钩藤碱通过调控STAT3信号通路抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞肥大

Rhynchophylline Inhibits Angiotensin Ⅱ-Induced Cardiomyocyte Hypertrophy by Regulating STAT3 Signaling Pathway

摘要

目的 基于STAT3信号通路探讨钩藤碱（Rhy）抑制血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）诱导心肌细胞肥大的作用机制。 方法 从1～2日龄的新生SD大鼠乳鼠心脏组织中提取新生大鼠心肌细胞（NRCMs）。CCK-8法检测0、2、10、20、40、80 μmol/L Rhy对NRCMs细胞活力的影响，结果显示40 μmol/L Rhy为最佳干预浓度。Western blot检测AngⅡ不同刺激时间（0、0.5、1、2、4、6、12、24 h）对NRCMs信号转导与转录激活因子3（STAT3）和p-STAT3核蛋白和总蛋白表达量的影响。采用AutoDock Vina V1.2.x软件进行分子对接确认Rhy和STAT3的结合力。将NRCMs分为4组，① 对照组：正常培养基培养；② AngⅡ组：含1 μmol/L AngⅡ的培养基培养；③ Rhy组：含40 μmol/L Rhy的培养基培养；④ AngⅡ＋Rhy组：含1 μmol/L AngⅡ和40 μmol/L Rhy的培养基培养。将NRCMs分为5组，① 对照组：正常培养基培养；② AngⅡ组：含1 μmol/L AngⅡ的培养基培养；③ Ang Ⅱ＋Rhy组：含1 μmol/L AngⅡ和40 μmol/L Rhy的培养基培养；④ AngⅡ＋S3I-201组：含1 μmol/L AngⅡ和10 μmol/L S3I-201的培养基培养；⑤ Ang Ⅱ＋S3I-201＋Rhy组：含1 μmol/L AngⅡ、40 μmol/L Rhy和10 μmol/L S3I-201的培养基培养。免疫荧光法检测心肌肌钙蛋白T（cTnT）蛋白表达；qPCR检测心房利钠肽（ANP）、脑钠肽（BNP）、胶原蛋白Ⅰ（Collagen Ⅰ）、转化生长因子-β1（TGF-β1） mRNA相对表达水平；Western blot检测p-STAT3、STAT3核蛋白表达量和p-STAT3、STAT3、TGF-β1总蛋白表达量。 结果 AngⅡ不同刺激时间干预NRCMs结果显示：与0 h组比较，6、12、24 h组p-STAT3核蛋白相对表达量均明显升高（P＜0.05），2、4、6、12 h组STAT3核蛋白相对表达量均明显升高（P＜0.05）；4、6、12、24 h组p-STAT3总蛋白相对表达均量明显升高（P＜0.05）。分子对接结果显示：STAT3和Rhy的最佳构象结合能为-7.3 kcal/mol。该构象含有精氨酸518、丝氨酸521、谷氨酸524共3个氢键结合位点，其中丝氨酸521结合的氢键长度为2.2 Å，属于强氢键范围（2.2～2.5 Å），可能显著降低复合物的解离速率。4组分组结果：与对照组比较，AngⅡ组免疫荧光面积明显增大（P＜0.05），ANP、BNP、CollagenⅠ、TGF-β1 mRNA相对表达水平均明显升高（P＜0.05），p-STAT3和STAT3核蛋白相对表达量均明显升高（P＜0.05），p-STAT3和TGF-β1总蛋白相对表达量均明显升高（P＜0.05）；Rhy组免疫荧光面积，ANP、BNP、Collagen Ⅰ、TGF-β1 mRNA相对表达水平，p-STAT3、STAT3核蛋白相对表达量和p-STAT3、STAT3和TGF-β1总蛋白相对表达量差异均无统计学意义（P＞0.05）。与AngⅡ组比较，AngⅡ＋Rhy组免疫荧光面积明显减小（P＜0.05），ANP、BNP、Collagen Ⅰ、TGF-β1 mRNA相对表达水平均明显降低（P＜0.05），p-STAT3和STAT3核蛋白相对表达量均明显降低（P＜0.05），p-STAT3和TGF-β1总蛋白相对表达量均明显降低（P＜0.05）。5组分组结果：与对照组比较，AngⅡ组免疫荧光面积明显增大（P＜0.05），ANP、BNP、CollagenⅠ、TGF-β1 mRNA相对表达水平均明显升高（P＜0.05），p-STAT3和STAT3核蛋白相对表达量均明显升高（P＜0.05），p-STAT3和TGF-β1总蛋白相对表达量均明显升高（P＜0.05）；与AngⅡ组比较，AngⅡ＋Rhy组、AngⅡ＋S3I-201组、AngⅡ＋S3I-201＋Rhy组免疫荧光面积均明显减小（P＜0.05），ANP、BNP、Collagen Ⅰ、TGF-β1 mRNA相对表达水平均明显降低（P＜0.05），p-STAT3和STAT3核蛋白相对表达量均明显降低（P＜0.05），p-STAT3和TGF-β1总蛋白相对表达量均明显降低（P＜0.05）；与AngⅡ＋S3I-201组比较，AngⅡ＋S3I-201＋Rhy组免疫荧光面积，ANP、BNP、Collagen Ⅰ、TGF-β1 mRNA相对表达水平，p-STAT3和STAT3核蛋白相对表达量和p-STAT3和TGF-β1总蛋白相对表达量差异均无统计学意义（P＞0.05）。 结论 Rhy可通过抑制STAT3信号通路阻止Ang Ⅱ诱导的NRCMs细胞肥大。

