基于UPLC-MS/MS技术及多元统计分析的人参归脾丸中人参皂苷类成分定性与定量研究

摘要

目的 采用超高效液相色谱-串联质谱联用（UPLC-MS/MS）技术，对人参归脾丸中的人参皂苷类成分进行定性与定量分析，并结合多元统计分析评价不同批次人参归脾丸质量。 方法 采用Thermo Fisher Scientific Accucore Phenyl Hexyl色谱柱（2.1 mm×100 mm，2.6 μm），以0.1%甲酸水溶液-乙腈为流动相进行梯度洗脱，流速为0.4 mL/min，柱温为35 ℃，进样量为2 μL，采用加热电喷雾离子源（HESI），在负离子模式下使用全扫描/数据依赖二级扫描（Full Scan/ddMS²），基于保留时间、精确质量数（误差≤5 ppm）及碎片离子特征定性人参归脾丸中的人参皂苷类成分，并采用多反应监测模式（MRM）扫描，测定10批人参归脾丸中的人参皂苷类成分含量，对测定结果进行主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）和熵权-优劣解距离分析（EWM-TOPSIS）。 结果 从人参归脾丸中鉴定出18种人参皂苷类成分，定量分析显示其中的16种人参皂苷类成分在各自质量浓度范围内线性关系良好，精密度、重复性、稳定性的相对标准偏差（RSD）均＜5%，平均加样回收率均在99.20%~101.50%，RSD均在0.90%~5.00%。PCA和OPLS-DA的结果均按得分将10批人参归脾丸分为2类，其中S1、S3、S4、S6、S7、S8归为A类，S2、S5、S9、S10归为B类；人参皂苷Rb₁、人参皂苷Re、人参皂苷Rg₁、人参皂苷Rb₂、人参皂苷Rc、人参皂苷Rd的变量重要性投影值均＞1，是引起产品质量差异的关键成分；EWM-TOPSIS结果表明不同批次的人参归脾丸在综合质量上具有差异性。 结论 本研究所建立的方法能快速测定人参归脾丸中的人参皂苷成分，结合多元统计学筛选出的6种影响产品质量的差异性成分，可用于人参归脾丸的质量评价。

Graphical abstract

关键词

人参归脾丸 / 人参皂苷 / 超高效液相色谱-串联质谱联用技术 / 定性 / 定量 / 多元统计分析 / 质量控制

人参归脾丸处方源于宋代《济生方》中的归脾汤，由人参、白术、茯苓、甘草、黄芪、当归、木香、远志、龙眼肉、酸枣仁组成，具有益气补血、健脾养心的功效，收载于《中华人民共和国卫生部药品标准（中药成方制剂第四册）》^［1］，临床上常用于治疗神经系统、血液系统、免疫系统等方面的疾病^［2-3］。现代药理研究表明，人参归脾丸具有保肝、抗肿瘤活性等作用^［4-5］。

君药是中药方剂的“主帅”，其活性成分含量直接影响了中成药是否具备预期的治疗价值。人参作为人参归脾丸的君药，其活性成分含量检测是人参归脾丸质量控制体系中的重点。人参皂苷类成分是人参的主要活性成分，在该组方中发挥重要的药理效应^［6］。超高效液相色谱-串联质谱联用（UPLC-MS/MS）技术检测人参皂苷类成分具有高灵敏度、高选择性，易与其他药材成分的质谱进行区分^［7］，对评价人参归脾丸质量和工艺稳定性方面具有指示性作用。本研究采用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱质谱技术^［8］对人参归脾丸中的人参皂苷类成分进行定性，采用超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱技术对人参归脾丸中16个人参皂苷类成分进行含量测定，并结合多元统计分析不同批次的人参归脾丸产品质量，筛选潜在的质量评价成分，为其质量控制研究提供参考。

