基于网络药理学和分子对接技术探讨姜黄素治疗溃疡性结肠炎的分子作用机制

摘要

目的 基于网络药理学和分子对接技术探讨姜黄素治疗溃疡性结肠炎（UC）的分子作用机制。 方法 通过TCMSP和Swiss Target Prediction数据库获取姜黄素作用靶点，GeneCards和TTD数据库检索UC疾病靶点，并通过Sangerbox网站获得姜黄素治疗UC的共同靶点；利用R软件包clusterProfile将共同靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析；通过STRING网站构建蛋白质相互作用（PPI）网络，设置中介中心性＞30以及度值＞30作为筛选条件筛选姜黄素治疗UC的核心靶点；使用ActoDock Vina软件将核心靶点与姜黄素进行分子对接，并利用PyMOL软件进行可视化处理。 结果 通过网络数据库挖掘获得UC疾病靶点2 088个，姜黄素作用靶点69个，取交集后得到姜黄素治疗UC共同靶点29个。通过GO功能富集分析可知其涉及的生物过程（BP）共539个，包括化学反应、应激反应、细胞蛋白质代谢过程的调节、防御反应、炎症反应等；细胞组成（CC）16条，包括细胞溶胶、内质网系统、全膜、细胞质囊泡部分、神经元部分等；分子功能（MF）31条，包括催化活性、磷酸转移酶活性、激酶活性、蛋白激酶活性、蛋白磷酸酶结合等。KEGG通路富集分析得到32条信号通路，主要富集在癌症途径、HIF-1信号通路、表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂耐药性、前列腺癌、胰腺癌、结直肠癌、癌症中PD-L1的表达和PD-L1检查点通路、内分泌抵抗等。筛选得到5个姜黄素治疗UC核心靶点：表皮生长因子受体（EGFR）、前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）、蛋白激酶B（Akt1）、信号转导及转录激活因子3（STAT3）、B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）。分子对接结果显示：姜黄素与上述5个核心靶点蛋白均对接良好，其中与STAT3结合能最低为-6.7 kcal/mol。 结论 姜黄素可能通过核心靶点EGFR、PTGS2、Akt1、STAT3、Bcl-2和癌症途径、HIF-1、表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂耐药性等信号通路对化学反应、应激反应、细胞溶胶、内质网系统、催化活性、磷酸转移酶活性等生物学过程进行调控，从而发挥对UC的治疗作用。

Graphical abstract

关键词

溃疡性结肠炎 / 分子机制 / 分子对接 / 网络药理学

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是以直肠、结肠为主要病理特征的慢性炎症性疾病。2023年，全世界UC患病率达到500万例，且呈逐年增加的趋势^［1］，其发病机制主要是肠黏膜屏障功能障碍、遗传易感性、免疫应答紊乱等^［2］。尽管抗UC的药物种类日益增多，但仍有10%~20% UC患者经药物治疗不能有效缓解病情，而不得不通过手术切除治疗^［3-4］。

近年来，中药治疗UC表现出良好疗效。姜黄作为一种被广泛研究的药用植物，可应用于呼吸道感染、关节炎、癌症等疾病^［5-6］。姜黄素（curcumin）是姜黄属植物中多酚类化合物，具有抗炎、抗氧化及抗肿瘤作用^［7-8］。姜黄素作为UC的辅助用药^［9-10］，可用于维持UC的缓解^［11］。已有研究发现姜黄素能够减轻肠道组织的损伤，阻止肠上皮细胞的凋亡，促进有丝分裂原激活蛋白激酶的免疫应答^［12-13］。但由于UC的发病机制复杂，姜黄素UC中的调控机制仍未完全阐明。因此，本研究基于网络药理学和分子对接技术探讨姜黄素治疗UC的分子作用机制，为开发新型抗UC药物提供新思路。