Abstract

Objective To investigate the mechanism of Rhynchophylline (Rhy) in inhibiting angiotensin Ⅱ (AngⅡ)-induced cardiomyocyte hypertrophy by regulating the signal transduction and transcription activator 3 (STAT3) signaling pathway. Methods Neonatal rat cardiomyocytes (NRCMs) were extracted from the heart tissue of 1- to 2-day-old newborn SD rats. The CCK-8 method was used to detect the cell viability of NRCMs intervened with 0, 2, 10, 20, 40, and 80 μmol/L Rhy, and the results showed that 40 μmol/L Rhy was the optimal intervention concentration. Western blot was used to detect the effects of different stimulation times (0, 0.5, 1, 2, 4, 6, 12, 24 h) of AngⅡ on the nuclear and total protein expression levels of NRCMs STAT3 and pSTAT3. AutoDock Vina V1.2.x software was used for molecular docking to confirm the binding affinity between Rhy and STAT3. NRCMs were divided into 4 groups: 1) the control group was cultured in normal medium; 2) the AngⅡ group was cultured in medium containing 1 μmol/L AngⅡ; 3) the Rhy group was cultured in medium containing 40 μmol/L Rhy; 4) the AngⅡ + Rhy group was cultured in medium containing 1 μmol/L AngⅡ and 40 μmol/L Rhy. A separate experiment of NRCMs was divided into 5 groups: 1) the control group was cultured in normal medium; 2) the AngⅡ group was cultured in medium containing 1 μmol/L AngⅡ; 3) the AngⅡ + Rhy group was cultured in medium containing 1 μmol/L AngⅡ and 40 μmol/L Rhy; 4) the AngⅡ + S3I-201 group was cultured in medium containing 1 μmol/L AngⅡ and 10 μmol/L S3I-201; 5) the AngⅡ + S3I-201 + Rhy group was cultured in medium containing 1 μmol/L AngⅡ, 40 μmol/L Rhy, and 10 μmol/L S3I-201. Immunofluorescence was applied to detect the expression of cardiac troponin T (cTnT) protein; qPCR was applied to detect the relative mRNA expression levels of atrial natriuretic peptide (ANP), brain natriuretic peptide (BNP), Collagen Ⅰ, and transforming growth factor-β1 (TGF-β1); Western blot was applied to detect the nuclear protein expression levels of pSTAT3 and STAT3, as well as the total protein expression levels of p-STAT3, STAT3, and TGF-β1. Results Intervention of NRCMs with AngⅡ at different time showed that, compared with the 0 h group, the expression levels of nuclear protein p-STAT3 increased significantly in the 6, 12, and 24 h groups (P<0.05); the nuclear protein expression levels of STAT3 increased significantly in the 2, 4, 6, and 12 h groups (P<0.05); the total protein expression levels of p-STAT3 increased significantly in the 4, 6, 12, and 24 h groups (P<0.05). Molecular docking results showed that the binding energy of the optimal conformation between STAT3 and Rhy was -7.3 kcal/mol. This conformation contained three hydrogen bond binding sites: arginine 518, serine 521, and glutamic acid 524. The hydrogen bond length with serine 521 was 2.2 Å, which falls within the range of strong hydrogen bonds (2.2-2.5 Å) and may significantly reduce the dissociation rate of the complex. In the 4-group experiment: compared with the control group, the AngⅡ group showed a significant increase in immunofluorescence area (P<0.05), a significant increase in mRNA expression levels of ANP, BNP, Collagen Ⅰ, and TGF-β1 (P<0.05), a significant increase in nuclear protein expression levels of p-STAT3 and STAT3 (P<0.05), and a significant increase in total protein expression levels of p-STAT3 and TGF-β1 (P<0.05). No statistically significant differences were found in the Rhy group compared to the control group regarding immunofluorescence area, mRNA expression levels of ANP, BNP, Collagen Ⅰ, and TGF-β1, nuclear protein expression levels of p-STAT3 and STAT3, and total protein expression levels of p-STAT3 and TGF-β1 (P>0.05). Compared with the AngⅡ group, the AngⅡ + Rhy group showed a significant reduction in immunofluorescence area (P<0.05), a significant decrease in mRNA expression levels of ANP, BNP, Collagen Ⅰ, and TGF-β1 (P<0.05), a significant decrease in nuclear protein expression levels of p-STAT3 and STAT3 (P<0.05), and a significant decrease in total protein expression levels of p-STAT3 and TGF-β1 (P<0.05). In the 5-group experiment: compared with the control group, the AngⅡ group showed a significant increase in immunofluorescence area (P<0.05), a significant increase in mRNA expression levels of ANP, BNP, Collagen Ⅰ, and TGF-β1 (P<0.05), a significant increase in nuclear protein expression levels of p-STAT3 and STAT3 (P<0.05), and a significant increase in total protein expression levels of p-STAT3 and TGF-β1 (P<0.05). Compared with the AngⅡ group, the AngⅡ + Rhy, AngⅡ + S3I-201, and AngⅡ + S3I-201 + Rhy groups all showed a significant reduction in immunofluorescence area (P<0.05), a significant decrease in mRNA expression levels of ANP, BNP, Collagen Ⅰ, and TGF-β1 (P<0.05), a significant decrease in nuclear protein expression levels of p-STAT3 and STAT3 (P<0.05), and a significant decrease in total protein expression levels of p-STAT3 and TGF-β1 (P<0.05). Compared with the AngⅡ + S3I-201 group, the AngⅡ + S3I-201 + Rhy group showed no statistically significant differences in immunofluorescence area, mRNA expression levels of ANP, BNP, Collagen Ⅰ, and TGF-β1, nuclear protein expression levels of p-STAT3 and STAT3, and total protein expression levels of p-STAT3 and TGF-β1 (P>0.05). Conclusion Rhy can prevent AngⅡ-induced hypertrophy in NRCMs by inhibiting the STAT3 signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