1 材料与仪器

1.1 实验仪器

Dionex Uitimate 3000超高效液相色谱仪、Q Exactive Plus Orbitrap MS四极杆-静电场轨道阱质谱仪、TSQ ALTIS MS三重四级杆质谱仪（配备HESI）、Thermo Fisher Scientfic Accucore Phenyl Hexyl色谱柱（2.1 mm×100 mm，2.6 µm）均购自美国赛默飞世尔科技公司；超纯水制备仪（德国Millipore公司，型号：MILLI-Q Direct16）；十万分之一电子天平（德国Sartorius公司，型号：CPA225D）；静音超声仪（昆山小美超声仪器有限公司，型号：XM-400UHP）。

1.2 实验试剂与样品

人参皂苷Re、人参皂苷Rg₁、人参皂苷F₃、人参皂苷Ra₂、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Ro、人参皂苷Rc、人参皂苷F₁、人参皂苷Ra₁、人参皂苷Rb₂、人参皂苷Rb₃、竹节皂苷Ⅳa、人参皂苷Rd、柴胡皂苷A、20（R）人参皂苷Rg₃、人参皂苷Rg₅（批号分别为：J10N11A130576、C27N11Q132589、M31M9S62752、M16N10S103011、N18GB163839、A02 IB211532、N27HB202514、M06GB166739、M13HB178117、A26IB213699、A11IB222725、C19D10S106246、A26GS146528、G15S11L124709、A29GB144936、J28 IB220414）均购自上海源叶生物科技有限公司，纯度均≥99%；20（S）人参皂苷Rg₃（上海陶术生物科技有限公司，批号：141680，纯度≥99%）；人参皂苷Rf（北京百灵威科技有限公司，批号：140715，纯度≥99%）；人参皂苷Rg₂（北京赛百草科技有限公司，批号：SH0763，纯度≥99%）。甲醇（美国赛默飞世尔公司，LC-MS级）；甲酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，HPLC级）。10批次人参归脾丸（S1~S10，北京同仁堂股份有限公司，批号分别为：23011369、23010131、23010467、24010085、23010197、23011499、23010090、23011362、23010468、24010095），白术、茯苓、甘草、黄芪、当归、木香、远志、龙眼肉、酸枣仁（批号分别为：20250222、F0422113、20250317、2507020 278、250808165、202401023、221201、250301、231220）均购自福州闽侯上街致诚医药商店。

2 方　法

2.1 对照品溶液及内标溶液的配制

分别精密称取人参皂苷Re、人参皂苷Rg₁、人参皂苷Rf、人参皂苷F₃、人参皂苷Rg₂、人参皂苷Ra₂、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Ro、人参皂苷Rc、人参皂苷F₁、人参皂苷Ra₁、人参皂苷Rb₂、人参皂苷Rb₃、人参皂苷Rd、竹节参皂苷Ⅳa、20（S）-人参皂苷Rg₃对照品适量，加入甲醇溶解，分别稀释成浓度为1 mg/mL的各单一对照品母液。分别精密量取各对照品母液适量，置于量瓶中，用甲醇稀释制得混合对照品溶液，各成分浓度分别为4 060、8 280、2 370、515、1 770、655、7 000、5 940、3 360、860、127、3 850、1 755、7 320、455、396 ng/mL。精密称取柴胡皂苷A对照品适量，用甲醇溶解，配制成浓度为1 mg/mL的内标母液，使用时用甲醇稀释至浓度为150 ng/mL的内标溶液。

2.2 供试品溶液的制备

取人参归脾丸适量，按1∶1比例加入硅藻土，研细，取约0.5 g，精密称定，置于锥形瓶中，加入甲醇25 mL，充分摇匀，称定重量，超声处理（功率400 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再次称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，取上清液经0.22 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。精密量取供试品溶液适量，按等体积比加入内标溶液混匀后，注入LC-MS系统进样分析。

