基于NMDAR1-PSD-nNOS通路探讨栝楼桂枝颗粒对神经元兴奋性毒性损伤后突触可塑性的影响

Effects of Gualou Guizhi Granule on Synaptic Plasticity after NMDA induced Neuronal Excitotoxic Injury Based on NMDAR1-PSD-nNOS Signaling Pathway

摘要

目的 基于NMDAR1-PSD-nNOS通路探讨栝楼桂枝颗粒（GLGZG）对神经元兴奋性毒性损伤后突触可塑性的影响，为GLGZG治疗缺血性脑卒中提供实验依据。 方法 取新生大鼠的原代海马神经元，分为对照组、模型组、低剂量组、中剂量组，建立N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）诱导神经元兴奋性毒性损伤模型，对照组加入不含有NMDA的完全培养基进行培养，模型组用含有200 μmol/L NMDA的完全培养基诱导损伤6 h，低、中剂量组分别予以含有100、200 μg/mL GLGZG溶液的完全培养基干预24 h后，再更换为含有200 μmol/L NMDA的完全培养基诱导损伤6 h。干预后采用电子显微镜观察4组神经元形态，MTT法检测4组神经元存活率，乳酸脱氢酶（LDH）法检测4组神经元LDH水平，qPCR检测4组神经元NeuN、GAP-43、PSD-95、NMDAR1 mRNA转录水平，Western blot检测4组神经元NeuN、GAP-43、PSD-95、MAP-2、Synapsin-1、NMDAR1、nNOS蛋白相对表达量。 结果 与对照组比较，模型组神经元形态异常，神经元存活率降低，LDH水平升高，NeuN、GAP-43、PSD-95、NMDAR1 mRNA转录水平均显著降低（P＜0.05），NeuN、GAP-43、PSD-95、MAP-2、Synapsin-1、NMDAR1、nNOS蛋白相对表达量均降低（P＜0.05）。与模型组比较，低、中剂量组神经元形态明显改善且神经元存活率显著提高，LDH水平降低（P＜0.05）；低剂量组NeuN、NMDAR1 mRNA转录水平以及NeuN、GAP-43、PSD-95、Synapsin-1蛋白相对表达量均上升（P＜0.05），中剂量组NeuN、GAP-43、PSD-95、NMDAR1 mRNA转录水平以及NeuN、GAP-43、PSD-95、Synapsin-1、MAP-2、NMDAR1、nNOS蛋白相对表达量均提高（P＜0.05）。与低剂量组比较，中剂量组LDH水平以及MAP-2、Synapsin-1蛋白相对表达量均升高（P＜0.05）。 结论 GLGZG能够减轻NMDA诱导的神经元兴奋性毒性损伤，可能与GLGZG可通过调控NMDAR1-PSD-nNOS通路、改善神经元突触可塑性有关。