心肌细胞肥大 / 钩藤碱 / 血管紧张素Ⅱ / 信号转导与转录激活因子3 / 心肌细胞

Key words

cardiomyocyte hypertrophy / Rhynchophylline angiotensin Ⅱ / signal transducer and activator of transcription 3 / cardiomyocyte

心肌肥大是心肌细胞在压力或容量超负荷以及神经体液因子刺激下所产生的一种适应性代偿反应^［1］。在代偿反应初期心肌肥大可维持心脏功能，但长期持续刺激会激活胚胎基因诱发纤维化，进而发展为病理性心肌肥大，最终导致心腔扩张和心力衰竭^［2］。因此病理性心肌肥大是心血管疾病中独立的危险因素之一，可显著提高心血管疾病的发病率与病死率。血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，AngⅡ）是肾素-血管紧张素-醛固酮系统（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）在调节血压、促进电解质平衡、诱导心脏重构和心肌肥厚等生理、病理过程中发挥关键作用的重要生物活性肽^［3］。信号转导与转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）在细胞信号传导和基因表达调控中发挥着核心作用，AngⅡ诱导的STAT3信号通路过度激活与病理性心肌肥大密切相关^［4-5］。研究表明：AngⅡ能促进心肌细胞产生白细胞介素-6（IL-6），进而通过IL-6/GP130/JAK2信号通路诱导STAT3激活，从而导致心脏重塑^［6］。另有研究表明：通过靶向结合STAT3阻止其入核发挥转录作用，能够显著减弱AngⅡ诱导的病理性心肌肥大^［7］。鉴于STAT3信号通路在病理性心肌肥大中的关键调控作用，靶向抑制STAT3的机制研究和药物研发具有重要的临床意义。钩藤碱（Rhynchophylline，Rhy）是中药钩藤的主要活性成分，具有降血压及神经保护作用^［8］。Rhy还能抑制Ang Ⅱ诱导的心肌细胞肥大^［9］，但其具体机制尚不明确。因此，本研究拟从STAT3信号通路调控的角度，探讨Rhy抑制Ang Ⅱ诱导心肌细胞肥大的分子机制，以期为临床治疗提供实验依据和潜在靶点。