1 实验方法

1.1 筛选UC疾病靶点

利用GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）和TTD数据库（http：//db.idrblab.net/ttd/），以“ulcerative colitis”为关键词进行检索获得疾病靶点；筛选GeneCards数据库中“relevance score”≥2的靶点基因^［14］。将2个数据库中的靶点合并，删除重复值，获得UC疾病靶点。

1.2 筛选姜黄素作用靶点

将姜黄素英文名称“curcumin”输入TCMSP数据库（https：//www.tcmsp-e.com/tcmsp.php）进行检索，收集到5个姜黄素作用靶点；利用Uniprot网站（https：//www.uniprot.org/）对所有靶点进行标准化转换，得到目的靶点名称；将“curcumin”输入PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获得姜黄素的2D化学结构及SMILES号，将姜黄素SMILE号上传至Swiss Target Prediction数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch/），选择物种为“homo sapiens”，获得姜黄素作用靶点，并从中筛选出可能性（probability）大于0的靶点^［15-16］。

1.3 筛选姜黄素治疗UC的共同靶点

将UC疾病靶点和姜黄素作用靶点导入Sangerbox网站（http：//vip.sangerbox.com/home.html），即可获得姜黄素治疗UC的共同靶点。

1.4 GO功能富集分析

使用R软件包org.Hs.eg.db（version 3.1.0）中的GO注释，以此作为背景，将共同靶点映射到背景集合中，并使用R软件包clusterProfiler（version 3.14.3）进行GO功能富集分析；设定最小基因集为5，最大基因集为5 000，P＜0.001和错误发现率＜0.1作为筛选条件，选择排名前10的GO生物功能，使用Sangerbox网站在线绘制气泡图。

1.5 KEGG通路富集分析

使用KEGG REST API（https：//www.kegg.jp/kegg/rest/keggapi.html）获取最新的基因注释，以此作为背景，将共同靶点映射到背景集合中，使用R软件包clusterProfiler（version 3.14.3）进行KEGG通路富集分析；设定最小基因集为5，最大基因集为5 000，P＜0.001和错误发现率＜0.1作为筛选条件，选择排名前10的通路，使用Sangerbox网站在线绘制气泡图。

1.6 构建靶点相互作用（PPI）网络

将姜黄素治疗UC的共同靶点导入STRING（https：//cn.string-db.org/cgi/input），设定物种为“homo sapiens”，设定置信度＞0.9，隐藏PPI网络中游离基因，导出靶点相互作用关系的信息文件^［17］，通过Cytoscape 3.9.1软件绘制PPI网络图；设置中介中心性＞30，度值＞30来筛选核心靶点。

1.7 分子对接分析及可视化

将PPI网络中筛选出的核心靶点对应的蛋白结构（即核心靶蛋白）与姜黄素进行分子对接分析。从Protein Data Bank（PDB）数据库（https：//www.rcsb.org/）中下载核心靶点对应蛋白3D结构，利用AutoDock Vina进行分子对接分析，蛋白的结合能＜-5 kcal/mol表明该蛋白与化合物具有一定的结合活性^［18］，利用PyMOL软件进行可视化分析。

3 结　果

3.1 姜黄素治疗UC的作用靶点

GeneCards和TTD数据库筛选并去重后，共计得到2 088个UC疾病靶点；采用TCMSP和Swiss Target Prediction数据库检索并去重后，共计得到69个姜黄素的作用靶点。将UC疾病靶点与姜黄素作用靶点取交集，得到姜黄素治疗UC的共同靶点29个，见表1。

3.2 GO功能富集分析

GO功能富集分析显示：共同靶点涉及的生物过程（biological process，BP）539个，包括化学反应、应激反应、细胞蛋白质代谢过程的调节、防御反应、炎症反应等；细胞组分（cellular component，CC）16个，包括细胞溶胶、内质网系统、全膜、细胞质囊泡部分、神经元部分等；分子功能（molecular function，MF）31个，包括催化活性、磷酸转移酶活性、激酶活性、蛋白激酶活性、蛋白磷酸酶结合等。分别取排名前10的富集结果进行可视化，见图1。