Abstract

Objective To study the effect of Gualou Guizhi Granule (GLGZG) on synaptic plasticity after neuronal excitotoxicity injury based on the NMDAR1-PSD-nNOS pathway, and to provide an experimental basis for the treatment of ischemic stroke with GLGZG. Methods Primary hippocampal neurons of neonatal rats were divided into control group, model group, low-dose group and medium-dose group, and the excitotoxic injury model of neurons induced by NMDA was established. The control group was cultured with complete medium without NMDA. Model group was treated with complete medium containing 200 μmol/L NMDA for 6 h, and low-dose and medium-dose groups were treated with complete medium containing 100 and 200 μg/mL GLGZG solution respectively for 24 h, and then 200 μmol/L NMDA was added to induce injury for 6 h. The morphology of neurons was observed by electron microscope. The neuronal survival rate was detected by MTT method, and lactate dehydrogenase (LDH) level of neurons was detected by LDH method. The mRNA transcription levels of NeuN、GAP-43、PSD-95 and NMDAR1 in neurons were detected by qPCR. The relative expression levels of NeuN、GAP-43、PSD-95、MAP-2、Synapsin-1、NMDAR1 and nNOS proteins were detected by Western blot. Results Compared with the control group, the model group showed abnormal neuronal morphology, decreased neuronal survival, increased LDH levels, significantly decreased NeuN, GAP-43, PSD-95, and NMDAR1 mRNA transcript levels, and the relative expression of NeuN, GAP-43, PSD-95, MAP-2, Synapsin-1, NMDAR1, and nNOS proteins were all decreased (P＜0.05). Compared with the model group, neuronal morphology was significantly improved and neuronal survival rate increased in the low and medium dose groups, and LDH level was reduced (P＜0.05). NeuN and NMDAR1 mRNA transcription levels as well as the relative expression of NeuN, GAP-43, PSD-95, and Synapsin-1 proteins increased in the low-dose group (P＜0.05), and NeuN, GAP-43, PSD-95, and NMDAR1 mRNA transcription levels as well as the relative expression of NeuN, GAP-43, PSD-95, Synapsin-1, MAP-1, Synapsin-1, MAP-2, NMDAR1, and nNOS proteins relative expression increased (P＜0.05). Compared with the low-dose group, the LDH level as well as the relative expression of MAP-2 and Synapsin-1 proteins were elevated in the medium-dose group(P＜0.05). Conclusion GLGZG could attenuate NMDA-induced neuronal excitotoxicity injury, which may be related to the promotion of neuronal synaptic plasticity by modulating the NMDAR1-PSD-nNOS pathway.

Graphical abstract

关键词

神经元损伤 / 脑卒中 / 神经可塑性 / 栝楼桂枝颗粒

Key words

Gualou Guizhi Granule / neuronal injury / stroke / neural plasticity

脑卒中尤其是缺血性脑卒中，具有较高的发病率、病死率、复发率，且会遗留不同程度的功能障碍，严重威胁患者的身体健康和生活质量^［1］，对缺血性脑卒中及其后遗症的预防和治疗已成为社会和医学界关注的重要课题。已有研究表明神经环路的重建有助于缓解脑卒中痉挛状态，而在重建神经环路中，神经元突触可塑性发挥重要作用^［2-4］，因此通过改善神经元突触的可塑性来保护神经元为治疗缺血性脑卒中提供了新的治疗思路。

临床研究显示：应用栝楼桂枝汤治疗中风能明显改善患者的运动功能及痉挛状态^［5］。栝楼桂枝汤可减少兴奋性氨基酸（甘氨酸、谷氨酸、天门冬氨酸）释放，从而缓解大鼠的痉挛状态^［6-7］。且其对于抑制神经元凋亡及抑制谷氨酸、N-甲基-D-天冬氨酸（N-Methyl-D-aspartic acid，NMDA）诱导的神经元兴奋性毒性损伤也具有积极保护作用^［8］。栝楼桂枝汤出自张仲景的《金匮要略》，其相关制剂——栝楼桂枝颗粒（Gualou Guizhi Granule，GLGZG）已获批成为福建省第二人民医院的院内制剂，但其是否通过改善神经元突触的可塑性发挥神经保护作用，以及其发挥药效的作用机制尚不明确。本研究通过建立NMDA诱导神经元兴奋性毒性损伤模型，根据前期研究结果选取浓度为100、200 μg/mL GLGZG溶液，研究其对NMDA诱导的神经元兴奋性毒性损伤后突触可塑性的影响及其作用机制^［9］，为GLGZG临床治疗缺血性脑卒中提供一定的实验依据。

1 实验材料

1.1 实验动物

24 h内新生清洁级SD大鼠30只（雌雄不限）购自上海斯莱克实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2022-0004，饲养于福建中医药大学动物中心，动物使用许可证号：SYXK（闽）2019-0007。本研究操作严格遵循动物实验伦理相关规定，并已通过福建中医药大学动物伦理委员会审核批准（审批号：20220004006426）。

