透骨消痛胶囊含药血清介导lncRNA XIST/Nav1.7对软骨细胞退变的影响

摘要

目的 观察透骨消痛胶囊（TGXTC）含药血清介导长链非编码RNA（lncRNA）XIST/电压门控钠离子通道1.7亚型（Nav1.7）对软骨细胞退变的影响。 方法 取3周龄SPF级C57BL/6雄性小鼠20只，从小鼠膝关节分离关节软骨，提取软骨细胞并培养。将第2代软骨细胞悬液接种至6孔板后，随机分为sh-NC组、sh-XIST组、sh-NC＋IL-1β组和sh-XIST＋IL-1β组，分别给予含空载慢病毒、sh-XIST慢病毒、空载慢病毒＋IL-1β、sh-XIST慢病毒＋IL-1β的培养基干预24 h后，采用qPCR检测软骨细胞lncRNA XIST和Nav1.7 mRNA表达水平。将第2代软骨细胞悬液接种至6孔板后，随机分为sh-NC组、sh-NC＋IL-1β组、sh-XIST＋IL-1β组、sh-NC＋IL-1β＋TGXTC组和sh-XIST＋IL-1β＋TGXTC组，分别给予含空载慢病毒、空载慢病毒＋IL-1β、sh-XIST慢病毒＋IL-1β、空载慢病毒＋IL-1β、sh-XIST慢病毒＋IL-1β的培养基干预24 h后，sh-NC组、sh-NC＋IL-1β组和sh-XIST＋IL-1β组更换完全培养基继续培养24 h，sh-NC＋IL-1β＋TGXTC组和sh-XIST＋IL-1β＋TGXTC组更换15% TGXTC含药血清继续培养24 h，采用Western blot检测软骨细胞中Nav1.7、基质金属蛋白酶-3（MMP-3）、环氧化酶2（COX2）、含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶-5（ADAMTS-5）、半胱天冬蛋白酶3（Caspase-3）蛋白表达水平。 结果 与sh-NC组比较，sh-XIST组lncRNA XIST和Nav1.7 mRNA表达水平显著降低（P＜0.05）；与sh-NC＋IL-1β组比较，sh-XIST＋IL-1β组lncRNA XIST和Nav1.7 mRNA表达水平显著降低（P＜0.05）。与sh-NC组比较，sh-NC＋IL-1β组Nav1.7、MMP-3、COX2、ADAMTS-5和Caspase-3蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05）；与sh-NC＋IL-1β组比较，sh-XIST＋IL-1β组和sh-NC＋IL-1β＋TGXTC组Nav1.7、MMP-3、COX2、ADAMTS-5、Caspase-3蛋白表达水平均降低（P＜0.05）；与sh-NC＋IL-1β＋TGXTC组比较，sh-XIST＋IL-1β＋TGXTC组Nav1.7、MMP-3、COX2、ADAMTS-5、Caspase-3蛋白表达水平均升高（P＜0.05）。 结论 lncRNA XIST敲减可以抑制软骨细胞Nav1.7表达，TGXTC含药血清可能通过介导lncRNA XIST/Nav1.7表达，抑制软骨细胞退变。

Graphical abstract

关键词

骨关节炎 / 软骨细胞 / 透骨消痛胶囊 / lncRNA XIST / Nav1.7

骨关节炎（osteoarthritis，OA）作为退行性关节病变的典型代表，其病理特征主要为进行性关节软骨损伤，近年研究证实软骨基质降解程度与OA疼痛进展存在显著正相关性，提示延缓软骨退变进程可作为OA疼痛管理的干预策略^［1-3］。电压门控钠通道是在细胞膜上表达的多亚基跨膜糖蛋白，由α和β亚基组成，其α亚基1.7主要位于背根神经节神经元中^［4］，与疼痛的发生发展密切相关^［5-6］。研究显示，OA软骨细胞电压门控钠离子通道1.7亚型（Nav1.7）表达上调，敲低该基因可改善关节软骨结构，抑制分解代谢和软骨流失，减轻疼痛^［7］。研究表明，OA软骨细胞中长链非编码RNA（lncRNA）XIST的表达显著升高，导致促炎因子释放和软骨细胞外基质降解增加^［8-9］。另有研究证实，通过敲低lncRNA XIST可降低Nav1.7的表达，从而抑制大鼠卫星神经胶质细胞活化和炎性细胞因子水平，减轻炎性疼痛^［10］。

透骨消痛胶囊（TGXTC）作为福建中医药大学附属第二人民医院的院内制剂，可通过多靶点调控软骨代谢微环境，在止痛、关节功能恢复和软骨保护等方面显示出明确的治疗潜力^［11-13］。前期研究表明TGXTC可通过调节Nav1.7表达，改善软骨细胞外基质代谢紊乱，延缓OA软骨退变^［14］。基于上述研究，本研究通过体外实验观察TGXTC含药血清对lncRNA XIST/Nav1.7和软骨细胞退变相关蛋白表达的影响，进一步探讨该方延缓软骨退变的机制。