1 实验材料

1.1 实验细胞

从1～2日龄的新生SD大鼠乳鼠（厦门福德鑫生物科技有限公司）心脏组织中提取新生大鼠心肌细胞（NRCMs）。

1.2 实验药物

AngⅡ（货号：HY-13948）购自美国MCE公司，用PBS溶液配置成AngⅡ溶液。Rhy（货号：HY-N0387）购自美国MCE公司，用二甲基亚砜（DMSO）溶解并配制成80 mmol/L Rhy母液，经PBS溶液稀释成相应浓度后用于细胞实验。STAT3抑制剂（S3I-201）（货号：HY-15146）购自美国MCE公司，经PBS溶液溶解现配现用。

1.3 实验试剂

NP-40裂解液（货号：P0013F）、BCA蛋白定量试剂盒（货号：P0011）均购自上海碧云天生物技术有限公司；细胞核和细胞质提取试剂（美国Thermo Fisher公司，货号：78835）；胎牛血清（批号：10091148）、2.5%胰蛋白酶（批号：15090046）均购自美国Gibco公司；Triton X-100（货号：A110694）、牛血清白蛋白（货号：A600332）均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；RNAiso Plus（货号：9109）、PrimeScript^TM RT reagent Ki试剂盒（货号：RR047A）、TB Green^® Premix Ex Taq^TM（货号：RR420A）均购自日本Takara公司；CCK-8试剂（美国APExBio公司，货号：K1018）；4%多聚甲醛（北京兰杰柯科技有限公司，批号：24109404）；Alexa Fluor 647（美国Abcam公司，货号：ab150115）；心肌肌钙蛋白T（cardiac troponin T，cTnT）抗体（美国Sigma公司，货号：SAB 5702554）；STAT3抗体（货号：9139）、p-STAT3抗体（货号：9131）、GAPDH抗体（货号：97166）、TBP抗体（货号：44059）、转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）抗体（货号：3711）均购自美国CST公司。

1.4 实验仪器

转印系统（型号：Mini-PROTEAN^® Tetra System）、PCR仪（型号：C1000 Touch^TM）、成像系统（型号：ChemiDoc^TM MP）均购自美国Bio-Rad公司；Real Time System扩增仪（型号：Thermal Cycler Dice^TM）、酶标仪（型号：Multiskan^TM FC）、培养箱（型号：Forma^TM）均购自美国Thermo Fisher公司；共聚焦显微镜（美国Leica公司，型号：STELLARIS）。

2 实验方法

2.1 NRCMs提取及培养

剪取乳鼠心脏组织后使用0.1%胰蛋白酶在磁力搅拌器中消化组织块，通过差速贴壁法分离细胞。收集未贴壁细胞，即原代心肌细胞，以适当密度接种于含10%胎牛血清的低糖培养基中，置于5% CO₂、37 ℃培养箱中培养。

2.2 CCK-8法检测不同浓度Rhy对NRCMs细胞活力的影响

将NRCMs接种于96孔板中，在外围孔中添加100 μL PBS形成湿度屏障，将细胞分为不同浓度Rhy给药组，分别加入0、2、10、20、40、80 μmol/L Rhy，置于5% CO₂、37 ℃培养箱中培养24 h。干预结束后用培养基将CCK-8溶液稀释10倍，替换各孔中的液体，避光培养2 h后，采用酶标仪在450 nm波长处测定各孔样本的吸光度，并计算细胞活力。结果显示：与0 μmol/L组比较，80 μmol/L组细胞活力明显降低（P＜0.05），见图1。因此，本研究采用40 μmol/L Rhy进行后续实验。

2.3 分子对接

应用Auto Dock Tools 1.5.7软件对STAT3蛋白（PDB数据库ID：00006qhd）进行去除水分子、加氢、优化电荷等操作，对Rhy小分子（TCMSP数据库ID：MOL008469）进行加氢、优化电荷等操作。以STAT3蛋白为中心，确定网格箱（Grid Box）大小，运行AutoDock Vina V1.2.x软件计算两者自由结合能，最后应用Pymol软件对所得数据进行分析。

2.4 分组与干预

将NRCMs分为4组。① 对照组：正常培养基培养；② AngⅡ组：含1 μmol/L AngⅡ的培养基培养；③ Rhy组：含40 μmol/L Rhy的培养基培养；④ AngⅡ＋Rhy组：含1 μmol/L AngⅡ和40 μmol/L Rhy的培养基培养。

