针刀对兔膝骨关节炎软骨退变及miR-107/Caspase-1/软骨细胞焦亡信号轴的影响

Effects of Acupotomy on Cartilage Degeneration and the miR-107/Caspase-1/Chondrocyte Pyroptosis Signaling Axis in Rabbit Knee Osteoarthritis

摘要

目的 观察针刀对兔膝骨关节炎（KOA）软骨退变及miR-107/Caspase-1/软骨细胞焦亡信号轴的影响。 方法 取24只6月龄雄性新西兰兔，按随机数字表法分为空白组、模型组、针刀组，每组8只。模型组和针刀组参照经典Videman法建立兔KOA模型。空白组与模型组不做干预；针刀组在兔左膝关节周围股四头肌腱和内、外侧副韧带附近寻找条索或结节状物作为进针点，行针刀治疗，1次/周，连续干预4周。干预结束后观察兔膝关节股骨内外侧髁软骨面磨损情况，采用苏木素-伊红（HE）与番红固绿染色观察软骨组织病理形态，透射电镜观察软骨细胞焦亡情况，Western blot检测膝关节软骨组织半胱天冬蛋白酶1（Caspase-1）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-18（IL-18）、Ⅱ型胶原蛋白（Collagen Ⅱ）蛋白表达水平，qPCR检测miR-107及Caspace-1、IL-1β、IL-18、Collagen Ⅱ mRNA表达水平。 结果 与空白组比较，模型组兔膝关节软骨表面出现严重破损，软骨基质番红染色减退，软骨组织退变明显，电镜下可见明显的软骨细胞焦亡现象，软骨组织Caspace-1、IL-1β、IL-18蛋白和mRNA表达水平均升高（P＜0.05），Collagen Ⅱ蛋白和mRNA、miR-107表达水平均降低（P＜0.05）。与模型组比较，针刀组兔膝关节软骨表面较为光滑，软骨基质番红染色稍减退，软骨组织退变减轻，软骨细胞焦亡现象改善，软骨组织Caspace-1、IL-1β、IL-18蛋白和mRNA表达水平均降低（P＜0.05），Collagen Ⅱ蛋白和mRNA、miR-107表达水平均升高（P＜0.05）。 结论 针刀治疗可以延缓兔KOA软骨组织退变，调控软骨组织miR-107/Caspase-1/软骨细胞焦亡信号轴表达。

Abstract

Objective To observe the effect of acupotomy on cartilage degeneration and miR-107/Caspase-1/chondrocyte pyroptosis signal axis in knee osteoarthritis (KOA) rabbits. Methods Twenty-four 6-month-old male New Zealand rabbits were randomly divided into blank group, model group and acupotomy group, with 8 rabbits in each group. In the model group and the acupotomy group, the classical Videman method was used to establish the rabbit KOA model. The blank group and the model group were not intervened. In the acupotomy group, cord-like or nodular structures around the quadriceps tendon and medial/lateral collateral ligaments of the left knee were identified as acupotomy entry points. Acupotomy treatment was performed once weekly for 4 consecutive weeks. After the intervention, the wear of cartilage surface of the medial and lateral femoral condyle of the rabbit knee joint was observed. The pathological morphology of cartilage tissue was observed by hematoxylin and eosin (HE) staining and safranin O-fast green staining, and the pyroptosis of chondrocytes was observed by transmission electron microscope. Western blot was used to detect the protein expressions of Caspase-1, interleukin-1β (IL-1β), interleukin-18 (IL-18) and Collagen Ⅱ in knee cartilage tissue. qPCR was used to detect the expression of miR-107, and Caspase-1, IL-1β, IL-18, Collagen Ⅱ mRNA. Results Compared with the blank group, the knee joint cartilage surface of rabbits in the model group shows severe damage, the safranin staining of the cartilage matrix decreases, the degeneration of cartilage tissue is obvious, and obvious chondrocyte pyroptosis can be observed under the electron microscope. In the cartilage tissue of the model group, the expression levels of Caspase-1, IL-1β, IL-18 (both protein and mRNA) are all increased (P<0.05), while the expression levels of Collagen Ⅱ (both protein and mRNA) and miR-107 are all decreased (P<0.05). Compared with the model group, the knee joint cartilage surface of rabbits in the acupotomy group is relatively smooth, the safranin staining of the cartilage matrix decreases slightly, the degeneration of cartilage tissue is alleviated, and the phenomenon of chondrocyte pyroptosis is improved. In the cartilage tissue of the acupotomy group, the expression levels of Caspase-1, IL-1β, IL-18 (both protein and mRNA) are all decreased (P<0.05), while the expression levels of Collagen Ⅱ (both protein and mRNA) and miR-107 are all increased (P<0.05). Conclusion Acupotomy can delay the degeneration of cartilage tissue and regulate the expression of miR-107/Caspase-1/pyroptosis signal axis in cartilage tissue of rabbit KOA model.

