载雷公藤红素的大黄酸偶联物胶束冻干制剂的制备

摘要

目的 制备载雷公藤红素（Cela）的羧甲基壳聚糖-酮缩硫醇-大黄酸（Cela/GCTR）偶联物胶束的冻干制剂，并考察不同浓度葡萄糖、乳糖、甘露醇、蔗糖作为冻干保护剂对Cela/GCTR胶束的保护效果。 方法 采用不同浓度葡萄糖、乳糖、甘露醇、蔗糖作为冻干保护剂单用和复合使用，结合冻干品的外观和复溶性，以及HPLC测得的载药量、包封率，以动态激光散射法测得复溶后粒径等作为评价指标，对制剂冻干效果进行评价，确定Cela/GCTR胶束冻干制剂的制备工艺。 结果 葡萄糖作为冻干保护剂时，胶束的外观粗糙且出现塌陷，但复溶性较好，与其他冻干保护剂相比具有较高的载药量和包封率，复溶后粒径随葡萄糖浓度的增高而变小；以乳糖作为保护剂时，发现选用0.4%乳糖时冻干品外观较差，胶束粒径较小，载药量和包封率随浓度增大而升高，但与其他冻干保护剂比较，其载药量和包封率仍偏低；以甘露醇作为保护剂时，冻干制剂的外观效果较好，载药量随甘露醇浓度的增大而增加，但复溶后粒径偏大；以蔗糖作为保护剂时，浓度对复溶性的影响较小，胶束的粒径较小，其中，以0.2%蔗糖作为冻干保护剂的效果最佳，与同浓度的其他3种冻干保护剂相比，其冻干制剂的色泽均匀，复溶性好，载药量和包封率分别为（37.89±0.26）%和（94.28±1.57）%，复溶后粒径为（150.10±1.06）nm，接近冻干前的粒径，较未加冻干保护剂的冻干制剂效果更佳。 结论 以0.2%的蔗糖为冻干保护剂制备的Cela/GCTR胶束冻干制剂复溶性好，复溶后粒径小、载药量大、包封率高，重复性好，该冻干工艺稳定可靠。

Graphical abstract

关键词

雷公藤红素 / 冻干制剂 / 聚合物胶束 / 大黄酸偶联物

雷公藤红素（celastrol，Cela）是一种从中药雷公藤中提取的三萜类化合物，其作为一种天然的蛋白酶抑制剂^［1］，可以调控多种信号通路和基因靶点，抑制肿瘤生长，包括阻滞细胞生长周期，抑制肿瘤细胞生长和诱导凋亡，抑制信号通路和癌细胞蛋白酶，影响肿瘤坏死因子等，从而发挥显著的抗癌作用^［2-4］。但Cela具有水溶性差、渗透性差、毒副作用大等问题，限制了其临床应用。

随着纳米技术的发展，通过合理设计可制备负载各类药物的纳米制剂，以克服药物应用不佳的问题，从而提高药物的生物利用度和药效^［5-6］。聚合物胶束（polymeric micelles，PMs）是当前研究最多的纳米递药系统之一^［7］。PMs能延长药物在血中平均滞留时间，提高生物利用度，从而减少给药量并降低药物毒副作用^［8-10］。

课题组前期以甘草次酸、羧甲基壳聚糖、酮缩硫醇、大黄酸为原料，合成了具有肝肿瘤靶向及活性氧（ROS）响应性的甘草次酸修饰的羧甲基壳聚糖-酮缩硫醇-大黄酸（GCTR）偶联物^［11］。该偶联物可在水中自行组装形成聚合物胶束，包载Cela，形成载Cela的GCTR偶联物胶束（Cela/GCTR胶束），以解决Cela水溶性差、渗透性差、毒副作用大等问题。在不加冻干保护剂的情况下，Cela/GCTR胶束冷冻干燥后，外观松散，表面粗糙，呈绒毛状，易散碎，有部分飞絮，复溶性较差，并且在冻干过程中因真空压力等原因，导致胶束损失较严重。因此，本研究以载药量、包封率、粒径等为评价指标，结合冻干品的外观及复溶性，考察不同浓度的4种冻干保护剂对Cela/GCTR胶束的保护效果，以制备复溶性良好的Cela/GCTR胶束冻干制剂。