将NRCMs分为5组。① 对照组：正常培养基培养；② AngⅡ组：含1 μmol/L AngⅡ的培养基培养；③ Ang Ⅱ＋Rhy组：含1 μmol/L AngⅡ和40 μmol/L Rhy的培养基培养；④ AngⅡ＋S3I-201组：含1 μmol/L AngⅡ和10 μmol/L S3I-201的培养基培养；⑤ Ang Ⅱ＋S3I-201＋Rhy组：含1 μmol/L AngⅡ、40 μmol/L Rhy和10 μmol/L S3I-201的培养基培养。每组实验重复3次确保实验可重复性。

2.5 免疫荧光法检测cTnT蛋白表达

将NRCMs接种于免疫荧光皿中，按“2.4”项下分组和干预方法干预24 h。用4%多聚甲醛固定15 min，洗涤后用0.25% Triton X-100通透5 min，然后用5%牛血清白蛋白封闭1 h。封闭完成后用cTnT抗体（1∶400）孵育过夜，经洗涤后使用Alexa Fluor 647抗体孵育1 h，最后用含DAPI封片液进行封片并在共聚焦显微镜下观察和拍照。所得图像中蓝色荧光显示细胞核，绿色荧光显示cTnT蛋白代表细胞质区域，应用Analyzing digital images软件计算绿色荧光面积。

2.6 qPCR检测ANP、BNP、Collagen Ⅰ、TGF-β1 mRNA相对表达水平

按“2.4”项下分组和干预方法干预24 h，使用RNAiso试剂提取细胞RNA，并用RT reagent Ki试剂盒进行DNA消除和逆转录反应。首先配置A液（5 μL TB Green、2.4 μL超纯水、0.1 μL样品DNA）和B液（0.5 μL前引物、0.5 μL后引物、1.5 μL超纯水），在384孔板中先后加入A液和B液，然后在扩增仪上进行反应，设置程序：① 95 ℃，30 s；② 重复40次：95 ℃，5 s；60 ℃，30 s；③ 95 ℃ 15 s；④ 4 ℃保存。反应结束后确认扩增曲线和熔解曲线，获得各样品扩增过程中循环数（Ct），2^-ΔΔCt法计算相对表达量。引物序列见表1。

2.7 Western blot检测STAT3、p-STAT3、TGF-β1蛋白表达量

① 按“2.4”项下分组和干预方法干预12 h；② 将提取的NRCMs在5% CO₂、37 ℃培养箱中培养24 h后，分别给予1 μmol/L AngⅡ不同时间刺激（0、0.5、1、2、4、6、12、24 h）。分别检测上述细胞STAT3、p-STAT3核蛋白表达量和STAT3、p-STAT3、TGF-β1总蛋白表达量。应用NP-40裂解液提取NRCMs总蛋白，应用细胞核提取试剂提取NRCMs核蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。定量后的蛋白加入上样缓冲液，并使用10% SDS-PAGE分离胶分离蛋白样品，使用湿转法将蛋白样品转移到0.22 μm PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温下封闭2 h。洗涤后置于p-STAT3（1∶1 000）、STAT3（1∶1 000）、TGF-β1（1∶1 000）、TBP（1∶1 000）和GAPDH（1∶800）一抗中4 ℃孵育过夜，洗涤后置于对应种属二抗（1∶5 000）中孵育1～2 h，最后通过化学发光法检测目的蛋白表达水平。

2.8 统计学方法

应用GraphPad Prism 9.5.0软件进行数据分析。定量资料服从正态分布以（\overline{x}±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，若方差齐，两两比较采用Turkey's HSD事后检验；若方差不齐则采用Games-Howell检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结　果

3.1 不同刺激时间Ang Ⅱ对NRCMs细胞p-STAT3、STAT3蛋白相对表达量的影响

与0 h组比较，6、12、24 h组p-STAT3核蛋白相对表达量均明显升高（P＜0.05），2、4、6、12 h组STAT3核蛋白相对表达量均明显升高（P＜0.05）；4、6、12、24 h组p-STAT3总蛋白相对表达量均明显升高（P＜0.05）。见图2、图3。

3.2 Rhy与STAT3分子对接结果

结果显示STAT3和Rhy的最佳构象结合能为-7.3 kcal/mol。该构象含有精氨酸518、丝氨酸521、谷氨酸524共3个氢键结合位点，其中丝氨酸521结合的氢键长度为2.2 Å，属于强氢键范围（2.2～2.5 Å），可能显著降低复合物的解离速率。见图4。

3.3 4组分组结果

3.3.1 4组NRCMs cTnT蛋白表达比较

与对照组比较，AngⅡ组免疫荧光面积明显增大（P＜0.05）；Rhy组免疫荧光面积差异无统计学意义（P＞0.05）。与AngⅡ组比较，AngⅡ＋Rhy组免疫荧光面积明显减小（P＜0.05）。见图5。

