黄芩黄酮类化合物体外神经保护活性研究

摘要

目的 探究黄芩黄酮类化合物抗神经炎症和抗氧化损伤的神经保护活性作用及可能机制。方法选取黄芩素、汉黄芩素、黄芩素-7-甲醚、野黄芩素、芹菜素、黄芩苷、汉黄芩苷、野黄芩苷、白杨素、千层纸素A共10种黄芩黄酮类化合物进行研究。（1）抗神经炎症活性研究：CCK-8法检测0、1.25、2.5、5、10、20μmol/L黄酮类化合物对BV2细胞抑制率的影响，并通过非线性回归分析计算半数抑制浓度(IC₅₀)值。将BV2细胞分成对照组、LPS模型组和不同浓度黄酮类化合物给药组，对照组和LPS模型组加入无血清DMEM高糖培养基；各给药组加入含1.25、2.5、5、10、20μmol/L黄酮类化合物的无血清DMEM高糖培养基，干预4 h。干预结束后，LPS模型组和各给药组加入1μg/mL LPS溶液，培养24 h以建立神经炎症模型。Griess法检测7组BV2细胞培养液NO含量，计算药物抗炎抑制率，并通过非线性回归分析计算IC₅₀值。（2）抗氧化损伤活性研究：CCK-8法检测0、1.25、2.5、5、10、20μmol/L黄酮类化合物对SH-SY5Y细胞抑制率的影响，并通过非线性回归分析计算IC₅₀值。将SH-SY5Y细胞分成对照组、H₂O₂模型组和不同浓度黄酮类化合物给药组，对照组和H₂O₂模型组加入无血清MEM/F12培养基；各给药组加入含1.25、2.5、5、10、20μmol/L黄酮类化合物的无血清MEM/F12培养基，干预4 h。干预结束后，H₂O₂模型组和各给药组加入200μmol/mL H₂O₂溶液，刺激4 h以建立氧化损伤模型。CCK-8法检测7组SH-SY5Y细胞存活率，并通过非线性回归分析计算半数效应浓度(EC₅₀)值。（3）最佳黄酮类化合物神经保护作用机制研究：根据实验结果筛选出抑制神经炎症和抗氧化应激损伤活性最佳的黄酮类化合物，将细胞分成对照组、H₂O₂模型组和不同浓度最佳黄酮类化合物给药组。对照组和H₂O₂模型组加入无血清MEM/F12培养基，各给药组每孔加入含5、10、20μmol/L的不同浓度最佳黄酮类化合物的无血清MEM/F12培养基干预4 h。干预结束后，H₂O₂模型组和各给药组加入200μmol/mL H₂O₂溶液刺激4 h。Western blot检测SH-SY5Y细胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、磷脂酰肌醇3激酶p85α亚基（PI3K p85α）、磷酸化PI3K（p-PI3K）、蛋白激酶B（Akt）、磷酸化Akt（p-Akt）蛋白表达量。结果 （1）抗神经炎症活性研究结果：1.25～20μmol/L浓度梯度的各黄酮类化合物对BV2细胞没有明显细胞毒性。与对照组比较，LPS模型组NO含量明显升高（P<0.05）；与模型组比较，10个黄酮类化合物不同浓度给药组的细胞培养液中NO含量均明显降低（P<0.05），其中以野黄芩素抑制神经炎症效果较好，且呈浓度依赖性趋势（P<0.05）。（2）抗氧化损伤活性研究结果：1.25～20μmol/L浓度梯度的各黄酮类化合物作用于SH-SY5Y细胞，基本不存在细胞毒性；汉黄芩素、芹菜素、千层纸素A对H₂O₂诱导的SH-SY5Y细胞不具有减弱氧化应激损伤的作用，而野黄芩素对H₂O₂诱导的SH-SY5Y细胞减弱氧化应激损伤的效果最好。与对照组比较，H₂O₂模型组细胞存活率明显降低（P<0.05）；与H₂O₂模型组比较，除芹菜素和千层纸素A外，其余黄酮类化合物不同浓度给药组细胞存活率明显升高（P<0.05），其中以野黄芩素抑制氧化损伤效果较好，且呈浓度依赖性趋势（P<0.05）。（3）野黄芩素神经保护作用机制研究结果：与对照组比较，H₂O₂模型组Caspase-3蛋白表达量明显升高（P<0.05）,Bcl-2/Bax、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt均明显降低（P<0.05）,PI3K、Akt蛋白表达量差异均无统计学意义（P>0.05）；与H₂O₂模型组比较，10、20μmol/L组Caspase-3蛋白表达量均明显降低（P<0.05）,Bcl-2/Bax、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt均明显升高（P<0.05），各浓度组PI3K、Akt蛋白表达量差异均无统计学意义（P>0.05）。结论 多种黄芩黄酮化合物均具有较好抗神经炎症和抗氧化损伤的神经保护活性，其中野黄芩素的活性最强。野黄芩素神经保护活性的作用机制可能是通过调控PI3K/Akt和Caspase-3/Bcl-2/Bax信号通路，减轻炎症反应和氧化应激损伤，抑制神经细胞凋亡，从而发挥神经保护作用。

关键词

神经退行性疾病 / 神经炎症 / 黄芩 / 黄酮类化合物 / 类黄酮 / 氧化应激 / 神经保护