1 材　料

1.1 实验动物

3周龄SPF级C57BL/6雄性小鼠20只，体质量（12±5）g，用于提取原代软骨细胞。8周龄SPF级C57BL/6雄性小鼠30只，体质量（20±5）g，用于制备TGXTC含药血清。所有小鼠均购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物生产许可证号：SCXK（沪）2022-0004。动物实验全程于福建中医药大学实验动物中心SPF级屏障设施内实施，动物使用许可证号：SYXK（闽）2023-0004。本实验方案已通过福建中医药大学实验动物伦理委员会审批（审批号：FJTCMIACUC 1N2024113）。

1.2 实验药物与试剂

透骨消痛胶囊（福建中医药大学附属第二人民医院，闽药制备：Z20190010000，批号：202401015）；RNA提取试剂（批号：7E490L0）、逆转录试剂盒（批号：7E1010C4）均购自南京诺唯赞生物科技有限公司；白细胞介素-1β（IL-1β）抗体（美国Sigma公司，批号：MKCL5731）；含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶-5（ADAMTS-5）抗体（货号：bs-3573R）、基质金属蛋白酶-3（MMP-3）抗体（货号：bs-0413R）均购自北京博奥森生物技术有限公司；Nav1.7抗体（货号：20257-1-AP）、环氧化酶2（COX2）抗体（货号：27308-1-AP）、半胱天冬蛋白酶3（Caspase-3）抗体（货号：25128-1-AP）均购自武汉三鹰生物技术有限公司；sh-XIST慢病毒（福州载基生物科技有限公司，批号：20250411）。

1.3 实验仪器

全自动数码凝胶成像分析仪（上海培清科技有限公司，型号：JS-2012）；实时荧光定量PCR仪（型号：CFX96 Touch）、全自动酶标仪（型号：ELx800）均购自美国Bio-Tek公司。

2 方　法

2.1 TGXTC含药血清制备

取8周龄SPF级C57BL/6小鼠30只，进行临床等效剂量换算后，按368 mg/kg灌胃TGXTC，取TGXTC置于生理盐水中超声溶解，药物浓度为36.8 mg/mL，故灌胃量为10 mL/（kg‧d）。1次/d，6 d/周，持续给药4周^［14］。末次给药后执行12 h禁食处理，眼球取血，静置后离心，转速3 000 r/min，时间10 min，分离血清，56 ℃水浴30 min灭活补体，过滤除菌后分装，-80 ℃超低温冰箱冻存备用。

2.2 小鼠原代软骨细胞提取及培养

3周龄C57BL/6雄性小鼠经异氟醚深度麻醉后实施颈椎脱位处死，使用75%无水乙醇对后肢膝关节周围区域进行严格消毒。通过显微解剖技术逐层切开，暴露膝关节腔，获取完整关节软骨后转移至无菌操作台。将软骨组织剪成约1 mm×1 mm×1 mm的组织块，采用0.2% Ⅱ型胶原酶消化液于37 ℃培养箱中消化2 h后，取上清液离心，转速1 000 r/min，时间5 min，弃除上清液后加入完全培养基培养。经传代后，选用生物学特性稳定的第2代软骨细胞作为研究对象^［15］。

2.3 实验分组与干预

2.3.1 lncRNA XIST敲减对软骨细胞Nav1.7表达的影响

将第2代软骨细胞悬液以1×10⁵个/mL密度接种至6孔板后，随机分为sh-NC组、sh-XIST组、sh-NC＋IL-1β组和sh-XIST＋IL-1β组，分别给予含空载慢病毒、sh-XIST慢病毒（病毒滴度：2.0×10⁸ TU/mL，感染复数：27）、空载慢病毒＋IL-1β、sh-XIST慢病毒＋IL-1β的培养基干预，各组IL-1β浓度均控制在10 ng/mL。干预24 h后收集细胞。

2.3.2 TGXTC含药血清对软骨细胞lncRNA XIST/Nav1.7表达的影响

将第2代软骨细胞悬液以1×10⁵个/mL密度接种至6孔板后，随机分为sh-NC组、sh-NC＋IL-1β组、sh-XIST＋IL-1β组、sh-NC＋IL-1β＋TGXTC组和sh-XIST＋IL-1β＋TGXTC组，分别给予含空载慢病毒、空载慢病毒＋IL-1β、sh-XIST慢病毒＋IL-1β、空载慢病毒＋IL-1β和sh-XIST慢病毒＋IL-1β的培养基，各组IL-1β浓度均控制在10 ng/mL。干预24 h后，sh-NC组、sh-NC＋IL-1β组和sh-XIST＋IL-1β组更换完全培养基继续培养24 h后收集细胞，sh-NC＋IL-1β＋TGXTC组和sh-XIST＋IL-1β＋TGXTC组更换15% TGXTC含药血清继续培养24 h后收集细胞^［16］。