3.3.2 4组ANP、BNP、CollagenⅠ、TGF-β1 mRNA相对表达水平比较

与对照组比较，AngⅡ组ANP、BNP、CollagenⅠ、TGF-β1 mRNA相对表达水平均明显升高（P＜0.05）；Rhy组ANP、BNP、Collagen Ⅰ、TGF-β1 mRNA相对表达水平差异均无统计学意义（P＞0.05）。与AngⅡ组比较，AngⅡ＋Rhy组ANP、BNP、Collagen Ⅰ、TGF-β1 mRNA相对表达水平均明显降低（P＜0.05）。见图6。

3.3.3 4组细胞STAT3信号通路相关蛋白表达量比较

与对照组比较，AngⅡ组p-STAT3和STAT3核蛋白相对表达量均明显升高（P＜0.05），p-STAT3和TGF-β1总蛋白相对表达量均明显升高（P＜0.05）；Rhy组p-STAT3、STAT3核蛋白相对表达量以及p-STAT3、STAT3和TGF-β1总蛋白核蛋白相对表达量差异均无统计学意义（P＞0.05）。与AngⅡ组比较，AngⅡ＋Rhy组p-STAT3和STAT3核蛋白相对表达量均明显降低（P＜0.05），p-STAT3和TGF-β1总蛋白相对表达量均明显降低（P＜0.05）。见图7、图8。

3.4 5组分组结果

3.4.1 5组NRCMs cTnT蛋白表达比较

与对照组比较，AngⅡ组免疫荧光面积明显增大（P＜0.05）；与AngⅡ组比较，AngⅡ＋Rhy组、AngⅡ＋S3I-201组、AngⅡ＋S3I-201＋Rhy组免疫荧光面积均明显减小（P＜0.05）；与AngⅡ＋S3I-201组比较，AngⅡ＋S3I-201＋Rhy组免疫荧光面积差异无统计学意义（P＞0.05）。见图9。

3.4.2 5组ANP、BNP、Collagen Ⅰ和TGF-β1 mRNA相对表达水平比较

与对照组比较，AngⅡ组ANP、BNP、Collagen Ⅰ和TGF-β1 mRNA相对表达水平均明显升高（P＜0.05）；与AngⅡ组比较，Ang Ⅱ＋Rhy组、AngⅡ＋S3I-201组和Ang Ⅱ＋S3I-201＋Rhy组ANP、BNP、Collagen Ⅰ和TGF-β1 mRNA相对表达水平均明显降低（P＜0.05）；与AngⅡ＋S3I-201组比较，AngⅡ＋S3I-201＋Rhy组ANP、BNP、Collagen Ⅰ、TGF-β1 mRNA相对表达水平差异均无统计学意义（P＞0.05）。见图10。

3.4.3 5组细胞STAT3信号通路相关蛋白表达量比较

与对照组比较，AngⅡ组p-STAT3和STAT3核蛋白相对表达量均明显升高（P＜0.05），p-STAT3和TGF-β1总蛋白相对表达量均明显升高（P＜0.05）；与AngⅡ组比较，AngⅡ＋Rhy组、AngⅡ＋S3I-201组、AngⅡ＋Rhy＋S3I-201组p-STAT3和STAT3核蛋白相对表达量均明显降低（P＜0.05），p-STAT3和TGF-β1总蛋白相对表达量均明显降低（P＜0.05）；与AngⅡ＋S3I-201组比较，AngⅡ＋S3I-201＋Rhy组p-STAT3和STAT3核蛋白相对表达量以及p-STAT3和TGF-β1总蛋白相对表达量差异均无统计学意义（P＞0.05）。见图11、图12。

4 讨　论

病理性心肌肥大是一种心脏重构病理状态，通常与高血压、心力衰竭等心血管疾病密切相关^［10］。AngⅡ通过激活MAPK信号通路、JAK/STAT信号通路等多条信号通路导致心肌肥厚^［11］。此外，抑制AngⅡ/AngⅡ 1型受体（AT1R）过度激活能够有效防止心肌肥大以及心肌纤维化^［12-13］。当AngⅡ与其受体结合后，可诱导Janus激酶（JAK）介导的酪氨酸磷酸化驱动STAT3二聚体，随即迅速转位到细胞核调控与细胞增殖、存活和炎症反应等生物过程相关靶基因的表达，因此STAT3的异常激活与心肌肥厚密切相关^［14］。AngⅡ能够诱导STAT3双相激活^［6］，且干预12 h时STAT3激活更明显，与本研究结果相一致。既往研究表明：AngⅡ激活的STAT3信号通路通过调控促肥大基因和促进纤维化因子的表达介导心肌肥大进展，因此STAT3信号通路或将成为潜在治疗靶点^［15-16］。故阻止AngⅡ传导激活STAT3信号通路是预防失代偿性心肌肥大及其并发症的有效策略。