Graphical abstract

关键词

膝骨关节炎 / 针刀 / 软骨细胞 / 细胞焦亡 / miR-107 / 半胱天冬蛋白酶1

Key words

knee osteoarthritis / acupotomy / chondrocyte / pyroptosis / miR-107 / Caspase-1

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是一种临床常见病和多发病，给社会经济带来极大负担，因此其防治工作愈来愈受到重视^［1］。针刀疗法在临床治疗早中期KOA中应用广泛，疗效显著^［2］，但其效应机制研究尚不深入。

软骨退变是KOA发生和发展的主要原因，改善软骨细胞功能对KOA康复至关重要^［3］。微小RNA（miRNA）可调控KOA的发展^［4］，研究显示，miR-107在KOA中表达下调，促进miR-107表达可减轻软骨细胞损伤^［5］，是KOA的潜在治疗靶点。细胞焦亡是一种受调节的细胞死亡方式，其在模式识别受体诱导半胱天冬蛋白酶1（Caspase-1）激活后发生，并能促进白细胞介素-1β（IL-1β）的释放，与KOA软骨退变等病理变化密切相关^［6］。研究表明，miR-107参与了KOA软骨细胞焦亡过程^［7］。本研究通过实验观察针刀治疗对兔KOA模型软骨退变及miR-107/Caspase-1/软骨细胞焦亡信号轴的影响，探讨针刀治疗KOA的效应机制。

1 实验材料

1.1 实验动物

6月龄普通级雄性新西兰兔24只，体质量（2.0±0.5）kg，购自上海松江区松联实验动物场，动物生产许可证号：SCXK（沪）2022-0006。动物由福建医科大学实验动物中心饲养，动物使用许可证号：SYXK（闽）2022-0005。本研究已通过福建医科大学动物实验伦理委员会批准（审批号：IACUC FJMU2022-0899）。

1.2 主要实验试剂与仪器

苏木素-伊红（HE）染色试剂盒（货号：G1125）、番红固绿染色试剂盒（货号：G1371）均购自北京索莱宝科技有限公司；Caspase-1抗体（货号：22915-1-AP）、白细胞介素-18（IL-18）抗体（货号：10663-1-AP）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体（货号：60004-1-Ig）均购自武汉三鹰生物技术有限公司；IL-1β抗体（货号：bs-6319R）、Ⅱ型胶原蛋白（Collagen Ⅱ）抗体（货号：bs-10589R）均购自北京博奥森生物技术有限公司；总RNA提取试剂盒［宝日医生物技术（北京）有限公司，货号：RR037A］、miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit（南京诺唯赞生物科技股份有限公司，货号：MR-101）；一次性使用无菌针刀（江西老宗医医疗器械有限公司，规格：0.4 mm×40 mm）；酶标仪（帝肯奥地利有限公司，型号：30174782）；高速冷冻离心机［山海天（苏州）科技有限公司，型号：TS1624R］；Lyser Pro 程序式冷冻组织破碎仪（型号：GS60201）、Arhat 96梯度PCR仪（型号：MP60101）、NaCha Pro多温区金属浴（型号：GT20404）均购自苏州莫纳生物科技有限公司。

2 方　法

2.1 分组及造模

24只新西兰兔适应性喂养1周后，采用随机数字表法分为空白组、模型组、针刀组，每组8只。模型组和针刀组参照经典Videman法造模^［8］，3%戊巴比妥钠（50 mg/kg）耳缘静脉注射麻醉后，将兔左后肢用石膏固定于完全伸直位（左膝关节伸直180°，左踝关节背屈60°），留出兔足趾以定期观察供血情况，连续制动6周。使用Lequesne膝关节评分进行KOA模型评估，Lequesne评分≥6分，表明造模成功^［9］。

