's index were not statistically significant in the treatment group (P<0.05), while the relative abundance level of butyric acid-producing bacterial genera increased (P<0.05), and the characteristic bacteria were Clostridia, Lachnospiraceae, Lachnospirales, Firmicutes and Blautia. The functional levels of sucrose degradation Ⅲ (PWY-621), pyruvate fermentation into acetic acid and lactic acid (PWY-5100) increased (P<0.05). Conclusion Intestinal flora disturbance may be an important pathogenesis of Qi-stagnation type of functional constipation, and Brautella and butyric acid-producing bacterial genera may be the key targets of Liqi Tongbian Decoction.

Graphical abstract

关键词

功能性便秘 / 理气通便方 / 肠道菌群 / 16S rDNA

Key words

Liqi Tongbian Decoction / functional constipation / intestinal flora / 16S rDNA

功能性便秘（functional constipation，FC）是在排除器质性疾病及继发性病变的基础上，以排便困难、频次减少和/或排便不尽感为主要表现的功能性肠病^［1］。近年来，受饮食结构改变、生活节奏加快和社会心理等因素影响，FC患病率呈上升趋势，全球FC患病率约为10.1%^［2］，女性明显高于男性，且与年龄呈正相关^［3］。长期便秘导致患者生活质量大大降低，容易诱发心脑血管、肠道肿瘤等疾病，给患者带来较大经济和心理负担。现代医学往往采用泻下药进行治疗，疗效不甚满意，且存在药物依赖性^［4］。中医药治疗FC具有整体调节和辨证论治的优势，但含蒽醌类中药的滥用可导致结肠黑变病，影响肠神经系统，甚至可导致结肠癌，因此寻求更好的治疗方法具有重大意义。课题组前期对福州地区145例FC患者中医证素分布规律进行横断面的调查，结果显示气滞证在FC患者证型中位居前列^［5］，故柯晓教授结合多年自身临床经验，以“理气通降法”为治疗大法，制定经验方理气通便方治疗气滞型FC，疗效确切^［6］。因此，本研究利用16S rDNA测序技术分析FC患者肠道菌群的特征，进一步明确理气通便方治疗气滞型FC的药物作用靶点，探讨理气通便方治疗FC的理论依据。

1 临床资料

1.1 西医诊断标准

FC诊断参照罗马Ⅳ标准^［1］。

1.2 中医辨证标准

参照国家药品监督管理局药品审评中心颁布的《中药新药用于慢性便秘临床研究技术指导原则》^［7］中气滞型的辨证标准。主症：① 排便不爽；② 腹胀。次症：① 肠鸣；② 胸胁满闷；③ 呃逆或矢气频。舌脉：舌暗红，苔薄，脉弦。具备全部主症和2项及以上次症，结合舌脉即可诊断。

1.3 纳入标准

① 性别不限，年龄18～70岁；② 患者能配合完成问卷调查、治疗及随访；③ 自愿参加并签署知情同意书。

1.4 排除标准

① 近3个月使用过抗生素、微生态制剂者，1周内未服用泻剂、胃肠动力药物者；② 经结肠镜检或钡灌肠诊断有肠道器质性病变者、妊娠期或哺乳期妇女、肠道手术史者、吸毒者；③ 合并有心脑血管、肝、肾、内分泌系统、炎性肠病及恶性肿瘤者。

1.5 一般资料

选取2021年1—12月在福建中医药大学附属第二人民医院确诊的气滞型FC门诊和住院患者34例，其中男10例，女24例，平均年龄（48.53±11.85）岁；招募20名18～70岁健康志愿者为正常组，其中男11例，女9例，平均年龄（46.20±7.41）岁。2组年龄、性别比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本试验通过福建中医药大学附属第二人民医院医学伦理委员会审批通过（审批号：PHFJP-Y2021025）。

2 方　法

2.1 治疗方法

治疗组口服理气通便方。药物组成：厚朴10 g，枳实10 g，火麻仁15 g，郁李仁10 g，瓜蒌仁15 g，炒莱菔子10 g，北柴胡9 g，白芍12 g，陈皮9 g，芒硝（冲服）3 g。所有药材均来自福建中医药大学附属第二人民医院中药房，由煎药室代煎，日1剂，分早晚2次温服，每次200 mL，疗程4周。

