基于指纹图谱、网络药理学和定量分析的畲家舒筋膏质量标志物研究

摘要

目的 基于液相串联三重四极杆质谱（LC-MS/MS）、网络药理学和高效液相色谱（HPLC）指纹图谱，系统筛选并预测畲家舒筋膏潜在质量标志物（Q-markers），并建立其含量测定方法。 方法 采用LC-MS/MS技术分析畲家舒筋膏中的化学成分，通过网络药理学构建“成分-靶点-通路”网络，结合HPLC指纹图谱预测与疗效相关的Q-markers，并建立Q-markers含量测定的HPLC方法。 结果 建立了畲家舒筋膏HPLC指纹图谱，标记11个共有峰，对其进行峰指认。结合网络药理学的方法分析得出山柰酚、五味子醇甲及熊果酸可能为畲家舒筋膏潜在的Q-marker。同时测定山柰酚、五味子醇甲及熊果酸的含量，方法学考察结果良好，山柰酚平均回收率为102.84%，RSD＝2.64%；五味子醇甲平均回收率为96.12%，RSD＝2.25%；熊果酸平均回收率为100.87%，RSD＝2.77%。 结论 本研究首次将LC-MS/MS法、HPLC指纹图谱与网络药理学结合，为畲家舒筋膏的质量控制提供科学依据，并为民族药复方制剂的标准化研究提供新思路。

Graphical abstract

关键词

畲家舒筋膏 / 网络药理学 / 质量标志物 / 指纹图谱 / 山柰酚 / 五味子醇甲 / 熊果酸

畲家舒筋膏为闽东地区特色畲药制剂，具有祛风除湿、活血止痛的功效，以十二时辰（毛茛科植物重瓣铁线莲Clematis florida var. flore-pleno的干燥根）为君药，骨地松［紫葳科植物凌霄Campsis grandiflora （Thunb.） Schum.的干燥根］、闾山竹［百合科植物万寿竹Disporum cantoniense （Lour.） Merr.的干燥根］为臣药，糯米藤（五味子科植物南五味子Kadsura longipedunculata Finet & Gagnep.的干燥根）和水里藏兵（罂粟科植物血水草Eomecon chionantha Hance的干燥全草）为佐药组成^［1-3］。目前对于畲家舒筋膏的质量控制研究尚显不足，因此，建立和完善其质量标准显得尤为重要。为建立中药全程质量控制及质量溯源体系，刘昌孝院士提出质量标志物（quality markers，Q-markers）的概念，Q-marker是中药质量控制的理论基础与技术核心，通过确立具有特有性、有效性、传递性、配伍关联性和可测性的化学标志物，为中药全生命周期质量评价与标准化提供科学依据，对完善中药质量评价方法和提高中药质量控制水平具有重要意义^［4-5］。中药指纹图谱技术作为一种现代分析手段，能够在整体层面上筛选出能够代表中药质量的关键性成分，其稳定性和准确性使其成为中医药现代化研究中的重要工具^［6］。网络药理学具有多基因、多靶点的特性，两者结合用于预测药物的潜在Q-marker，在中医药现代化研究中具有显著的应用潜力。本研究选取畲家舒筋膏作为研究对象，将液相串联三重四极杆质谱（LC-MS/MS）法、高效液相色谱（HPLC）指纹图谱技术与网络药理学相结合，旨在预测其潜在的Q-marker，并用HPLC技术进行含量测定，为畲家舒筋膏的进一步开发和生产提供科学依据，为民族药复方制剂的质量控制提供新方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器

超高效液相色谱仪（型号：Vanquish）、高分辨质谱仪（型号：Orbitrap Exploris 120）、离心机（型号：Heraeus Fresco 17）均购自美国Thermo Fisher Scientific公司；高效液相色谱分析仪（美国Waters公司，型号：2996）；分析天平（德国Sartorius公司，型号：BSA124S-CW）；研磨仪（上海净信实业发展有限公司，型号：JXFSTPRP-24）；纯水仪（德国Merck Millipore 公司）；超声仪（深圳市方奥微电子有限公司，型号：YM-080S）。