2.2 干预方法

针刀组在造模成功后进行针刀干预，具体方法：在兔左膝关节周围股四头肌腱和内、外侧副韧带附近寻找条索或结节状物作为针刀的进针点，每次选取3~5个点，用无菌记号笔标记，消毒后依次行针刀治疗，刀口线平行于下肢纵轴垂直于皮肤快速刺入，到达骨面后稍微上提针刀，将刀口旋转90°，使针刀与下肢纵轴垂直，快速切割条索或结节状物3~5刀，出刀后用无菌纱布压迫止血。治疗时动物保持清醒状态，人工制动，利于观察治疗时和治疗后的反应。1次/周，连续干预4周。空白组与模型组均常规饲养，不做干预。

2.3 取材

针刀干预结束1周后，所有兔按1.5 mL/kg予3%戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉后，用空气栓塞法处死。剪取兔左膝关节股骨内外侧髁进行大体观察，取股骨内侧髁1/3组织标本放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h，用于观察软骨组织病理形态；剩余的2/3股骨内侧髁标本使用2.5%戊二醛固定12 h，用于透射电镜观察。刮取股骨外侧髁软骨组织，收集至EP管后，放入-80 ℃冰箱冻存。

2.4 观察指标

2.4.1 软骨组织病理改变

采用HE和番红固绿染色观察软骨组织病理形态改变情况。从4%多聚甲醛溶液中取出固定好的软骨组织，经脱钙、脱水、包埋、切片（厚度5 μm），按试剂说明书分别进行HE染色和番红固绿染色。染色完成后进行脱水、透明、封片，于倒置光学显微镜下观察并拍照。

2.4.2 软骨细胞焦亡超微结构

采用透射电镜法观察软骨细胞焦亡相关结构变化。取出固定后的软骨组织，经脱水、包埋、固化后制备超薄切片（厚度50~70 nm），使用醋酸铀与柠檬酸铅染色后，在透射电镜下观察细胞焦亡相关的超微结构变化。

2.4.3 Western blot检测软骨组织Caspace-1、IL-1β、IL-18和Collagen Ⅱ蛋白表达水平

取冻存的兔软骨组织，称重后用组织研磨仪研磨，加入适量裂解液裂解15 min，离心取上清液。BCA法测定蛋白浓度，加入5×loading buffer缓冲液后，95 ℃下进行蛋白变性，加样后经SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，牛奶封闭1 h，加入Caspace-1（1∶8 000）、IL-1β（1∶1 500）、IL-18（1∶8 000）、Collagen Ⅱ（1∶2 000）和GAPDH（1∶50 000）一抗4 ℃摇床孵育过夜。TBST洗涤后加入二抗（1∶10 000），室温摇床孵育2 h。加入显色液后进行显影并采集照片，使用Image Lab软件对条带进行分析，以目的蛋白与GAPDH蛋白条带灰度值的比值作为目的蛋白表达水平。

2.4.4 qPCR检测软骨组织miR-107及Caspace-1、IL-1β、IL-18、Collagen Ⅱ mRNA表达水平

按照RNA提取试剂盒说明书提取兔膝关节软骨组织总RNA，软骨组织用液氮进行充分研磨，Monzol™ Reagent裂解液进行组织裂解，使用超微量核酸蛋白检测仪测定RNA浓度，将提取的RNA作为模板进行cDNA的合成，逆转录体系20 μL，将试剂和引物混合，按说明书条件进行qPCR的扩增，反应体系20 μL。采用2^-∆∆Ct公式计算目的基因的相对表达量。本研究所用引物由福州尚亚生物技术有限公司合成设计，引物序列见表1。

2.5 统计学方法

采用SPSS 23.0统计软件分析数据。实验数据符合正态分布以（\overline{x}±s）表示。采用单因素方差分析比较组间差异，方差齐，采用LSD-t法进行两两比较；方差不齐，采用Games-Howell法进行两两比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结　果

3.1 3组膝关节股骨髁大体形态

取材时可见空白组兔左膝关节股骨髁软骨组织平滑规整，呈透明淡红色，无充血增生。模型组兔左膝关节股骨髁软骨组织质地粗糙，软骨可见明显缺损，充血明显；针刀组兔左膝关节股骨髁软骨组织形态较规整，组织充血程度较模型组明显减轻。见图1。