2.2 观察指标

2.2.1 总的完全自主排便次数（CSBMs）应答率

参照国家药品监督管理局药品审评中心颁布的《中药新药用于慢性便秘临床研究技术指导原则》^［7］，采用排便日记卡记录患者治疗期间每周总的CSBMs（CSBM定义为不服用补救性泻剂或手法辅助情况下的自主且具有完全排尽感的排便次数）。总的CSBMs应答者：患者在接受治疗的周数中至少50%的时间满足该周总的CSBMs至少为3次，并且与治疗前相比CSBMs每周至少增加1次。

总的CSBMs应答率＝总的CSBMs应答者例数/总例数×100%

2.2.2 中医证候疗效判定标准

参考2017年版《脾胃病症状量化标准专家共识意见（2017）》^［8］，按症状无、轻、中、重对主症与次症进行评分，主症分别计0、2、4、6分，次症分别计0、l、2、3分。临床痊愈：主要症状、体征消失或基本消失，疗效指数≥95%；显效：主要症状、体征明显改善，70%≤疗效指数＜95%；有效：主要症状、体征明显好转，30%≤疗效指数＜70%；无效：主要症状、体征无明显改善，甚至加重，疗效指数＜30%。

疗效指数＝（治疗前评分－治疗后评分）/治疗前评分×100%

总有效率＝（临床痊愈＋显效＋有效）例数/总例数×100%

2.2.3 患者生活质量

治疗前后采用便秘患者生活质量评估量表（PAC-QOL）评分评定。PAC-QOL从生理不适（3个条目）、社会心理不适（8个条目）、焦虑情绪（12个条目）及满意度（5个条目）4个维度进行评分，各条目按0~4分计，总分112分^［9］。评分越高表示便秘患者生活质量越差。

2.2.4 安全性指标

治疗前后检测三大常规、肝功能、肾功能、心电图，并观察治疗组治疗期间消化道不良反应发生情况。

2.2.5 肠道菌群的特征分析

2.2.5.1 16S rDNA测序技术测定

收集治疗组治疗前后与正常组新鲜粪便样本2 g置于无菌冻存管中，并迅速放入-80 ℃冰箱保存。采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法提取样品DNA，使用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度。扩增16S rDNA V4区，采用Phusion^® High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶进行PCR反应。PCR扩增体系：2×Tag PCR Mix 25 L上下游引物（10 μmol）2 μL；DNA 模板2.5 μL；H₂O 8.0 μL。PCR扩增程序：95 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，57 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共34个循环，72 ℃ 10 min，16 ℃ 5 min。使用NEBNext Ultra^TM I DNA Library Prep Kit建库试剂盒构建文库后，采用Qubit和qPCR进行定量。文库合格后，使用NovaSeq 6000测序，测序得到的原始数据经过质控、降噪，获得最终的扩增子序列变体（amplicon sequence variants，ASV）相对丰度表。

2.2.5.2 生物信息学分析

① 物种组成分析：根据ASV相对丰度表对肠道菌群的相对丰度在门、属水平进行排名，取排名前10物种绘制成柱状图；② Alpha多态性分析：测定反映物种丰富度的Chao1指数以及反映物种多样性的Simpson指数；③ 物种差异性分析：根据ASV相对丰度表分析2组产丁酸菌属的差异；④ 特征性微生物群分析：采用LEfSe分析寻找2组间在相对丰度上有显著差异的物种，以线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）绝对值＞4为标准确定组间相对丰度水平差异显著的物种；⑤ 肠道菌群基因功能预测：运用PICRUSt 2软件包，基于已测细菌基因组的16S rDNA全长序列，推断他们共同祖先的基因功能谱，对Greengene数据库中其他未测物种的基因功能谱进行推断，构建全谱系的基因功能预测谱，将测序得到的菌群组成映射到数据库中，对菌群代谢功能进行预测，得到相应的功能注释及其相对丰度表，并进行差异分析。