1 实验材料

1.1 仪器

十万分之一电子天平（上海梅特勒托利多有限公司，型号：MS105DU）；超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司，型号：JY92-2DII）；冷冻干燥机（德国Christ公司，型号：ALPHA1-4 LSC basic）；高效液相色谱仪（日本岛津公司，型号：LC-20AT）；激光粒径测定仪（美国Santa Bbarbara公司，型号：380ZLS）。

1.2 试药

雷公藤红素对照品（成都普菲德生物技术有限公司，批号：19041101，纯度≥98%）；透析袋（安徽兰杰柯科技有限公司，型号：MWCO3500）；GCTR偶联物胶束（自制）；甲醇为色谱纯，其他试剂均为市售分析纯。

2 方　法

2.1 Cela/GCTR胶束的制备

参考文献［11］，称取9 mg Cela粉末溶解于0.4 mL二甲基亚砜（DMSO）中，备用；称取GCTR偶联物12.6 mg，置于西林瓶中加蒸馏水溶胀，冰水浴中探头超声至均匀分散，制备成5 mg/mL GCTR胶束溶液；将Cela溶液以1滴/s的速度滴入高速搅拌状态下的GCTR胶束溶液中，继续搅拌20 min，冰水浴中探头超声20 min，用蒸馏水透析12 h，再探头超声20 min，随后使用0.8 µm滤膜滤过滤，即得Cela/GCTR胶束溶液，再冷冻干燥后得Cela/GCTR胶束粉末。

2.2 Cela分析方法的建立

2.2.1 色谱条件

Inertsil ODS-SP色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 µm），流动相：乙腈-磷酸水（87∶13），流速：1.0 mL/min，柱温：30℃，检测波长：425 nm，进样量：20 µL。

2.2.2 Cela对照品溶液制备

精密称取Cela粉末3 mg，置于10 mL容量瓶中加甲醇溶解并稀释至10 mL刻度线，摇匀，制得300 μg/mL Cela对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液制备

取2.5 mg Cela/GCTR胶束粉末用3 mL水溶解后，取1 mL溶液置于10 mL容量瓶中，加甲醇破坏胶束结构，并稀释至刻度线。

2.2.4 标准曲线的制备

取“2.2.2”项下制备的Cela对照品溶液，用甲醇稀释并配制浓度分别为75、60、45、30、15、6、1.5 μg/mL Cela对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，记录各浓度对应的峰面积。以峰面积（A）为纵坐标，浓度（C，μg/mL）为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。

2.2.5 精密度考察

为了更好地考察测定的准确性，取与测定样品浓度接近的30 μg/mL浓度作中浓度用于精密度检测外，另取按标准曲线最低浓度和接近最高浓度分别作为低浓度和高浓度进行精密度检测。即取低、中、高（1.5、30、60 g/mL）浓度的Cela对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定峰面积，每个浓度的Cela对照品溶液连续进样6次，记录峰面积。测日内精密度；每个浓度的Cela对照品溶液连续3 d同一时间进样测定，记录峰面积，测日间精密度。

2.2.6 重复性考察

称取6份Cela/GCTR胶束粉末，每份约5 mg，加蒸馏水4 mL，于冰水浴中200 W探头超声10 min使其溶解；取300 μL Cela/GCTR胶束溶液，用甲醇稀释至10 mL，14 000 r/min离心5 min，取上清液，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积，计算Cela含量（即载药量），计算RSD值。

2.2.7 加样回收率

取2.5 mg Cela/GCTR胶束粉末（Cela含量为31.84%），按Cela/GCTR胶束粉末中Cela量的50%、100%和150%，分别加入浓度为2.0 mg/mL Cela对照品溶液0.2、0.3、0.6 mL，按“2.2.3”项下方法制备成供试品溶液，每个浓度平行3份，混匀后按“2.2.1”项下色谱条件测定，计算加样回收率。

2.2.8 稳定性考察

取Cela/GCTR胶束粉末，按“2.2.3”项下方法制备成供试品溶液。取同一份供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12 h按“2.2.1”项下色谱条件进行测定含量，计算RSD值。