1.2 试剂

L-2-氯苯丙氨酸（上海恒柏生物科技有限公司，纯度：98%）；山柰酚（批号：A01HB190000，纯度≥98%）、五味子醇甲（批号：S22HB195301，纯度≥98%）、熊果酸（批号：C15O11Q126879，纯度≥98%）均购自上海源叶生物科技有限公司；甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）均购自德国CNW Technologies公司；甲酸（色谱纯，美国SIGMA公司）；其余试剂均为分析纯；水为超纯水。

1.3 药物

十二时辰、骨地松、水里藏兵产自宁德福安；闾山竹产自宁德寿宁；糯米藤产自宁德蕉城，以上药材经福建中医药大学杨成梓教授鉴定为正品。11批畲家舒筋膏均按课题组优化工艺生产^［3］，批号为2023001～2023011，生产日期为2023年11月5日，编号为畲家舒筋膏S1～S11。

2 方法与结果

2.1 LC-MS/MS化学成分分析

2.1.1 色谱条件

色谱柱UPLC BEH C₁₈（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相：0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水；梯度洗脱条件：0～3.5 min，5%～15%乙腈；3.5～6 min，15%～30%乙腈；6～6.5 min，30%乙腈；6.5～12 min，30%～70%乙腈；12～12.5 min，70%乙腈；12.5～18 min，70%～100%乙腈；18～22 min，100%乙腈；22～25 min，100%乙腈；25～26 min，100%～5%乙腈；26～30 min，5%乙腈；进样量5 μL；柱温40 ℃；体积流速400 μL/min。

2.1.2 质谱条件

护套气体流量：30 Arb；Aux气体流量：10 Arb；离子传递管温度：350 ℃；汽化器温度：350 ℃；全MS分辨率：60 000；MS/MS分辨率：15 000；碰撞能量：16/32/48NCE模式；喷雾电压：5.5 kV或-4 kV。

2.1.3 溶液制备

称取100 mg畲家舒筋膏样品，加入500 μL甲醇-水提取液（比例为4∶1，内标浓度为10 μg/mL），涡旋混合30 s，然后以45 Hz的频率匀浆4 min，接着进行冰水浴超声处理1 h，-40 ℃下静置1 h后，4 ℃下12 000 r/min离心15 min，并小心取上清液，0.22 μm微孔滤膜过滤，即得所需样品溶液。

2.1.4 LC-MS/MS分析结果

在UHPLC系统上对畲家舒筋膏进行LC-MS/MS分析，采用正负离子模式进行数据采集，得到其总离子流色谱图，并通过质谱解析鉴定出529个化学成分，包括萜类、苯丙素类、黄酮类、生物碱类等多种化合物。

2.1.5 活性成分筛选

鉴于其为外用制剂，未采用口服生物利用度（oral bioavailability，OB）作为筛选标准。由于相对分子质量（molecular weight，MW）和类药性（drug-likeness，DL）可评估化合物的成药潜力，本研究以MW≤500且DL≥0.18为条件筛选潜在活性成分。通过中药系统药理学分析平台（TCMSP）对529个化学成分进行筛选，获得224个化合物，其中符合MW≤500、DL≥0.18且具有Related targets的化合物共78个。

