基于DIA蛋白质组学探究六味地黄丸治疗骨质疏松模型小鼠的机制

摘要

目的 探究六味地黄丸对骨质疏松症模型小鼠骨代谢治疗作用机制研究及其差异蛋白的生物信息学分析。 方法 将36只8周龄雌性C57BL/6J小鼠按随机数字法分成假手术组、模型组和六味地黄丸组，每组12只。模型组和六味地黄丸组采用双侧去卵巢法建立骨质疏松模型，假手术组切除双侧卵巢旁等体积的脂肪组织。造模后4周，六味地黄丸组按5 g/（kg·d）给予六味地黄丸药液灌胃，假手术组及模型组按5 mL/（kg·d）给予生理盐水灌胃，均连续干预4周。应用双能X线骨密度仪检测3组左侧股骨近端骨密度；应用Micro-CT观察3组左侧股骨骨形态，并分析骨体积分数（BV/TV）、骨表面积/组织体积比（BS/TV）、骨小梁数目（Tb.N）以及骨小梁间距（Tb.Sp）；采用数据非依赖型质谱采集模式（DIA）技术对3组右侧股骨进行蛋白质组学分析，筛选出差异表达蛋白，进行基因本体（GO）功能、京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，并构建蛋白质互作（PPI）网络。 结果 Micro-CT观察结果显示：模型组骨小梁数目较假手术组减少，网状结构断裂稀疏，间隙增宽且排列紊乱；六味地黄丸组骨小梁数目较模型组增加，网状结构紧密结合，间隙宽度缩窄，结构排列趋向规则。与假手术组比较，模型组骨密度、BV/TV、BS/TV、Tb.N均明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，六味地黄丸组BS/TV、Tb.N均明显升高（P＜0.05）。差异蛋白筛选结果显示：与假手术组比较，模型组中有199个上调蛋白，157个下调蛋白，共356个差异表达蛋白；与模型组比较，六味地黄丸组中有1 044个上调蛋白，356个下调蛋白，共1 400个差异表达蛋白；对共同的差异蛋白质进行统计分析，模型组中共49个蛋白的异常表达状况在六味地黄丸组中得以恢复，其中上调蛋白26个，下调蛋白23个。GO富集分析结果显示：六味地黄丸组/模型组的差异蛋白在细胞组分（CC）中主要包括DNA聚合酶复合体、核糖体以及核糖核蛋白复合体等；在分子功能（MF）中主要包括复合物蛋白质结合、DNA结合、核酸结合、DNA解旋酶活性等；在生物过程（BP）中主要包括髓细胞发育过程、血红素合成代谢过程、有机物代谢过程等。KEGG富集分析结果显示：模型组/六味地黄丸组的差异蛋白主要在碳代谢、铁死亡和线粒体氧化磷酸化等通路中富集。PPI网络分析结果显示：六味地黄丸组和模型组的共同差异蛋白中核酸蛋白亚基a2（Kpna2）、DLG相关蛋白5（Dlgap5）、转录起始因子ⅡA 亚基2（Gtf2a2）、转录起始因子TFIID亚基8（Taf8）位于功能网络节点。 结论 六味地黄丸可能通过调节Kpna2、Dlgap5等特定蛋白表达及铁死亡、氧化磷酸化等重要生物过程，参与保护骨质疏松骨代谢过程。