2.3 阴性对照溶液的制备

精密称取白术、茯苓、甘草、黄芪、当归、木香、远志、龙眼肉、酸枣仁药材粉末，置于锥形瓶中，按“2.2”项下方法操作，即得阴性对照溶液。

2.4 色谱条件

采用Thermo Fisher Scientific Accucore Phenyl Hexyl色谱柱（2.1 mm×100 mm，2.6 µm），柱温：35 ℃；以含0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）为流动相进行梯度洗脱（0~14.0 min，73% A/27% B；14.0~15.0 min，73%~65% A/27%~35% B；15.0~19.8 min，65% A/35% B；19.8~20.0 min，65%~64% A/35%~36% B；20.0~25.0 min，64%~48% A/36%~52% B；25.0~25.5 min，48%~10% A/52%~90% B；25.5~26.0 min，10%~73% A/90%~27% B；26.0~27.5 min，73% A/27% B）；流速：0.4 mL/min；进样量：2 μL。

2.5 质谱条件

采用加热电喷雾离子源（HESI）负离子扫描模式，参数如下，喷雾电压：2.8 kV（-），鞘气流速：45 Arb，辅助气流速：10 Arb，吹扫气体流速：0 Arb，离子传输管温度：320 ℃，喷雾器温度：350 ℃；采用全扫描/数据依赖二级扫描（Full Scan/ddMS²）和多反应监测模式（MRM）扫描模式进行数据采集。

2.6 人参归脾丸中人参皂苷类成分鉴定

按照“2.4”和“2.5”项下LC-MS条件，样品溶液经色谱分离后进行Q Exactive Plus Orbitrap MS四极杆-静电场轨道阱质谱仪检测，采用Xcalibur 4.0质谱系统的全质量轴扫描模式，以5 ppm质量误差阈值筛选候选分子式并进行数据库匹配，并通过对比样品与18种对照品在相同分析条件下的色谱保留时间及质谱碎片离子信息进行确证。

2.7 定量分析方法学考察

2.7.1 专属性考察

采用超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱的MRM扫描模式进行数据采集，得到各待测成分及内标物的质谱优化参数及阴性溶液、对照品溶液及供试品溶液中各成分的MRM色谱图。

2.7.2 线性回归方程及检测限、定量限考察

精密量取“2.1”项下制备的混合对照品溶液适量，用甲醇稀释成系列浓度的混合对照品溶液。以待测成分与内标物的峰面积之比（Ai/As）为纵坐标，待测成分浓度为横坐标，拟合线性方程。并分别以信噪比S/N＝3和S/N＝10，计算方法的检测限和定量限。

2.7.3 精密度试验

取混合对照品溶液适量，分别配制低、中、高3个浓度梯度，当天连续进样6次测定其日内精密度；连续测定3 d，计算日间精密度。

2.7.4 重复性试验

精密称取同一批次人参归脾丸（S1），分为6份，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液，加入内标液后，按“2.4”和“2.5”项下条件进行测定，计算各待测成分含量及相对标准偏差（RSD）。

2.7.5 稳定性试验

取同一批次人参归脾丸（S1），按“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别于制备后0、2、4、6、8、12、24、48 h进行测定，计算各待测成分峰面积RSD值。

2.7.6 加样回收率试验

精密称定同一批次人参归脾丸（S1）与硅藻土的混合物约0.25 g，平行9份，分为3组，分别精密加入低、中、高水平（相当于样品含量的50%、100%、150%）的混合对照品溶液，按“2.2”项下方法制备为供试品溶液，加入内标溶液后，按“2.4”和“2.5”项下条件进行测定，记录峰面积，计算各待测成分的加样回收率。

2.8 样品含量测定

取10批人参归脾丸样品（S1~S10），按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.4”和“2.5”项下条件进行测定，计算样品中16种人参皂苷成分的含量。