2.2 核心成分筛选分析

2.2.1 活性成分及靶点获取

借助TCMSP数据库检索畲家舒筋膏预选活性成分的靶点，并将筛选出的靶点导入UniProt数据库进行筛除非人源靶点。记录下相应的Gene Names，并对其进行去重，作为成分的靶点。将“2.1.5”中筛选出的78个化学成分及相关靶点导入Cytocape 3.8.0软件中构建“畲家舒筋膏-活性成分-靶点”可视化网络图，该网络包含412个节点（78个化合物和333个靶点）和1 284条边，见图1。Degree值体现了网络边的数量，节点与边的连接程度越高，其Degree值亦随之增加，进而可判断节点的重要性水平。据活性成分-靶点之间的Degree值，槲皮素（quercetin）、染料木素（genistein）、山柰酚（kaempferol）、木犀草素（luteolin）和熊果酸（ursolic acid）为排名前5的活性成分，前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）、前列腺素内过氧化物合酶1（PTGS1）、钙调蛋白（CALM）、核受体辅激活蛋白2（NCOA2）、雌激素受体1（ESR1）为活性成分涉及排名前5的作用靶点，主要活性成分见表1。

2.2.2 相关疾病靶点收集

以“Pain”“soft tissue injury”“blood stasis”“rheumatoid arthritis”为疾病名称在OMIM（https：//omim.org/）、GeneCards（https：//www.genecards.org/）、Disgenet（https：//www.disgenet.org/）和Drugbank（https：//www.drugbank.ca/）数据库中检索相关的疾病靶点，在GeneCards数据库中通过相关度（Relevance score）的中位数对基因进行多次筛选，以相关度为条件进行筛选，合并以上数据并删除重复项，分别获得549个疼痛靶点、1 017个软组织损伤靶点、569个血瘀靶点、1 274个类风湿性关节炎靶点。利用Venny 2.1.0获取畲家舒筋膏活性成分与疾病靶点的交集，分别得到76、147、89、126个畲家舒筋膏治疗相关疾病的潜在作用靶点，见图2。

2.2.3 蛋白质-蛋白质互作（PPI）网络关系的构建

将成分与疾病的交集靶点导入STRING数据库中进行PPI分析，物种限定为“Homo sapiens”。隐藏无关联性的点位，得到核心PPI网络，见图3；将PPI网络图导入Cytoscape软件中进行可视化分析，包括度值（degree）、介数中心性（betweenness centrlity）、接近中心度（closeness centrlity），结果见图4。以Degree值为标准筛选出可能对疼痛发挥重要作用的前5个核心靶点有AKT丝氨酸/苏氨酸激酶1（AKT1）、白细胞介素6（IL6）、肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素1β（IL1β）、胰岛素（INS）等；可能对软组织损伤发挥重要作用的前5个核心靶点有AKT1、TNF、IL6、INS、细胞肿瘤抗原p53（TP53）等；可能对血瘀发挥重要作用的前5个核心靶点为AKT1、IL6、INS、TNF、TP53等。可能对软组织损伤发挥重要作用的前5个核心靶点为IL6、TNF、IL1β、AKT1、INS、基质金属蛋白酶-9（MMP9）等。

2.2.4 功能基因富集分析

将交集靶点上传到DAVID数据库，对畲家舒筋膏的疾病相关作用靶点进行基因本体论（GO）富集分析，筛选出关键作用通路，其中包括生物过程（BP）、细胞组成（CC）和分子功能（MF）3个方面，根据富集的显著性，分别选择前20条作气泡图。BP富集分析提示：BP主要与基因表达的正调控、细胞增殖的正向调节和炎症反应等有关；CC富集分析表明：CC与细胞外间隙、胞外区和质膜的整体成分等有关；MF富集分析表明：靶点可能是通过调节细胞因子活性、相同蛋白结合和酶结合、RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性等发挥作用。京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析结果显示：畲家舒筋膏的镇痛作用、治疗跌打损伤等相关治疗作用主要与癌症通路、流体剪切力及动脉粥样硬化和糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路等有关，表明这些靶点可能主要通过调控这些通路来干预相关疾病。见图5~图8。