1.2 实验药物

GLGZG由福建中医药大学附属第二人民医院药学部提供（1 g颗粒剂等同生药量2 g，闽药制备字：Z20190001000，批号：0087001），由天花粉、桂枝、白芍、生姜、大枣、甘草按10∶3∶3∶3∶3∶2的比例配制而成^［10］。

1.3 主要试剂及实验仪器

0.2%木瓜蛋白酶（批号：9001-73-4）及NMDA（批号：6384-92-5）均购自美国Sigma公司；Neurobasal^®培养基（批号：21103049）及B-27^®无血清添加剂（批号：17504-044）均购自美国Life Technologies公司；乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号：C0017）；RNeasy^® Mini Kit（德国QIAGEN公司，批号：74104）；RevertAid第一链cDNA合成试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司，批号：K1622）；Power SYBR^® Green PCR预混液（美国Thermo Fisher Scientific公司，批号：4368708）：微管关联蛋白2（MAP-2，美国Santa Cruz公司，批号：Sc-5395，稀释比例1∶1 000）；神经核抗原（NeuN，英国Abcam公司，批号：Ab104225，稀释比例1∶5 000）；神经生长相关蛋白43（GAP-43，批号：8945，稀释比例1∶1 000）、突触后致密物-95（PSD-95，批号：3409，稀释比例1∶1 000）、突触蛋白-1（Synapsin-1，批号：5297，稀释比例1∶1 000）、谷氨酸受体1（NMDAR1，批号：5701，稀释比例1∶1 000）、一氧化氮合成酶（nNOS，批号：4231，稀释比例1∶1 000）及β-actin抗体（批号：4967，稀释比例1∶1 000）皆购自美国CST公司。实验设计到的相关引物由上海生物工程公司合成。

多功能酶标仪（瑞士TECAN公司，型号：Infinite M200 Pro）；PCR扩增仪（美国Bio Rad公司，型号：C1000）；凝胶成像分析系统（美国Bio Rad公司，型号：ChemiDoc XRS+）；实时荧光定量PCR仪（英国ABI公司，型号：7900HT）。

2 实验方法

2.1 神经元的原代培养与鉴定

参照前期实验的方法^［9］，取24 h内出生的大鼠用75%乙醇消毒，麻醉后置于冰上进行断头取脑，将脑置于培养皿中；解剖显微镜下去除脑膜和血管等，完整分离出海马组织，使用显微镊将海马组织切成约1～2 mm³小块，加入37 ℃ 2 mg/mL木瓜蛋白酶溶液3 mL于37 ℃进行恒温培养；30 min后弃去上层酶溶液，加2 mL培养基吹打至无明显组织结块；静置1 min，取上清至离心管中，加1 mL木瓜蛋白酶溶液，用离心机以1 100 r/min混匀离心1 min；再次弃去上清后加1 mL PBS，吹打约80次得到海马神经元悬液；以细胞数量8×10³个/孔接种于96孔板中，置于37 ℃、5% CO₂培养箱培养，每3 d半量换液1次；培养至第7天时，采用MAP-2免疫化学染色法鉴定神经元。结果显示：在正常神经元的树突和胞体中，MAP-2免疫反应表现为明显的绿色荧光信号，DAPI免疫反应在神经元的细胞核中表现为蓝色荧光，则可鉴定为海马神经元，用于后续实验。见图1。

2.2 神经元的分组及给药

将神经元接种于多聚赖氨酸包被过的96孔板中，在37 ℃、5% CO₂的条件下培养至第7天时，分为对照组、模型组及低、中剂量组。GLGZG在无菌条件下用含1% 胎牛血清的培养基配制成1 mg/mL母液后，再使用时稀释成100 μg/mL和200 μg/mL GLGZG溶液。对照组加入不含NMDA的完全培养基培养，模型组加入含有200 μmol/L NMDA的完全培养基诱导损伤6 h，低、中剂量组分别加入100、200 μg/mL GLGZG溶液干预24 h后，再加入含有200 μmol/L NMDA的完全培养基诱导损伤6 h。