3.3 KEGG通路富集分析

KEGG通路富集分析发现共同靶点富集的通路有32条，其中，将排名前10条富集通路进行可视化分析，主要包括癌症途径、HIF-1信号通路、表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂耐药性、前列腺癌、胰腺癌、结直肠癌、癌症中PD-L1的表达和PD-L1检查点通路、内分泌抵抗等通路，见图2。

3.4 蛋白质相互作用（PPI）结果图

通过构建共同靶点PPI网络图，得到29个节点，117条相互作用关系，根据中介中心性值＞30以及度值＞30作为筛选条件，获得姜黄素治疗UC核心靶点，分别为EGFR、PTGS2、Akt1、STAT3、Bcl-2，见图3、表2。

3.5 分子对接分析

核心靶蛋白与姜黄素的分子对接结果见表3和图4，其中姜黄素与STAT3的结合度最强，与Akt1的结合度较弱。

4 讨　论

姜黄素治疗UC疗效确切，但其疗效机制尚不明确，因此，本研究基于网络药理学和分子对接技术探究姜黄素治疗UC的作用机制。GO功能富集分析结果显示：姜黄素治疗UC涉及的生物进程包括化学反应、防御反应、炎症反应等过程；细胞组分包括细胞溶胶、内质网系统、全膜、细胞质囊泡等；分子功能包括催化反应、磷酸转移酶活性、激酶活性、蛋白磷酸酶结合等。这些结果表明姜黄素可能能够通过细胞质囊泡介导中性粒细胞、巨噬细胞等免疫细胞，抑制信号通路的磷酸化，调节细胞自噬、凋亡，从而发挥抗UC作用^［19-20］。KEGG通路富集分析发现：姜黄素抗UC可能通过癌症途径、HIF-1信号通路、表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂耐药性等通路发挥作用。

本研究通过中介中心性和度值筛选获得姜黄素治疗UC的核心靶点为EGFR、PTGS2、Akt1、STAT3、Bcl-2。分子对接中结合能＜-5 kcal/mol被认为有利于配体与靶点之间结合，结合能越低代表两者对接活性越强^［18］。分子对接结果表明：姜黄素与STAT3的结合度最强，与Akt1的结合度较弱，其中，EGFR、PTGS2、STAT3可作为关键因子参与炎症反应^［21-23］。已有报道显示EGFR参与UC癌变^［24］，同时参与细胞分化、迁移、黏附等过程，对于维持组织完整性至关重要^［25］。UC的发生过程涉及肠道黏膜的损伤与修复，提示EGFR可能通过影响肠道细胞的正常生长和分化，间接影响UC的发生和发展^［26］。并且，在DSS模型小鼠结肠组织中STAT3阳性表达增加，表明STAT3信号异常激活时能促进肠道炎症发生和组织损伤^［27］。而Akt1、Bcl-2作为细胞凋亡过程中的关键基因，同样可影响UC症状的严重程度^［28-29］。Akt1异常活化能够促进肠道细胞的异常增殖或凋亡，从而间接影响UC的发生与发展^［30］。研究发现UC活动期肠黏膜固有层炎症细胞中Bcl-2的表达水平相对较高，但在缓解期组与正常对照组之间差异无统计学意义^［31-32］。在UC活动期，随着肠道炎症的加剧，Bcl-2的表达增加有助于抑制细胞凋亡，维持肠道黏膜的完整性^［33］。

综上所述，姜黄素对于UC的疗效可能主要通过EGFR、PTGS2、Akt1、STAT3、Bcl-2介导的防御反应、炎症反应、HIF-1信号通路以及表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂耐药性等发挥对UC的治疗作用。

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基金资助

福建省高校产学研联合创新项目(2023N5012)

国家青年科学基金项目(82405173)