2.2.5 “成分-靶点-疾病”网络构建

通过整合畲家舒筋膏在镇痛、跌打损伤和风湿麻木等作用的靶点、畲家舒筋膏的活性成分、蛋白相互作用及各疾病前10条的GO功能和KEGG信号通路，运用软件Cytocape 3.8.0，构建出畲家舒筋膏“成分-靶点-疾病”网络。由结果可知，畲家舒筋膏在治疗腰痛、骨骼肌损伤、跌打损伤、风湿麻木等疾病起作用，与槲皮素、染料木素、山柰酚、木犀草素、熊果酸等有较大联系，靶点与PTGS2、AKT1、RELA、MAPK1、IL6等有较大关系，通路与癌症通路、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶通路、脂质和动脉粥样硬化、流体剪切力与动脉粥样硬化、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路等通路有较大联系，具体网络见图9。

2.3 HPLC指纹图谱研究

2.3.1 供试品溶液制备

精密称取畲家舒筋膏1 g，置具塞锥形瓶中，加甲醇10 mL，超声处理1 h，取出，放冷，超声后补足失重，置-20 ℃冰箱中冷冻20 min，取出，倒入离心管中，2 000 r/min离心2 min。取上清液用0.22 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得畲家舒筋膏供试品溶液。

2.3.2 单味药供试品溶液制备

分别精密称取十二时辰、骨地松、闾山竹、糯米藤和水里藏兵样品各2 g，加入95%的乙醇，浸泡1 h，随后超声提取3次，每次1 h，前2次加入20 mL 95%乙醇，第3次加入10 mL 95%乙醇，合并后将提取液浓缩至5 mL，最后定容至10 mL容量瓶中，0.22 μm微孔滤膜将其过滤，取续滤液，即得各单味药供试品溶液。

2.3.3 色谱条件

采用Diamonsil 5 μm C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-水；梯度洗脱条件：0～5 min，10%乙腈；5～13 min，10%～30%乙腈；13～25 min，30%乙腈；25～40 min，30%～65%乙腈；40～45 min，65%～70%乙腈；45～65 min，70%乙腈；65～70 min，70%～90%乙腈；70～80 min，90%～95%乙腈；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；进样量20 μL；检测波长220 nm。

2.3.4 精密度试验

取畲家舒筋膏样品（批号：2023001）按“2.3.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.3”项下色谱条件连续进样6次。以2号峰的保留时间和峰面积作为参照，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。11个共有峰的相对保留时间RSD值均＜1%，相对峰面积RSD值均＜5%，表明仪器的精密度较好，符合指纹图谱测定要求。

2.3.5 稳定性试验

取畲家舒筋膏样品（批号：2023001）按“2.3.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.3”项下色谱条件分别在室温下放置0、2、4、8、16、24 h进样测定，考察其稳定性。结果表明11个共有峰相对保留时间RSD均＜1%；相对峰面积RSD均＜5%，表明供试品在24 h内稳定性较好。

2.3.6 重复性试验

取畲家舒筋膏样品（批号：2023001）按“2.3.1”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.3.3”项下色谱条件计算各相对峰面积以及共有峰相对保留时间计算RSD。结果表明11个共有峰相对保留时间RSD均＜1%，相对峰面积RSD均＜3%，表明仪器重复性良好。

2.3.7 指纹图谱的建立及相似度分析

分别取11批畲家舒筋膏样品，按“2.3.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.3”项下色谱条件进行指纹图谱的采集。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统130723版（2012）》软件对色谱峰匹配分析，以批号2023001样品的色谱图为参考图谱，采用多点校正法进行Mark峰匹配，共标定11个共有峰，并采用中位法，时间窗宽度设置为0.1 min，进行多点校正，分别生成对照图谱R和11批畲家舒筋膏HPLC色谱叠加图，结果见图10、图11所示。并计算11批样品的相似度，结果见表2。结果表明11批畲家舒筋膏样品的相似度均＞0.990，说明这11批畲家舒筋膏化学成分一致性较好，质量较为稳定。