2.3 统计学方法

采用SPSS 27.0统计软件进行分析。计量资料符合正态分布的以（\overline{x}±s）表示，组内治疗前后比较采用配对t检验，组间比较采用独立样本t检验；不符合正态分布的以M（P₂₅，P₇₅）表示，采用秩和检验。计数资料采用χ²检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 结　果

3.1 治疗组总的CSBMs应答率

34例患者共21例患者在治疗的周数中至少50%的时间满足CSBMs周应答，CSBMs应答率为61.76%。

3.2 治疗组中医证候疗效

34例患者经治疗后临床痊愈0例，显效16例，有效14例，无效4例，中医证候总有效率为88.24%。

3.3 治疗组治疗前后PAC-QOL评分比较

治疗组治疗后PAC-QOL评分在生理不适、社会心理不适、焦虑情绪、满意度4个维度以及总分均较治疗前下降，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

3.4 安全性分析

治疗组治疗前后三大常规、肝功能、肾功能、心电图指标比较均未见明显异常，且未发生消化道不良反应。

3.5 肠道菌群16S rDNA测序结果

3.5.1 肠道菌群物种组成分析

2组肠道菌群相对丰度在门水平排名前3的是厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门，见图1。在属水平排名前3的是拟杆菌属、栖粪杆菌属和志贺埃希菌属，见图2。

3.5.2 Alpha多态性分析

治疗组治疗前Chao1指数、Simpson指数较正常组升高（P＜0.05），而与治疗后比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

3.5.3 2组产丁酸菌属相对丰度水平比较

治疗组治疗前产丁酸菌属（瘤胃球菌属组、活泼瘤胃球菌属、高氏瘤胃球菌属、真杆菌属、丁酸弧菌属、毛螺菌属ND3007组、多尔氏菌属）相对丰度水平低于正常组（P＜0.05）；治疗组治疗后上述菌属相对丰度水平较治疗前升高（P＜0.05），且与正常组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

3.5.4 特征性微生物群分析

以LDA绝对值＞4的菌属为特征菌。与正常组比较，治疗组治疗前以普雷沃氏菌科、戴阿利斯特杆菌属、颤螺旋菌科、乳杆菌属、乳杆菌科、韦荣氏菌科等为特征菌，正常组以毛螺菌目、毛螺菌科、布劳特氏菌属为特征菌，见图3。治疗组治疗前以普雷沃氏菌科、普雷沃氏菌属等为特征菌，治疗后以梭菌纲、毛螺菌科、毛螺菌目、厚壁菌门、布劳特氏菌属为特征菌。见图4。

3.5.5 肠道菌群基因功能预测分析

治疗组治疗前蔗糖降解Ⅲ（PWY-621）、丙酮酸发酵成乙酸和乳酸（PWY-5100）功能低于正常组（P＜0.05），而治疗后上述功能较治疗前均升高（P＜0.05）。见表4。

4 讨　论

FC属中医学“便秘”范畴，又名“不大便”“后不利”等。食物由口入胃，经过胃的腐熟、脾的运化、肺的宣发肃降，然后传入大肠，若肠道的传导功能正常，则排便通畅；若因感受外邪、饮食不节、情志失调等多种原因致人体气机失调，肠道气机阻滞，传导功能失常，糟粕不行亦可致便秘。因此，便秘的形成，病位在大肠，责之于气滞，关乎于脾胃，与气机升降失常关系密切，采用“理气通降法”治疗FC可取得显著疗效。

理气通便方是在国医大师杨春波教授“理气通降法”学术思想指导下，柯晓教授结合临床长期实践制定的经验方。方中枳实苦辛微寒，下气破结力强，厚朴味苦性温，具有下气除满的作用，二者相须为用，能加强行气通便的效果，共为君药。臣以质润通降之火麻仁、郁李仁、瓜蒌仁润肠通便；莱菔子味苦行散、降气除胀，陈皮辛苦，辛可行气、苦可降气，莱菔子与陈皮合用以加强君药理气降气之效。佐以北柴胡苦辛微寒，功擅调达肝气而疏郁结；白芍酸苦微寒，柔肝缓急；芒硝咸苦寒，润燥软坚。全方共奏理气行滞、润肠通便的功效。本研究显示治疗组治疗后总的CSBMs应答率为61.76%，中医证候疗效总有效率为88.24%，PAC-QOL评分显著下降。