Graphical abstract

关键词

骨质疏松症 / 六味地黄丸 / DIA技术 / 蛋白质组学 / 骨代谢 / 小鼠 / 铁死亡 / 氧化磷酸化

随着老龄化社会的到来，绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis，PMOP）已成为我国常见严重威胁人类身心健康的疾病，65岁以上女性患者发病率可高达50%^［1］。PMOP是原发性骨质疏松症的一种，该病的发生与雌激素下降密切相关，导致骨吸收大于骨形成，进而影响骨稳态^［2-3］，甚至引起骨质疏松性骨折^［4］，所带来的疼痛以及经济、家庭、社会压力已严重危害着患者的日常生活质量^［5］，因此PMOP的防治至关重要。六味地黄丸是一种经典的中药复方，具有滋阴补肾、强筋壮骨之效，治疗PMOP具有多靶点调节的优势^［6-10］，方中山茱萸苷、丹皮酚等活性成分可通过调控雌激素受体^［11-12］、激活Wnt/β-catenin成骨通路及抑制RANKL/OPG破骨信号，协同改善骨代谢失衡^{［8，12-13］}。然而，其复杂成分与体内多重生物学过程的交互机制尚未完全明确，因此需采用数据非依赖型质谱采集（data independent acquisition，DIA）蛋白组学技术，通过建立去卵巢小鼠骨质疏松模型，观察六味地黄丸对小鼠股骨骨密度和骨微结构变化，系统性解析药物作用下的全局蛋白动态变化，通过基因本体（gene ontology，GO）功能、京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析以及构建蛋白质互作（protein-protein interaction，PPI）网络，对六味地黄丸在防治骨质疏松症上可能涉及的靶点进行预测，旨在为阐释该药方调节骨质疏松小鼠模型骨代谢的作用机制提供科学依据。

1 实验材料

1.1 实验动物

SPF级雌性C57BL/6J小鼠36只，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，实验动物生产许可证号为SCXK（京）2019-0008，动物质量合格证号为110322230102283348。小鼠饲养于福建省中医药科学院比较医学中心，实验动物使用许可证号为SYXK（闽）20200002，饲养环境为温度（20±2）℃，相对湿度（60±10）%，光照周期12 h/12 h。本动物实验经福建省中医药科学院动物伦理委员会审批（审批号：FJATCM-IAEC2022005）。

1.2 实验药物

六味地黄丸（浓缩丸）购自北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂，货号：Z11021283，根据体表面积法计量换算，成人日用药量为24丸（4.32 g），小鼠等效系数为0.026，标准体质量为20 g，换算后六味地黄丸生药等效剂量为0.561 6 g/（kg·d），溶解于灭菌蒸馏水中配制成56.16 g/L六味地黄丸药液。

1.3 实验试剂

尿素（美国Sigma公司，货号：V900119）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（货号：P0012）、SDS裂解液（货号：P0013G）、蛋白酶抑制剂混合物（货号：P1005）均购自上海碧云天生物技术有限公司；胰蛋白酶（北京普洛麦格生物技术有限公司，货号：VA9001）。

1.4 实验仪器

Discovery W双能X线骨密度仪（美国Hologic公司，型号：N89006）；微型计算机断层扫描（Micro-CT）（广州中科凯盛医疗科技有限公司，型号：ZKKS-MCT-Sharp-Ⅱ）；固定式漩涡混匀仪（美国Scilogex公司，型号：MX-F）；高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司，型号：Centrifuge 5424 R）；恒温混匀仪（合肥艾本森科学仪器有限公司，型号：ABS-MS-078）；酶标仪（美国Molecular Devices公司，型号：Spectra Max plus384）；全自动数码凝胶图像分析系统（型号：Tanon-3500R）、数显式稳压稳流电泳仪（型号：EPS-300）均购自上海天能科技有限公司；分析天平（美国Mettler Toledo公司，型号：MS105DU）；高效液相色谱仪（型号：Vanquish Neo）、质谱仪（型号：Orbitrap Astral）、Nanodrop核酸检测仪（型号：2000）均购自美国Thermo公司；超声波细胞破碎仪（江苏波场智能科技股份有限公司，型号：Fielda-650D）。

2 实验方法

2.1 分组与造模

36只小鼠按随机数字法分为假手术组、模型组和六味地黄丸组，每组12只。3组小鼠术前24 h禁食不禁水，按60 mg/kg腹腔注射2%戊巴比妥钠溶液麻醉小鼠，模型组和六味地黄丸组采用双侧去卵巢法建立骨质疏松模型^［14］，假手术组切除双侧卵巢旁等体积的脂肪组织。术后3 d按100 U/10 g连续腹腔注射青霉素以预防感染。