Rhy是一种从传统中药钩藤中提取的生物活性成分，具有降血压、抗血小板聚集和神经保护的作用。本研究采用cTnT免疫荧光染色评估心肌细胞面积，其结果分析表明：Rhy能够阻止AngⅡ诱导的心肌细胞肥大，而仅用Rhy刺激NRCMs并未进一步减小心肌细胞面积。既往研究表明，Rhy能够抑制JAK2/STAT3信号通路的激活^［17-18］，但其具体机制尚不明确。磷酸化STAT3形成二聚体导致构象改变后所暴露的核定位信号，可使其能被Importin α/β识别并转运入核^［19］。因此，本研究选取二聚体STAT3和Rhy进行分子对接分析，结果显示：Rhy可与STAT3的丝氨酸521位点形成强氢键（2.2 Å），这一相互作用可能通过阻碍磷酸化STAT3入核，或阻止其与DNA结合从而发挥抑制作用，但此推断仍需通过分子动力学模拟或体外实验进一步验证。

有研究表明：Ang Ⅱ诱导STAT3激活促使心脏组织Collagen Ⅰ和TGF-β1表达，进而引发心脏纤维化和心肌肥大^{［7，20-21］}，并且病理性心肌肥大的发展过程中伴随着心脏损伤，ANP、BNP等心脏损伤指标也显著升高^［22］。本研究结果显示：Rhy可显著阻止AngⅡ诱导的p-STAT3和TGF-β1蛋白升高以及STAT3核转移，抑制Ang Ⅱ诱导的ANP、BNP、Collagen Ⅰ和TGF-β1 mRNA的高表达，提示Rhy可通过抑制STAT3激活来阻止AngⅡ诱导的心肌细胞肥大。而且，Rhy单独刺激NRCMs对STAT3信号通路相关指标影响不显著，提示单独Rhy刺激对心肌细胞STAT3表达没有影响。为进一步明确Rhy靶向STAT3信号通路抑制AngⅡ诱导的心肌肥大，本研究采用STAT3的有效抑制剂S3I-201进行抑制实验^［23］，结果显示：Rhy与S3I-201均能有效抑制AngⅡ诱导的心肌细胞肥大，且能减弱AngⅡ诱导的STAT3及其下游靶基因激活。但Rhy和S3I-201的合用并未进一步减小心肌细胞面积以及阻止STAT3入核，提示Rhy主要通过抑制STAT3信号通路阻止Ang Ⅱ诱导的心肌细胞肥大。

综上所述，本研究通过分子对接方法确认了钩藤碱与STAT3之间的高亲和性结合，并探讨了其通过特异性靶向抑制STAT3信号通路发挥抗心肌肥大作用的分子机制。基于当前研究结果，后续研究可进一步构建心肌肥大动物模型，深入评估钩藤碱在体内的药效学特征及其对心脏功能的改善作用，同时结合药代动力学研究评估其临床转化潜力。

参考文献

[1] GUO H X， LIU B X， HOU L，et al. The role of mAKAPβ in the process of cardiomyocyte hypertrophy induced by angiotensin Ⅱ ［J］. Int J Mol Med，2015，35（5）：1159-1168.

[2] NAKAMURA M， SADOSHIMA J. Mechanisms of physiological and pathological cardiac hypertrophy ［J］. Nat Rev Cardiol，2018，15（7）：387-407.

[3] RIET L TE， VAN ESCH J H， ROKS A J，et al. Hypertension：renin-angiotensin-aldosterone system alterations ［J］. Circ Res，2015，116（6）：960-975.

[4] ZOUEIN F A， ZGHEIB C， HAMZA S，et al. Role of STAT3 in angiotensin Ⅱ-induced hypertension and cardiac remodeling revealed by mice lacking STAT3 serine 727 phosphorylation ［J］. Hypertens Res，2013，36（6）：496-503.

[5] SKOUMAL R， TÓTH M， SERPI R，et al. Parthenolide inhibits STAT3 signaling and attenuates angiotensin Ⅱ-induced left ventricular hypertrophy via modulation of fibroblast activity ［J］. J Mol Cell Cardiol，2011，50（4）：634-641.