2.3.8 单味药色谱

分别取十二时辰、骨地松、水里藏兵、闾山竹、糯米藤五味民族药，按“2.3.2”项下方法制备单味药供试品溶液，按“2.3.3”项下色谱条件进行图谱采集。从图中可以发现，十二时辰和骨地松出峰时间较靠前，糯米藤和水里藏兵出峰时间靠中间，闾山竹和水里藏兵展现成分较少，糯米藤峰最密集。与畲家舒筋膏的对照图谱相比，化学成分受制备工艺的影响，成分及含量有所减少，见图12。

2.3.9 Q-marker分析

结合网络药理学筛选出畲家舒筋膏治疗腰痛、骨骼肌损伤、跌打损伤、风湿麻木等症的主要成分和各单味药的指标性物质，选取槲皮素、染料木素、木犀草素、山柰酚、柚皮素、黄芩素、白杨素、熊果酸、齐墩果酸、迷迭香酸、芒柄花黄素、表儿茶素、牛心果碱、异鼠李素、野鸢尾黄素、刺五加苷、桑色素、五味子醇甲、五味子酯甲、豆甾醇、白屈菜红碱、麦角甾醇、宝藿苷Ⅰ等20多个化学成分对畲家舒筋膏的主要活性物质进行指认。通过指纹图谱与对照品的对比，仅能选定山柰酚、五味子醇甲及熊果酸这3个成分为畲家舒筋膏的Q-marker。

2.4 3个成分含量测定

2.4.1 混合对照品溶液制备

精密称定山柰酚、五味子醇甲及熊果酸对照品适量，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶液稀释至刻度，定容并摇匀，制成含山柰酚25 μg/mL、五味子醇甲17 μg/mL、熊果酸79 μg/mL的混合对照品溶液。

2.4.2 色谱条件

采用Diamonsil 5 μm C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水；梯度洗脱条件：0～5 min，10%乙腈；5～13 min，10%乙腈；13～30 min，30%乙腈；30～40 min，30%乙腈；40～50 min，55%乙腈；50～55 min，65%乙腈；55～60 min，65%乙腈；60～70 min，70%乙腈；70～80 min，70%乙腈；80～90 min，90%乙腈；90～100 min，95%乙腈；柱温30 ℃；流速1.0 mL/min；检测波长220 nm；进样量20 μL。

2.4.3 供试品与对照品测定

按“2.4.2”项下色谱条件，分别对“2.4.1”项下的混合对照品溶液和“2.3.1”项下的畲家舒筋膏供试品溶液进行HPLC分析，测定结果见图13。

2.4.4 方法学考察

2.4.4.1 线性关系考察

分别精密吸取山柰酚、五味子醇甲和熊果酸对照品溶液，按照“2.4.1”项下制备对照品方法，分别制成0、1.25、2.50、3.75、5.00、6.25 μg/mL山柰酚对照品溶液，0、0.85、1.70、2.55、3.40、4.25μg/mL五味子醇甲对照品溶液，以及0、3.95、7.9、11.85、15.8、19.75 μg/mL熊果酸对照品溶液。并以对照品浓度为横坐标X，峰面积为纵坐标Y，计算各成分的线性回归方程，见表3。结果显示山柰酚、五味子醇甲和熊果酸的对照品分别在0～6.25、0～4.25、0～19.75 μg/mL范围呈良好线性关系。

2.4.4.2 精密度试验

取同一供试品溶液，按照“2.4.2”项下色谱条件连续进样 6 次，计算山柰酚、五味子醇甲和熊果酸峰面积的RSD值，结果RSD值分别为2.13%、2.59%和1.55%，结果表明仪器精密度良好。

2.4.4.3 重复性试验

取同一批次软膏共6份，精密称定，按“2.3.1”项下方法平行制备供试品溶液，按照“2.4.2”项下色谱条件下进样，分别以所得峰面积计算山柰酚、五味子醇甲和熊果酸含量。结果显示山柰酚平均含量为1.75%，RSD为1.88%；五味子醇甲平均含量为0.59%，RSD为1.31%；熊果酸平均含量为1.06%，RSD为0.53%，结果表明该方法重复性良好。