2.2 干预

造模后4周开始药物灌胃干预，六味地黄丸组按5 g/（kg·d）给予六味地黄丸药液灌胃，假手术组及模型组按5 mL/（kg·d）给予生理盐水灌胃，每日灌胃2次，均连续干预4周。

2.3 取材与样本采集

干预4周后，3组小鼠在末次灌胃24 h后取材，其间禁食不禁水，按60 mg/kg腹腔注射2%戊巴比妥钠溶液，对小鼠进行麻醉并处死。解剖小鼠双大腿，分离出两侧股骨组织，取左侧股骨于4%多聚甲醛中保存，用于骨密度测定和骨微结构形态学分析；取右侧股骨提取蛋白，并将每组的4只小鼠股骨蛋白混合，形成1份混合样本，每组制备3份蛋白质混合样本，用于蛋白定量分析。

2.4 股骨骨密度检测与骨形态学分析

每组随机取3只小鼠，应用Discovery W双能X线骨密度仪检测3组左侧股骨近端骨密度；使用Micro-CT观察左侧股骨骨形态，并采用ImageJ 1.54软件自动分析骨体积分数（BV/TV）、骨表面积/组织体积比（BS/TV）、骨小梁数目（Tb.N）以及骨小梁间距（Tb.Sp）。

2.5 股骨蛋白提取和酶解

取右侧股骨组织冷冻样品，转移至预冷离心管中。加入含8 mol/L尿素、1%SDS裂解液和蛋白酶抑制剂的混合物，使用组织研磨仪充分研磨3次，每次3 min，随后于4 ℃下进行超声破碎30 min。将裂解液于4 ℃下14 000 g离心15 min，收集上清液。配制浓度梯度范围为0～2 μg的BSA标准蛋白溶液，与BCA反应后，应用酶标仪于波长562 nm下读取吸光度（OD）值，绘制浓度OD值标准曲线。完成蛋白定量后，进行SDS-PAGE电泳分析。将分段提取的蛋白样品与裂解液混合物浓缩后，使用胰蛋白酶于37 ℃进行过夜酶解。酶解产物经真空干燥后，用0.1%三氟乙酸水溶液重悬，再利用HLB固相萃取柱进行脱盐。脱盐后的样品经真空浓缩干燥，使用Nanodrop核酸检测仪进行紫外分光光度法肽段定量。

2.6 DIA质谱检测

用流动相A相（0.1%甲酸＋2%乙腈）和B相（0.1%甲酸＋80%乙腈）溶解肽段后，使用液相色谱系统进行分离，肽段分离后使用Orbitrap Astral质谱仪在DIA模式下运行。应用Xcalibur 4.7软件（美国Thermo公司）进行数据采集。

2.7 生物信息学分析

DIA原始数据使用Spectronaut™ 19软件基于Uniprot数据库进行分析。设定蛋白质与肽段FDR均≤0.01、肽段置信度≥99%的阈值进行质控与定量。差异蛋白的筛选标准为P＜0.05，且变化倍数（FC）＞1.2倍（上调）或FC＜0.83倍（下调），差异蛋白筛选后使用GraphPad Prism 10.4.0软件进行火山图可视化和图表分析。随后对差异蛋白进行生物信息学分析，① GO富集分析：通过Blast2Go平台（http：//www.blast2go.com/）进行基因本体功能注释与富集；② KEGG通路分析：基于KEGG数据库（http：//www. kegg.jp/）鉴定差异蛋白参与的关键信号通路；③ PPI网络分析：利用STRING数据库（http：//string-db.org/）构建相互作用网络（置信度阈值≥0.4），并使用Cytoscape 3.9.1软件进行可视化。

2.8 统计学方法

应用SPSS 29.0软件对数据进行处理。计量资料符合正态分布以（\overline{x}±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较若方差齐采用LSD-t检验；若方差不齐采用Games-Howell检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结　果