[6] HAN J B， YE S J， ZOU C P，et al. Angiotensin Ⅱ causes biphasic STAT3 activation through TLR4 to initiate cardiac remodeling ［J］. Hypertension，2018，72（6）：1301-1311.

[7] YE S J， LUO W， KHAN Z A，et al. Celastrol attenuates angiotensin Ⅱ-induced cardiac remodeling by targeting STAT3 ［J］. Circ Res，2020，126（8）：1007-1023.

[8] ZHOU J Y， ZHOU S W. Antihypertensive and neuroprotective activities of rhynchophylline：the role of rhynchophylline in neurotransmission and ion channel activity ［J］. J Ethnopharmacol，2010，132（1）：15-27.

[9] 何娜，孙安盛，吴芹，等. 钩藤碱对血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞肥大的抑制作用［J］. 中国药理学与毒理学杂志，2010，24（4）：255-260.

[10] ĐORĐEVIĆ D B， KORAČEVIĆ G P， ĐORĐEVIĆ A D，et al. Hypertension and left ventricular hypertrophy ［J］. J Hypertens，2024，42（9）：1505-1515.

[11] BHULLAR S K， DHALLA N S. Angiotensin Ⅱ-induced signal transduction mechanisms for cardiac hypertrophy ［J］. Cells，2022，11（21）：3336.

[12] WEI X X， JIN J Y， WU J，et al. Cardiac-specific BACH1 ablation attenuates pathological cardiac hypertrophy by inhibiting the Ang Ⅱ type 1 receptor expression and the Ca²⁺/CaMKⅡ pathway ［J］. Cardiovasc Res，2023，119（9）：1842-1855.

[13] LIANG H， ZHANG N， ZHAO L，et al. Perindopril improves cardiac fibrosis through targeting the AngⅡ/AT1R pathway ［J］. Cell Mol Biol （Noisy-le-grand），2023，69（9）：234-238.

[14] HILFIKER-KLEINER D， HILFIKER A， FUCHS M，et al. Signal transducer and activator of transcription 3 is required for myocardial capillary growth，control of interstitial matrix deposition，and heart protection from ischemic injury ［J］. Circ Res，2004，95（2）：187-195.

[15] ZHUANG L F， JIA K N， CHEN C，et al. DYRK1B-STAT3 drives cardiac hypertrophy and heart failure by impairing mitochondrial bioenergetics ［J］. Circulation，2022，145（11）：829-846.

[16] WANG M Y， HAN X， YU T X，et al. OTUD1 promotes pathological cardiac remodeling and heart failure by targeting STAT3 in cardiomyocytes ［J］. Theranostics，2023，13（7）：2263-2280.

[17] LI H， BI Q Y， CUI H X，et al. Suppression of autophagy through JAK2/STAT3 contributes to the therapeutic action of rhynchophylline on asthma ［J］. BMC Complement Med Ther，2021，21（1）：21.

[18] LONG H Y， ZHANG M J， WANG C Y，et al. Rhynchophyllin attenuates neuroinflammation in Tourette syndrome rats via JAK2/STAT3 and NF-κB pathways ［J］. Environ Toxicol，2019，34（10）：1114-1120.

[19] CIMICA V， CHEN H C， IYER J K，et al. Dynamics of the STAT3 transcription factor：nuclear import dependent on ran and importin-β1 ［J］. PLoS One，2011，6（5）：e20188.

[20] LI C， INESS A， YOON J，et al. Noncanonical STAT3 activation regulates excess TGF-β1 and collagen Ⅰ expression in muscle of stricturing Crohn's disease ［J］. J Immunol，2015，194（7）：3422-3431.

[21] PAPAIOANNOU I， XU S W， DENTON C P，et al. STAT3 controls COL1A2 enhancer activation cooperatively with JunB，regulates type I collagen synthesis posttranscriptionally，and is essential for lung myofibroblast differentiation ［J］. Mol Biol Cell，2018，29（2）：84-95.

[22] MA E， WU C L， CHEN J X，et al. Resveratrol prevents Ang Ⅱ- induced cardiac hypertrophy by inhibition of NF-κB signaling ［J］. Biomed Pharmacother，2023，165：115275.

[23] SHEN C J， WU N， CHEN X M，et al. Interleukin-5 alleviates cardiac remodelling via the STAT3 pathway in angiotensin Ⅱ- infused mice ［J］. J Cell Mol Med，2024，28（13）：e18493.

基金资助

福建中医药大学青年科技创新培育计划项目(XQB202201)

福建中医药大学高层次人才科研项目（X2024001-人才,X2024009-人才）