2.4.4.4 稳定性试验

取同一批次的畲家舒筋膏，精密称定，根据“2.3.1”项下方法制备供试品溶液，按照“2.4.2”项下色谱条件分别于0、2、4、8、16、24 h进样测定，根据山柰酚、五味子醇甲和熊果酸峰面积计算RSD值。结果表明：山柰酚RSD为1.60%，五味子醇甲RSD为0.87%，熊果酸RSD为1.92%，说明畲家舒筋膏供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.4.5 加样回收率

精密称取已知山柰酚、五味子醇甲及熊果酸含量的畲家舒筋膏共6份，分别精密加入山柰酚、五味子醇甲及熊果酸对照品，根据“2.3.1”项下方法制备供试品溶液，再按照“2.4.2”项下色谱条件下进样，测定山柰酚、五味子醇甲及熊果酸的含量，计算回收率。测得畲家舒筋膏样品中山柰酚平均回收率为102.84%，RSD为2.64%；五味子醇甲平均回收率为96.12%，RSD为2.25%；熊果酸平均回收率为100.87%，RSD为2.77%，表明该方法准确可靠。

2.4.4.6 供试品含量测定

精密称取11份畲家舒筋膏样品1 g，按照“2.3.1”项下方法制备供试品溶液，根据“2.4.2”项下色谱条件下进样，测定各样品中山柰酚、五味子醇甲和熊果酸的峰面积，根据线性回归方程计算各样品中山柰酚、五味子醇甲和熊果酸含量，结果见表4。

3 讨　论

实验前期对畲家舒筋膏的提取溶剂、方法和流动相进行考察，通过对比70%甲醇、纯甲醇和乙醇的提取效果，以甲醇提取的成分最多，分离效果较好；超声时间以1 h时间提取较完全；流动相的选择中比较乙腈和甲醇的分离效果，乙腈的分离条件较好；在200～400 nm下对畲家舒筋膏进行全波长扫描，在220 nm波长下畲家舒筋膏的色谱峰最多，且分离效果较好。对11批畲家舒筋膏的指纹图谱分析显示，相似度均＞0.990，说明畲家舒筋膏的制备工艺较好，各批次间的质量较统一。采用HPLC法测定11批畲家舒筋膏中山柰酚、五味子醇甲和熊果酸成分的含量，其中山柰酚的含量为17.4～21.8 mg/g，五味子醇甲的含量为0.4～0.8 mg/g，熊果酸的含量为7.6～11.2 mg/g，通过方法学验证RSD＜3%，回收率96.12%～102.84%，表明建立的HPLC含量测定方法稳定可靠，可为畲家舒筋膏的批次一致性提供科学依据。

因畲家舒筋膏为外用膏剂，故不以OB值作为筛选标准。MW是Lipinski的“五法则”参数之一，对评估药物是否具有药效性、药代动力学性质和生物利用度具有一定参考性，通常认为MW 180～500的化合物更具药用性^［7］。DL是一种常用的指标，用于评估化合物是否具有药物化学特性，同时也有助于优化药代动力学和药物性状。故以MW≤500、DL≥0.18作为筛选较高活性物质的条件，作为畲家舒筋膏的预选活性成分。