2.3 观察指标

2.3.1 神经元的形态学变化

干预后在电子显微镜下观察4组神经元的形态学变化。

2.3.2 神经元存活率和LDH水平

干预后吸取4组细胞培养液上清，使用LDH试剂盒检测上清液中的LDH水平，培养皿中的神经元则使用MTT试剂盒进行检测，并计算4组神经元存活率。实验每组分别设6个复孔，重复3次。

2.3.3 qPCR检测GAP-43、PSD-95、Synapsin-1、NMDAR1、NOS mRNA转录水平

干预后吸去4组细胞培养基，用PBS洗涤，再用RNeasy^® Mini Kit试剂盒提取细胞总RNA并测定其浓度。用Revert Aid第一链cDNA合成试剂盒进行逆转录反应，并用Power SYBR^® Green PCR 预混液试剂盒进行扩增。采用ABI 7900荧光定量PCR仪获得每个样品Ct值，计算目的基因mRNA转录水平。各目的基因引物序列见表1，PCR仪设置反应程序见表2。

2.3.4 Western blot检测NeuN、GAP-43、PSD-95、MAP-2、Synapsin-1、NMDAR1、nNOS蛋白相对表达量

4组干预后每孔加入含有PMSF的RIPA裂解液进行裂解，收集裂解液，在4 ℃下以12 000 r/min离心15 min，取上清液，加入蛋白上样缓冲液，得蛋白样品；在配好的SDS-PAGE凝胶分离蛋白，然后完成转膜、封闭步骤；随后用NeuN、GAP-43、PSD-95、MAP-2、Synapsin-1的一抗4 ℃孵育过夜，3次洗涤后加入相应的二抗工作液，室温孵育2 h，3次洗涤后采用Bio-RAD凝胶分析仪进行图像显影，采用蛋白条带的灰度值计算蛋白相对表达量。另外设立对照组、模型组、中剂量组3组，按照上述方法检测NMDAR1、nNOS蛋白相对表达量。

2.4 统计学方法

采用SPSS 25.0软件对数据进行处理。计量资料服从正态分布的以（\overline{x}±s）表示，2组间比较采用独立样本t检验，多组间采用单因素ANOVA分析，方差齐采用LSD-t法进行两两比较，方差不齐则采用Games-Howell法。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 结　果

3.1 4组神经元形态学比较

对照组的海马神经元呈现突起长且互相交织的网状结构，胞体表面光滑，有明显折光性；模型组的海马神经元细胞变圆润，失去原有的形态，突起淡化、减少，贴壁不牢且折光性下降，部分细胞凋亡；与模型组比较，低剂量组神经元形态明显好转，细胞基本能够保持原型，突起相比于模型组更接近正常形态，可见网状结构；与模型组比较，中剂量组神经元形态更加接近正常形态，胞体表面较光滑，突起长且交织成网状结构，说明GLGZG干预能够改善受损神经元的形态。见图2。

3.2 4组神经元存活率和LDH水平比较

见表3。

3.3 4组NeuN、GAP-43、PSD-95、NMDAR1 mRNA转录水平比较

见表4。

3.4 4组NeuN、GAP-43、PSD-95、MAP-2、Synapsin-1蛋白相对表达量比较

与对照组比较，模型组NeuN、GAP-43、PSD-95、MAP-2、Synapsin-1蛋白相对表达量显著降低；与模型组比较，低剂量组（除MAP-2外）和中剂量组上述指标蛋白相对表达量均升高（P＜0.05）；与低剂量组比较，中剂量组MAP-2、Synapsin-1蛋白相对表达量均升高（P＜0.05）。见图3和表5。