3.1 3组左侧股骨骨密度比较

与假手术组比较，模型组左侧股骨骨密度明显降低（P＜0.05）。见表1。

3.2 3组骨形态学观察及其指标比较

模型组骨小梁数目较假手术组减少，网状结构断裂稀疏，间隙增宽且排列紊乱；六味地黄丸组骨小梁数目较模型组增加，网状结构紧密结合，间隙宽度缩窄，结构排列趋向规则，见图1。与假手术组比较，模型组BV/TV、BS/TV、Tb.N均明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，六味地黄丸组BS/TV、Tb.N均明显升高（P＜0.05），见表2。

3.3 蛋白质鉴定与差异表达蛋白质筛选

在3个实验组别中共筛选出7 282个蛋白质。结果表明：与假手术组比较，模型组中有199个上调蛋白，157个下调蛋白，共356个差异表达蛋白；与模型组比较，六味地黄丸组中有1 044个上调蛋白，356个下调蛋白，共1 400个差异表达蛋白。对各组间差异蛋白进行定量统计，以火山图形式展示，见图2。对共同的差异蛋白质进行统计分析，模型组中共49个蛋白的异常表达状况在六味地黄丸组中得以恢复，其中上调蛋白26个，下调蛋白23个。仅展示蛋白差异明显前20个，见表3。

3.4 差异表达蛋白质GO功能富集分析

对造模后的差异蛋白进行GO功能注释和富集分析，比对模型组/假手术组的差异蛋白数据发现，差异蛋白在细胞组分（cellular compoent，CC）中主要包括膜部分、质膜部分、免疫球蛋白复合物等；在分子功能（molecular function，MF）中主要包括免疫球蛋白受体结合、磷脂酰磷脂酶B活性、G蛋白偶联受体活性等；在生物过程（biological process，BP）中主要包括cAMP代谢过程、环核苷酸代谢过程、神经元细胞内稳态等。对六味地黄丸干预后的差异蛋白进行GO功能注释与富集分析，比对六味地黄丸组/模型组的差异蛋白数据发现，差异蛋白在CC中主要包括DNA聚合酶复合体、核糖体以及核糖核蛋白复合体等；在MF中主要包括复合物蛋白质结合、DNA结合、核酸结合、DNA解旋酶活性等；在BP中主要包括髓细胞发育过程、血红素合成代谢过程、有机物代谢过程等。见图3。

3.5 差异表达蛋白质KEGG通路富集分析

对造模后的差异蛋白进行KEGG通路富集分析，比对假手术组/模型组的差异蛋白数据发现，共有23条通路富集到KEGG pathway，主要在造血细胞调控的信号传导、原发性免疫缺陷以及卵巢类固醇生物合成等关键通路，其富集水平呈现逐渐下降的趋势。对六味地黄丸干预后的差异蛋白进行KEGG通路富集分析，比对模型组/六味地黄丸组的差异蛋白数据发现，共有28条通路富集到KEGG pathway，主要在碳代谢、铁死亡和线粒体氧化磷酸化等通路中富集。仅展示前20条富集程度较高的通路，见图4。

3.6 共同差异表达蛋白PPI分析

为深入挖掘蛋白质的多样化功能特性，利用STRING蛋白质交互网络分析软件进行探究，结果显示在所比较的差异蛋白中，核酸蛋白亚基a2（Kpna2）、DLG相关蛋白5（Dlgap5）、转录起始因子ⅡA亚基2（Gtf2a2）、Taf8处于功能网络的中心节点位置，而其他蛋白则分布于网络的周边区域。见图5。图中Kpna2、Taf8、Dlgap5之间存在联系，而Taf8与Gtf2a2之间存在联系。