将筛选出的78个化学成分进行网络药理学分析，结果显示主要靶点有AKT1、IL6、TNF、INS、IL1β、TP53及MMP9等；主要通路为癌症通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、脂质和动脉粥样硬化、流体剪切力与动脉粥样硬化、前列腺癌和癌症中的蛋白聚糖等。主要靶点和信号通路与治疗疼痛相关疾病均有一定的联系，如IL-17信号通路，由IL-17A-F细胞因子组成的亚群，在急性和慢性炎症反应中发挥着关键的作用。其中，IL-17A是新定义的TH17亚群标志性细胞因子，具有保护宿主免受细胞外病原体感染的作用。IL-17C和IL-17A在生物学功能上相似，主要参与黏膜宿主防御机制。IL-17E（IL-25）则是Th2免疫应答的放大器。通过相应的受体，IL-17家族会发出信号，并激活下游通路，如NF-κB、MAPKs和C/EBPs，以调控抗菌肽、细胞因子和趋化因子的表达^［8-10］。通过建立畲家舒筋膏的HPLC指纹图谱，共标定了11个共有峰，指认了山柰酚、五味子醇甲和熊果酸3个化学成分。山柰酚通过抑制诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和环氧合酶-2（COX-2）的表达，显著下调核因子κB（NF-κB）信号通路，从而发挥抗炎作用^［11-12］，与畲药“祛风除湿”的传统功效相契合；五味子醇甲作为木脂素类成分，能够通过清除自由基并增强超氧化物歧化酶（SOD）活性，减轻氧化应激介导的软组织损伤^［13-14］；熊果酸则通过调控IL-17信号通路及抑制促炎细胞因子（如TNF-α、IL-6）的释放，发挥抗炎作用，同时体外实验发现熊果酸能明显抑制体外T细胞激活与增殖，缓解胶原诱导性关节炎大鼠关节肿胀、减轻骨质破坏^［15-16］，这与治疗“血瘀”及“类风湿性关节炎”的临床应用密切相关。山柰酚、五味子醇甲和熊果酸的药理作用机制，与网络药理学预测的核心靶点和关键通路具有良好的相关性，故将这3个化学成分暂定为畲家舒筋膏的Q-marker。

尽管本研究通过整合HPLC指纹图谱与网络药理学为畲家舒筋膏的质量控制提供了新思路，但仍存在一定局限性。① 结合网络药理学得到的畲家舒筋膏可能活性成分及各组方药的指标性成分，对比了齐墩果酸、表儿茶素、桑色素、槲皮素、宝藿苷Ⅰ和黄芩素等20多种对照品，仅能在畲家舒筋膏中确认山柰酚、五味子醇甲及熊果酸3种成分。网络药理学中预测的成分较多不能在指纹图谱中比对到，可能与畲家舒筋膏中的化学成分较多，经简单的液相分析不能将其较好地分离，或经膏剂的制备后化学成分含量受到基质影响等有较大的关系。一测多评是一种中药或复杂体系质量控制的分析策略，通过测定一个成分（内参物），利用该成分与目标成分之间预先建立的相对校正因子，实现对多个无法获取对照品或无对照品成分进行同步定量分析的方法^［17］，后续试验中课题组将以山柰酚为内参物，建立山柰酚与最高峰2之间的校正因子，为畲家舒筋膏的质量控制提供更可靠的数据支持。② 网络药理学的靶点与通路预测依赖于数据库的完整性和算法准确性，存在假阳性或假阴性风险，例如IL-17通路的生物学机制虽与疾病相关，但缺乏体内外实验的直接验证。同时，Q-marker的筛选主要基于化学分析和网络预测，未通过动物模型或临床试验验证其实际药效关联性，可能影响其临床指导价值。③ 作为外用膏剂，研究未充分考量其透皮吸收效率及局部代谢特征对疗效的影响，相关药代动力学机制仍需深入探讨。针对上述问题，未来需通过优化色谱条件、扩大样本多样性、整合体内实验验证等方法，进一步完善畲家舒筋膏的质量评价体系，推动民族药复方制剂的标准化进程。

本研究将LC-MS/MS法、HPLC指纹图谱与网络药理学结合，构建“化学表征-靶点预测-通路富集”多维分析框架。通过指纹图谱标定11个共有峰，结合网络药理学分析筛选出山柰酚、五味子醇甲和熊果酸作为Q-marker，并建立了其含量测定方法，不仅满足“特有性”和“可测性”，更通过靶点通路关联验证其“有效性”。这一方法突破了传统单一成分质量控制的局限性，为民族药复方制剂的标准化提供了新思路。

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基金资助

宁德市自然科学基金联合项目(2023J31)

宁德市卫生健康委员会医技提升项目(2020008)