肠道微生态是哺乳动物体内最复杂和最大的微生态系统，菌群数量约为人体细胞总数的10倍，被称为人体的“第二基因组”。近年来，越来越多的研究发现肠道菌群的改变在FC发病和转归中发挥着重要的作用。肠道菌群紊乱导致肠神经系统、代谢产物、免疫系统和黏液分泌等多种功能异常，进而导致FC的发生^［10］。16S rDNA高通量测序技术可较为全面、准确地分析肠道菌群结构，并对基因功能进行预测分析，对探索FC发病机制与治疗关键靶点具有重要意义。本研究结果显示：① 治疗组治疗前气滞型FC患者Chao1指数与Simpson指数较正常组升高，而治疗前后差异无统计学意义，提示气滞型FC患者肠道菌群数量、构成比例失调，而理气通便方对气滞型FC患者肠道菌群数量、构成比例失调无明显疗效。② 与正常组比较，治疗组治疗前产丁酸菌属（瘤胃球菌属组、活泼瘤胃球菌属、高氏瘤胃球菌属、真杆菌属、丁酸弧菌属、毛螺菌属ND3007组、多尔氏菌属）相对丰度减少，而治疗后上述菌属相对丰度较治疗前则明显增多，与对照组比较差异无统计学意义。③ 戴阿利斯特杆菌属、乳杆菌属是治疗组治疗前的特征菌，布劳特氏菌属是治疗组治疗后与正常组的特征菌属。综上可进一步推测布劳特氏菌属、产丁酸菌属是治疗气滞型FC患者的关键菌属。

特定菌群发酵的代谢产物短链脂肪酸（SCFAs）可通过特定的转运体进入细胞，直接影响细胞代谢，对维持结肠的黏液层厚度及结肠动力等正常生理功能具有重要的作用^［11］。布劳特氏菌属是厚壁菌门毛螺菌科的一个分类属，是健康人类胃肠道中相对丰富的共生菌，占人类肠道微生物组的2%~8%，有利于促进碳水化合物降解，研究发现布劳特氏菌属可发酵葡萄糖产生SCFAs，尤以乙酸为主^［12］。本研究中瘤胃球菌属组、活泼瘤胃球菌属、高氏瘤胃球菌属、真杆菌属、丁酸弧菌属、毛螺菌属ND3007组、多尔氏菌属于产丁酸菌^［13-15］。产丁酸菌是一类能够利用糖酵产生丁酸的细菌总称，丁酸可以通过调节神经元来调节肠道动力。研究表明丁酸显著增加胆碱乙酰转移酶肌间神经元的比例，促进胆碱能介导的体外结肠环状肌收缩反应，进而促进肠道蠕动^［16-17］。本研究结果显示：治疗组治疗前肠道菌群PWY-621及PWY-5100功能水平较正常组低，而治疗后上述功能水平升高，提示气滞型FC患者可能是由于肠道菌群糖酵解功能水平低下，进而引起丙酮酸发酵成乙酸和乳酸能力减弱，最终导致FC的发生。理气通便方的疗效机制可能是通过增强肠道菌群蔗糖降解Ⅲ及丙酮酸发酵成乙酸和乳酸来实现的。

综上所述，本研究发现气滞型FC患者存在肠道菌群紊乱，表现为产丁酸菌属水平显著下降，经理气通便方治疗后，气滞型FC患者临床症状改善，肠道菌群中布劳特氏菌属、产丁酸菌属有益菌水平显著升高。因此，本研究推测肠道菌群紊乱可能是气滞型FC的重要发病机制，布劳特氏菌属、产丁酸菌属可能成为理气通便方治疗气滞型STC患者药物作用的关键靶点。

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基金资助

国家自然科学基金面上项目(82274282)

中央引导地方科技发展资金项目(2023L3013)

福建省名中医柯晓工作室建设项目(闽卫中医〔2022〕112号)