2.4 软骨细胞lncRNA XIST和Nav1.7 mRNA表达水平

按“2.3.1”项下分组干预完成后，收集软骨细胞，采用实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）检测lncRNA XIST和Nav1.7 mRNA表达。用TRIzol法提取细胞总RNA，检测RNA浓度后，根据逆转录试剂盒说明书配制逆转录反应液，置于梯度热循环仪中反应获得cDNA。根据试剂盒说明书取cDNA、反应试剂和引物配制qPCR反应体系，置于实时荧光定量基因扩增仪中反应。热循环条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，循环32次；72 ℃最终延伸5 min。以GAPDH为内参，采用2^-∆∆Ct法计算lncRNA XIST和Nav1.7 mRNA转录水平。本研究所用引物由福州尚亚生物技术有限公司合成，引物序列见表1。

2.5 软骨细胞Nav1.7、MMP-3、COX2、ADAMTS-5和Caspase-3蛋白表达水平

按“2.3.2”项下分组干预完成后，收集软骨细胞，采用Western blot检测Nav1.7、MMP-3、COX2、ADAMTS-5和Caspase-3蛋白表达水平。采用细胞裂解液提取总蛋白，BCA法定量。采用SDS-PAGE凝胶制备试剂盒制胶，上样后经电泳分离，转膜，封闭，加入一抗（GAPDH稀释比例为1∶5 000；Nav1.7、MMP-3、COX2、ADAMTS-5和Caspase-3稀释比例均为1∶1 000）4 ℃摇床孵育过夜，次日二抗室温摇床孵育1 h。按照1∶1避光配制显影液，将条带置于成像仪内，均匀滴加显影液反应显影。采用Image Lab分析条带灰度值，以GAPDH为内参，计算目的蛋白相对表达量。

2.6 统计学方法

采用SPSS 27.0软件进行数据分析。计量资料符合正态分布用（\overline{x}±s）表示，采用单因素方差分析进行多组间差异性比较，方差齐性条件成立时，选用LSD-t法进行两两比较；方差齐性假设不成立时，则采用Games-Howell法进行两两比较。P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结　果

3.1 4组lncRNA XIST和Nav1.7 mRNA表达水平比较

见表2。

3.2 5组Nav1.7、MMP-3、COX2、ADAMTS-5和Caspase-3蛋白表达水平比较

见图1和表3。

4 讨　论

lncRNA是一类长度超过200个核苷酸、不编码蛋白质的RNA分子，lncRNA虽然不生产蛋白质，但它们从表观遗传调控、转录调控、转录后调控等多个层面精细调控基因的表达。研究显示，在炎症性疼痛模型大鼠背根神经节的大鼠卫星神经胶质细胞中，lncRNA XIST可以调控Nav1.7的表达，改善炎性疼痛^［10］。本研究通过慢病毒转染敲减软骨细胞lncRNA XIST表达，验证lncRNA XIST对软骨细胞Nav1.7的调控作用，结果显示OA软骨细胞lncRNA XIST及Nav1.7 mRNA表达均显著上调；敲减正常软骨细胞或OA软骨细胞的lncRNA XIST后，均可以下调Nav1.7 mRNA表达。初步验证了OA软骨细胞中lncRNA XIST对Nav1.7的调控关系。

软骨细胞凋亡和软骨细胞外基质合成与降解失衡是OA关节软骨破坏的主要原因。MMP-3和ADAMTS-5是重要的软骨基质降解蛋白酶，能够降解软骨基质中的聚集细胞多糖，破坏软骨结构完整性，导致软骨的缓冲和抗压能力下降^［17-18］。Caspase-3是调节细胞凋亡的重要因子，沉默Caspase-3能够显著抑制软骨细胞炎症和凋亡基因表达，有效减轻软骨损伤^［19］。COX2在OA软骨中高度表达，COX2抑制剂可改善OA模型小鼠的软骨降解和疼痛敏感性^［20］。本研究采用lncRNA XIST敲减慢病毒和TGXTC含药血清干预退变软骨细胞，探讨TGXTC对软骨细胞退变和lncRNA XIST/Nav1.7表达的影响。结果显示，退变软骨细胞Nav1.7、MMP-3、COX2、ADAMTS-5和 Caspase-3高表达，敲减lncRNA XIST和TGXTC含药血清均可降低上述蛋白的表达水平，但同时对lncRNA XIST进行敲减和给予TGXTC含药血清干预，这一趋势减弱，可见lncRNA XIST是TGXTC发挥作用的重要靶点。以上研究表明，TGXTC含药血清可能通过介导lncRNA XIST/Nav1.7，抑制软骨细胞退变相关蛋白表达。

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基金资助

福建中医药大学校管课题(X2023024)

陈可冀中西医结合发展基金项目(CKJ2023004)