2.3 Cela/GCTR胶束载药量和包封率的测定

精密称取5 mg Cela/GCTR胶束粉末，加蒸馏水4 mL，于冰水浴中200 W探头超声10 min使其溶解，得Cela/GCTR胶束溶液；取300 μL Cela/GCTR胶束溶液用甲醇稀释至10 mL（使胶束结构破坏，释放出Cela），14 000 r/min离心5 min，取上清液；按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，测得的峰面积代入回归方程中，计算Cela含量。按下列公式计算Cela/GCTR胶束的载药量（DL）和包封率（EE）。

\mathrm{D}\mathrm{L}=\frac{\mathrm{胶束}\mathrm{中药}\mathrm{物的}\mathrm{量}}{\mathrm{载药}\mathrm{胶束}\mathrm{的重}\mathrm{量}}\times \mathrm{100}\%

\mathrm{E}\mathrm{E}=\frac{\mathrm{包载}\mathrm{入胶}\mathrm{束中}\mathrm{的药}\mathrm{量}}{\mathrm{投药}\mathrm{量}}\times \mathrm{100}\%

2.4 Cela/GCTR胶束粒径的测定

取Cela/GCTR胶束粉末适量，加蒸馏水溶解，配制成浓度为1 mg/mL，过0.8 μm滤膜，用动态光散射（DLS）法测定粒径及多分散系数（PDI）。

2.5 Cela/GCTR胶束冻干保护剂的筛选

在制备好的Cela/GCTR胶束溶液中，加入待考察的冻干保护剂（浓度分别为0.1%、0.2%、0.4%蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇），溶解、混匀，按1.5 mL/瓶分装，-20 ℃下预冻24 h，冷冻干燥24 h，制得Cela/GCTR胶束冻干制剂。以载药量、包封率、粒径、外观等为指标，考察各冻干保护剂对Cela/GCTR胶束的保护效果，评价指标见表1。

2.6 Cela/GCTR胶束冻干工艺验证

在Cela/GCTR胶束溶液中，加入“2.5”项下筛选得出的最佳浓度胶束冻干保护剂，充分混匀，-20 ℃下预冻24 h，冷冻干燥24 h，制得Cela/GCTR胶束冻干制剂。制备3批Cela/GCTR胶束冻干制剂进行工艺验证，根据复溶性、复溶后粒径、载药量、包封率等指标进行判定。

3 结　果

3.1 Cela的含量分析方法

3.1.1 Cela标准曲线

以峰面积A对Cela浓度C进行线性回归，得Cela含量测定的回归方程：A＝32 723 C－5 066.3（r＝1），Cela在1.5～75 μg/mL浓度范围内线性良好。

3.1.2 精密度

低、中、高3种浓度的日内精密度RSD值分别为0.15%、0.16%、1.58%，日间精密度为2.00%、0.02%、0.29%。日间RSD均≤2%，精密度良好，符合含量测定方法学要求^［12］。

3.1.3 重复性

测定同一批次6份Cela/GCTR胶束的DL平均值为32.15%，RSD＜2%。见表2。

3.1.4 加样回收率

低、中、高3个浓度的加样回收率分别为（100.44±0.54）%、（100.49±0.58）%、（100.14±0.36）%，范围在95%~105%，RSD分别是0.54%、0.58%、0.36%，表明加样回收率良好，符合含量测定方法学要求^［12］。

3.1.5 稳定性

测定结果显示RSD≤2%，说明供试品溶液在12 h内稳定。

3.2 Cela/GCTR胶束最佳冻干保护剂筛选

与未加冻干保护剂相比，分别加入4种冻干保护剂的制剂在复溶后，胶束的复溶粒径小，说明冻干保护效果较好。以葡萄糖作为冻干保护剂时，胶束的复溶性较好，具有较高的载药量和包封率，复溶粒径随葡萄糖浓度的增高而变小，但外观较差；以乳糖作为保护剂时，胶束粒径较小，载药量和包封率随浓度增大而升高，但在4种冻干保护剂中载药量和包封率均偏低，选用0.4%乳糖时冻干品外观较差；以甘露醇作为保护剂时，复溶后粒径偏大，载药量随甘露醇浓度的增大而增加，对改善冻干制剂的外观效果较好，复溶性一般；以蔗糖作为保护剂时，胶束的粒径较小，浓度对复溶性的影响较小，其中，0.2%蔗糖为保护剂时，具有较高的载药量和包封率，复溶性及复溶稳定性好。