2.9 多元统计分析

2.9.1 主成分分析（PCA）

利用SPSS 26.0软件，以10个批次人参归脾丸的16种人参皂苷类成分含量作为变量，进行PCA分析。

2.9.2 正偏交最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）

采用SIMCA 14.1软件构建OPLS-DA模型进行成分特征解析，探究不同批次人参归脾丸中16种人参皂苷类成分的异同，并筛选差异标志物。

2.9.3 熵权-优劣解距离分析（EWM-TOPSIS）

利用SPSSAU数据平台进行熵权TOPSIS分析，以OPLS-DA分析的VIP值作为各评价指标的权重，建立趋势化、归一化和加权决策矩阵，进行相对接近度的计算及评价^［9］，对不同批次人参归脾丸中的16种人参皂苷类成分含量的熵权TOPSIS模型进行综合评价排序。

3 结　果

3.1 人参归脾丸中人参皂苷类成分鉴定结果

经对照品比对，共鉴定出18种人参皂苷成分，见表1。由于人参皂苷Rg₅及20（R）-人参皂苷Rg₃的含量低于检测仪器的定量限，难以得到准确可靠的含量测定结果，故选择其余16种成分进行后续含量测定。

3.2 专属性考察结果

各待测成分及内标物的质谱优化参数见表2，阴性溶液、对照品溶液及供试品溶液中的各成分的MRM色谱图见图1。结果表明16个成分及内标分离度均良好，且阴性成分无干扰，符合定量分析要求。

3.3 线性回归方程及检测限、定量限结果

各待测成分在各自浓度范围内线性关系良好，且建立的检测方法展现出较好的灵敏度，见表3。

3.4 精密度试验结果

日内精密度的RSD为0.60%~4.90%，日间精密度的RSD为0.30%~4.90%，表明仪器的精密度良好。

3.5 重复性试验结果

同一批次人参归脾丸（S1）中人参皂苷Re、人参皂苷Rg₁、人参皂苷Rf、人参皂苷F₃、人参皂苷Rg₂、人参皂苷Ra₂、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Ro、人参皂苷Rc、人参皂苷F₁、人参皂苷Ra₁、人参皂苷Rb₂、人参皂苷Rb₃、人参皂苷Rd、竹节参皂苷Ⅳa、20（S）-人参皂苷Rg₃的含量分别为（56.80±2.65）、（29.50±3.56）、（16.50±0.82）、（4.20±0.20）、（25.50±1.42）、（10.80±0.16）、（79.10±3.94）、（29.80±1.85）、（35.00±1.87）、（1.30±0.06）、（5.20±0.22）、（43.20±1.63）、（5.30±0.15）、（32.70±0.74）、（1.10±0.10）、（2.30±0.06） μg/g，RSD为1.70%~4.80%，表明该方法的重复性良好。

3.6 稳定性试验结果

供试品溶液制备后0、2、4、6、8、12、24、48 h，各待测成分峰面积RSD值为2.10%~4.20%，表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

3.7 加样回收率试验结果

人参皂苷Re、人参皂苷Rg₁、人参皂苷Rf、人参皂苷F₃、人参皂苷Rg₂、人参皂苷Ra₂、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Ro、人参皂苷Rc、人参皂苷F₁、人参皂苷Ra₁、人参皂苷Rb₂、人参皂苷Rb₃、人参皂苷Rd、竹节参皂苷Ⅳa、20（S）-人参皂苷Rg₃的平均加样回收率分别为99.30%、100.10%、100.70%、101.80%、99.90%、100.10%、100.80%、99.20%、101.60%、98.60%、99.90%、100.50%、100.00%、101.50%、101.50%、100.60%，RSD值为0.90%~5.00%，表明该方法准确度良好。

3.8 样品含量测定结果

10批人参归脾丸样品（S1~S10）中16种人参皂苷成分的含量见表4。

3.9 多元统计分析结果

3.9.1 PCA结果

主成分特征值及方差贡献率分析显示，提取出的2个主成分的累计方差贡献率达到94.85%，见表5，表明这两个主成分能充分体现人参归脾丸的原始变量信息。使用SIMCA 14.1绘制PCA图，如图2所示，10个批次的人参归脾丸可被分为2类，其中S1、S3、S4、S6、S7、S8归为A类，S2、S5、S9、S10归为B类。