3.5 3组NMDAR1、nNOS蛋白相对表达量比较

由上述结果可知：与低剂量组比较，中剂量组LDH水平及MAP-2和Synapsin-1的蛋白相对表达量具有显著性差异，故选择中剂量组检测NMDAR1、nNOS蛋白的表达。实验结果显示：与对照组比较，模型组NMDAR1、nNOS蛋白相对表达量降低（P＜0.05）；与模型组比较，GLGZG干预后，上述指标蛋白相对表达量均升高（P＜0.05）。见图4和表6。

4 讨　论

有研究指出，GLGZG具有神经保护作用^［11］，且能够拮抗脑卒中后的脑部兴奋性毒性^［12］。NMDA作为脑内兴奋性氨基酸，参与多种神经疾病的发生、发展过程，且能够诱导神经元凋亡^［5］。另有研究指出：缺血性脑卒中患者脑部血流供应不足会导致细胞膜通透性改变或破裂，LDH则被释放，导致血清中LDH水平升高^［13］。本研究采用NMDA构建神经元兴奋性毒性损伤模型，发现GLGZG预处理后，能够改善NMDA干预后受损神经元的形态，且可以提升神经元存活率并降低LDH水平，有效减少NMDA诱导的神经元兴奋性毒性损伤。

MAP-2是神经生长和修复相关蛋白，对兴奋性氨基酸等反应敏感^［14］，且是神经元重塑的常用分子标志。而NeuN作为成熟神经元标记物，在神经元间的沟通中起桥梁作用，常被用于直接评估神经元死亡或丢失的可靠标志物^［15］。本研究结果显示：NMDA干预后受损细胞的NeuN mRNA转录水平及蛋白相对表达量下降，MAP-2蛋白相对表达量也显著下降，而在GLGZG干预后，上述指标有所上升，说明GLGZG能够发挥保护神经元的作用。

突触可塑性指神经系统功能在外环境的作用下发生适应性变化，从而维持其相对稳定的特性，是大脑最基础和最重要的生理活动之一^［16］。GAP-43的表达与成年动物神经元可塑性关系密切，对突触可塑性调节具有重要作用^［14］。Synapsin-1在中枢神经系统中参与突触连接的形成和维持，是突触的特异性标志物^［17］。PSD-95参与谷氨酸传递，且PSD-95通过运输N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）到突触后膜^［18］，具有激发突触活性，参与突触的连接和维持，增强突触重塑的作用^［19］。本研究结果显示：NMDA干预后受损细胞的GAP-43和PSD-95 mRNA转录水平及蛋白相对表达量下降，且Synapsin-1蛋白相对表达量也下降，而GLGZG给药后能够逆转该现象，说明GLGZG可能通过提高突触可塑性，从而减轻神经元兴奋性毒性损伤。

在突触传递正常的情况下，NMDAR能够介导Ca²⁺适量进入细胞，参与突触可塑性。而NMDAR的过度激活会使大量Ca²⁺流入神经元，引起神经元过度兴奋，从而损伤突触。当NMDAR被激活时，nNOS与nNOS羧基末端配体形成复合物，传递NO信号，造成突触损伤^［20］。本研究结果显示：NMDA干预后受损细胞的NMDAR1 mRNA转录水平及蛋白相对表达量下降，nNOS蛋白相对表达量也下降，而经过GLGZG给药后，上述指标显著升高，说明GLGZG可能通过调控NMDAR1-PSD-nNOS通路，提高突触可塑性，从而减轻神经元兴奋性毒性损伤。

综上，本实验表明GLGZG能够减轻NMDA诱导的大鼠神经元兴奋性毒性损伤，起到神经保护作用。这种保护作用可能与通过调控NMDAR1-PSD-nNOS通路、改善神经元突触可塑性有关。

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基金资助

国家自然科学基金项目(81803768)

福建省自然科学基金面上项目(2024J01127)

福建中医药大学基础类学科科研提升计划项目(XJC2022009)