3.2 3组软骨组织病理改变

HE染色显示，空白组兔左膝关节软骨表面光滑，表层软骨细胞排列规则整齐；模型组兔左膝关节软骨表面出现严重破损，呈现大量剥脱缺损，表层软骨细胞稀少，排列紊乱；针刀组兔左膝关节软骨表面较为光滑，表层细胞较空白组有所减少，排列整齐。番红固绿染色显示，空白组兔软骨表面光滑，软骨基质呈红色，分布均匀，软骨细胞无明显簇集、减少，潮线完整清晰；模型组软骨基质番红染色明显减退，软骨细胞数量较空白组明显较少，成簇分布，潮线紊乱；针刀组兔软骨基质番红染色稍减退，软骨细胞数量有所减少，潮线尚清晰。见图2。

3.3 3组软骨细胞焦亡情况超微结构

透射电镜显示：空白组软骨细胞为椭圆形，细胞膜完整，细胞核膜完整，细胞器结构无破坏、数量和排列正常；模型组软骨细胞形态不规则，细胞肿大，绒毛减少或消失，细胞膜连续性断裂，胞核固缩，核膜皱缩，细胞器呈肿胀溶解状态；针刀组软骨细胞细胞膜相对完整，细胞核轻度皱缩，基质较致密，核膜边界明显，染色质聚集减少，细胞器结构尚可。见图3。

3.4 3组软骨组织Caspace-1、IL-1β、IL-18和Collagen Ⅱ蛋白表达水平比较

见表2和图4。

3.5 3组软骨组织miR-107及Caspace-1、IL-1β、IL-18、Collagen Ⅱ mRNA表达水平比较

见图5。

4 讨　论

中医学将KOA归属于“痹证”“膝痹”范畴^［10］，其核心病机可归纳为“气血失和、筋骨失衡”，故调和气血、调衡筋骨是治疗KOA的总体思路^［11］。针刀疗法是以现代解剖学为基础，以中医传统理论为指导的治疗方法。基于经筋理论和对KOA“气血失和、筋骨失衡”核心病机的科学认识，在经筋病灶点进行针刀松解，可达到调和气血、调衡筋骨的作用。膝关节软骨主要由软骨细胞和细胞外基质（ECM）组成^［12］。Collagen Ⅱ是ECM的重要成分，具有保护软骨细胞免受机械应力破坏的作用，其合成和分解代谢的平衡维持着正常关节的完整功能^［13］。本研究结果显示，针刀治疗可提高模型兔膝关节软骨组织Collagen Ⅱ表达，延缓软骨组织退变。

经典的细胞焦亡主要依赖于炎症小体激活的Caspase-1，Caspase-1表达增高与细胞焦亡信号传导有关^［14-15］。KOA软骨组织中Caspase-1的表达明显升高，作为产生活性IL-1β的关键酶，被激活的Caspase-1可促进成熟IL-1β的产生^［16］。IL-1β和IL-18是白细胞介素家族的重要成员，也是重要的炎症因子，可诱导软骨基质降解。KOA患者膝关节滑液中IL-1β高表达，且与软骨损伤程度呈正相关^［17］，其通过诱导软骨细胞和滑膜细胞产生炎症介质，促进滑膜炎症和骨质吸收，从而加速KOA的发展^［18］。研究发现miR-107参与了KOA的细胞焦亡过程，且miR-107可通过直接靶向Caspase-1，抑制其表达，进而减少IL-1β表达，抑制软骨细胞焦亡，促进Collagen Ⅱ分泌，从而最终达到改善KOA的作用^［7，19］。

本研究结果显示，模型组兔膝关节软骨细胞出现胞膜破裂，膜内基质及细胞器溶解，胞核皱缩等细胞焦亡的现象；miR-107表达降低，Caspace-1、IL-1β和IL-18表达均升高。经过针刀治疗后，兔膝关节软骨细胞焦亡现象得到抑制；miR-107表达升高，Caspace-1、IL-1β和IL-18表达均降低。

综上所述，miR-107介导Caspase-1细胞焦亡信号轴参与了KOA软骨组织退变过程，针刀治疗可能通过调控该信号轴表达，延缓兔KOA软骨组织退变。

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基金资助

福建省科技厅高校联合面上项目(2022J01131180)

福建省教育厅中青年教师教育科研项目(JAT231039)