3.9.2 OPLS-DA结果

10批人参归脾丸OPLS-DA模型中自变量解释度（R²x）为0.945，因变量拟合度（R²y）为0.926，预测效能指数（Q²）为0.766，R²和Q²值均＞0.5，表明该模型的预测性能良好，且得分图聚类形态与PCA分析结果吻合，见图3。经200次置换检验验证，Q²回归线截距为负值，排除了过拟合风险，模型稳定可靠，见图4。同时计算了16种人参皂苷类成分的变量重要性投影（VIP）值，以VIP值≥1为标准，筛选出了人参皂苷Rb₁（VIP值＝1.70）、人参皂苷Re（VIP值＝1.58）、人参皂苷Rg₁（VIP值＝1.47）、人参皂苷Rb₂（VIP值＝1.45）、人参皂苷Rc（VIP值＝1.34）、人参皂苷Rd（VIP值＝1.17）这6种重要成分，见图5。

3.9.3 EWM-TOPSIS结果

在TOPSIS模型中，正理想解距离值越小表明样品越接近最优状态，负理想解距离值越大则表明样品越远离最劣状态，相对接近度值则同时兼顾与最优解的接近度和与最劣解的远离度，并作为样品综合质量优劣的判断值。10个批次人参归脾丸样品的相对接近度存在一定程度的波动，即在综合质量上存在一定的差异性，见表6。

4 讨　论

人参为人参归脾丸中的君药，且为贵细药材，因此市面上有些药品生产企业为降低生产成本，可能会以西洋参边角料冒充人参进行投料，本研究旨在探究人参归脾丸的质量控制标准。定性分析结果共鉴定出人参归脾丸中的18种人参皂苷成分。其中人参皂苷Ra₁、人参皂苷Rb₂、人参皂苷Rc等成分具有保护心肌、抗疲劳、增强免疫等药理作用^［10］，为人参归脾丸的潜在药效物质群。由于人参皂苷Rg₅及20（R）-人参皂苷Rg₃的含量低于检测仪器的定量限，故不作为后续含量测定的指标。此外，柴胡皂苷A为齐墩果烷型五环三萜皂苷，与检测指标中的人参皂苷结构相近，且在人参归脾丸中未检出，故本研究选择柴胡皂苷A作为内标物。

样品含量测定显示各批次总成分含量差异较大，表明药品的质量可能受到批次间差异的影响。作为评估批次间质量差异的有效手段，PCA分析将成分含量高低10批人参归脾丸分为2类。OPLS-DA分析显示人参皂苷Rb₁、人参皂苷Re、人参皂苷Rg₁、人参皂苷Rb₂、人参皂苷Rc、人参皂苷Rd在人参归脾丸中含量比重较大，具有作为区分不同批次人参归脾丸的质量标志成分的潜力。EWM-TOPSIS分析可以反映样品的综合质量，其中成分含量最高的批次S9排序第一，在10个批次中的综合质量最优，而成分含量最低的批次S4则排序最后，综合质量最劣，成分含量的差异是导致不同批次间质量差异的核心原因。综上，10个批次的人参归脾丸在质量上存在偏差，考虑到其都来源于同一厂家，造成这种差异的原因可能是由于人参药材的产地、批次不同等多种因素协同作用所致。相关厂家可围绕上述成分建立相应的质量控制体系，并严格把控原料药材质量与制剂工艺参数，以提高产品的稳定性。

综上所述，本研究基于UPLC-MS/MS技术，初步建立了人参归脾丸中人参皂苷类成分的定性及定量分析方法，该法能快速鉴定人参归脾丸中的人参皂苷成分，在短时间内快速实现对目标成分的基本分离，并结合多元统计学筛选出6个影响产品质量的差异性成分，可用于人参归脾丸的质量评价。

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基金资助

国家自然科学基金面上项目(82274080)