总体来看，用浓度为0.2%蔗糖作为冻干保护剂时，冻干制剂外观色泽均匀，质地细腻，体积完整不塌陷、不皱缩，表面光洁，饱满，不散碎，复溶性好，大大改善了之前冻干制剂的缺陷，粒径为（150.47±1.07）nm，与冻干前粒径接近，并且粒径分散均匀，冻干后测得载药量为（37.7±0.03）%，包封率为（94.21±1.19）%。见表3及图1。

3.3 Cela/GCTR胶束冻干工艺验证结果

根据“3.2”项下结果选用0.2%蔗糖作为Cela/GCTR胶束冻干制剂的保护剂。Cela/GCTR胶束冻干工艺验证的结果见表4。该冻干工艺制备的Cela/GCTR胶束冻干制剂复溶后平均粒径为（150.10±1.06）nm，PDI为（0.10±0.01），测得DL为（37.89±0.26）%，EE为（94.28±1.57）%。Cela/GCTR胶束冻干后复溶性好，复溶后粒径小、载药量大、包封率高，并且具有较好的重复性，表明该冻干工艺稳定可靠。

4 讨　论

未加冻干保护剂时，Cela/GCTR胶束冻干制剂由于呈松散絮状，易飞散，在冻干压力改变时会有部分冻干的胶束损失，并且在进行载药量和包封率操作时也易产生损失，从而使冻干后的胶束载药量和包封率降低。加入冻干保护剂后改善了胶束冻干制剂的外观，也大大改善了冻干胶束易飞散的状况，从而确保载药量和包封率的准确测定。

本研究结果显示：不同种类及浓度的冻干保护剂对Cela/GCTR胶束的冻干保护作用有较大的区别，加入等量浓度的不同保护剂后，胶束冻干制剂外观差异显著。

甘露醇具有低温保护、容易成型及形成的共晶物熔化温度高等特性，还能起到填充的作用。因此，加入甘露醇的胶束冻干制剂的外观表面光洁平整、饱满、粉饼状，但复溶后粒径偏大，载药量随甘露醇浓度的增大而增加，对改善冻干制剂的外观效果较好，复溶性一般。

以葡萄糖为冻干保护剂时，胶束的复溶性较好，具有较高的载药量和包封率，复溶粒径随葡萄糖浓度的增高而变小，但外观较差，在冻干过程中样品黏度会下降，表面出现萎缩、塌陷现象。尤其是在加入高浓度葡萄糖后，样品发生塌陷，推测原因可能是葡萄糖为单糖，其体积较小，不能起到较好的间隔作用而导致外观塌陷。

乳糖和蔗糖都是双糖，本实验结果显示：二者作为冻干保护剂时，作用效果相近，冻干制剂的外观和复溶性随着加入的冻干保护剂浓度增加而变差。乳糖作为冻干保护剂时，载药量和包封率远不如蔗糖，发现选用0.4%乳糖时冻干品外观较差，胶束粒径较小，载药量和包封率随浓度增大而提高，但在4种冻干保护剂中载药量和包封率仍偏低；以蔗糖作为保护剂时，胶束的粒径较小，浓度对复溶性的影响较小，其中，0.2%蔗糖作为保护剂时，外观色泽均匀，质地细腻，体积完整不塌陷、不皱缩，表面光洁，饱满，不散碎，复溶性好，大大改善了之前的冻干制剂的缺陷，粒径与冻干前粒径接近，并且粒径分散均匀，冻干后的载药量和包封率较高，复溶性及复溶稳定性好。

与未加冻干保护剂相比，加入各冻干保护剂的制剂在复溶后，胶束的复溶粒径小，说明冻干保护效果较好。综合考虑复溶后粒径、载药量、包封率、冻干后的外观与复溶性，最终选择0.2%蔗糖作为冻干保护剂，所制成的Cela/GCTR胶束冻干后复溶性好，复溶后粒径小，载药量大、包封率高，并且具有较好的重复性，从而为Cela/GCTR胶束的应用奠定了冻干制剂的制备基础。

参考文献

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基金资助

福建省科技厅引导性项目(2020Y0050)