4 讨　论

研究结果显示：经六味地黄丸干预后，骨质疏松模型小鼠骨代谢表型指标具有积极的改善趋势。研究结果显示：六味地黄丸组在骨密度上与模型组比较差异虽无统计学意义，但其数值变化及骨微结构的改善，提示六味地黄丸可能对骨骼健康具有一定程度的积极影响，其骨密度均值表现出向假手术组水平靠拢的倾向。这种骨密度提高的趋势以及骨微结构的改善，如骨小梁数目增加，与先前研究报道的六味地黄丸能促进成骨细胞活性、抑制破骨细胞分化的作用是一致的^［15-16］。这表明六味地黄丸可能优先作用于骨微结构的修复与重建，即优先于宏观骨密度的显著变化，是六味地黄丸发挥骨保护作用的重要早期表现。其次，通过蛋白质组学分析可更好理解六味地黄丸的作用机制。与模型组比较，六味地黄丸组筛选出高达1 400个差异表达蛋白，强有力说明六味地黄丸并非通过单一靶点，而是通过系统性调节来干预骨质疏松进程，印证了该中药复方多成分、多靶点的作用特点^［17］。

对差异蛋白的生物信息学分析进一步指明六味地黄丸可能作用的生物学通路。KEGG通路富集分析提示六味地黄丸可能通过调控细胞命运和能量代谢发挥作用。“铁死亡”是近年来发现的一种与骨代谢失衡密切相关的新型细胞死亡方式^［18］。研究表明，成骨细胞和破骨细胞的稳态失衡与铁死亡过程有关，抑制铁死亡可以减轻骨质疏松^［19］。本研究结果提示六味地黄丸可能通过调节铁死亡，保护骨细胞免于异常死亡。同时，“线粒体氧化磷酸化”是细胞能量的核心来源。成骨细胞进行骨基质合成是一个高度耗能的过程，其功能衰退与细胞内线粒体功能障碍和ATP供应不足紧密关联^［20］。六味地黄丸可能通过调节此通路，改善骨细胞的能量代谢状态，从而促进骨形成。GO功能富集分析揭示了六味地黄丸在分子层面的作用焦点。差异蛋白显著富集在“DNA结合”“核酸结合”等分子功能上，暗示六味地黄丸的作用可能深入到细胞核内，影响基因的转录和表达。例如，富集到的“血红素合成”过程与线粒体功能密切相关，因为血红素是细胞色素C氧化酶（线粒体电子传递链关键组分）的辅基^［21］，这与此前发现的氧化磷酸化通路富集形成了相互印证。PPI蛋白互作网络分析找到核心关键节点蛋白，如Kpna2负责核质转运，影响多种转录因子的活性^［22-23］；Dlgap5与细胞周期调控相关^［24］，在细胞增殖、分化和存活中扮演着核心角色，有效维持MC3T3-E1成骨细胞的增殖能力^［25］。六味地黄丸可能通过影响这些“枢纽”蛋白，进而引发下游广泛的信号级联反应。

综上所述，初步构建六味地黄丸作用机制模型：经六味地黄丸干预后，其活性成分可系统性调节骨髓微环境中的蛋白质表达谱，特别是通过影响Kpna2、Dlgap5等关键节点蛋白，进而调控铁死亡和线粒体氧化磷酸化等核心生物学过程。一方面可能通过抑制铁死亡保护了骨细胞存活^［18-19］，另一方面通过增强骨代谢促进成骨细胞的功能活性^［20］。最终，这些分子和细胞层面的积极变化体现为骨小梁结构的修复和骨密度提升的趋势。本研究结果不仅从骨微结构层面证实了六味地黄丸的积极作用，还从蛋白质网络动态的角度揭示了多靶点、多通路的作用特点，为绝经后骨质疏松症提供了新的目标和研究方向，有助于进一步探讨骨质疏松症发生机制、新靶向药物的研究和运用，临床上防治PMOP的有效方法。

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基金资助

国家自然科学基金项目(81774350)

福建省自然科学基金项目(2023J01856)

福建省自然科学基金项目(2023J01854)