针刀髌周松解法对膝骨性关节炎兔线粒体凋亡通路的影响

Effect of Acupotomy Peripatellar Relaxation on Mitochondrial Apoptosis Pathway in Rabbits with Knee Osteoarthritis

摘要

目的 探讨经筋理论指导下针刀髌周松解法对膝骨性关节炎（KOA）兔线粒体凋亡通路的影响。 方法 采用随机数字表法将18只6月龄健康雄性新西兰兔分为空白组、模型组和针刀组，每组6只。参考改良的Videman法，将模型组和针刀组兔的左后肢制动6周以制备兔KOA模型，以Lequesne MG行为学评分总分≥4分认为造模成功。针刀组选取股内侧肌、股外侧肌、髌内侧支持带、髌外侧支持带、髌韧带在髌骨上的附着点及鹅足腱胫骨内髁附着点行针刀松解，每周1次，共4次。其余2组正常饲养，只进行同样抓取及固定，不予治疗。干预结束后1周，取3组兔的膝关节软骨组织样本，采用甲苯胺蓝染色观察软骨组织形态学变化，Western blot和RT-qPCR检测软骨细胞内线粒体凋亡通路中凋亡关键指标［肿瘤蛋白P53（P53）、抗凋亡关键指标B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、相关X蛋白（Bax）、细胞色素C（Cyt C）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、半胱氨酸蛋白酶-9（Caspase-9）、Bcl-2］的蛋白相对表达量和mRNA转录水平变化。 结果 与空白组比较，模型组软骨面粗糙，软骨细胞排列疏松紊乱、数量减少、存在明显空泡细胞、蓝染明显减少，潮线模糊，P53、Bax、Cyt C、Caspase-3、Caspase-9蛋白相对表达量和mRNA转录水平升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白相对表达量和mRNA转录水平下降（P＜0.05）；与模型组比较，针刀组软骨面平滑程度有所改善，软骨细胞排列较为均匀、数量有所增加、蓝染稍减少，潮线模糊程度有所改善，P53、Bax、Cyt C、Caspase-3、Caspase-9蛋白相对表达量和mRNA转录水平下降（P＜0.05），Bcl-2蛋白相对表达量和mRNA转录水平升高（P＜0.05）。 结论 针刀髌周松解法能够影响线粒体凋亡通路，有效减少KOA兔凋亡基因P53、Bax、Cyt C、Caspase-3、Caspase-9的表达，增加抗凋亡基因Bcl-2的表达，从而延缓软骨退变。

Abstract

Objective To explore the effect of patellar periarticular release under the guidance of the theory of muscular region on the mitochondrial apoptotic pathway in rabbits with knee osteoarthritis (KOA). Methods Using the random number table method, 18 healthy male New Zealand rabbits aged 6 months were randomly divided into blank group, model group and acupotomy group with 6 rabbits in each group. According to the modified Videman method, the left hind limbs of the rabbits in the model and acupotomy groups were immobilized for 6 weeks to prepare the rabbit KOA models. The total score of Lequesne MG behavioral assessment was≥4 points which indicted KOA models were established successfully. The acupotomy group selected the attachment points of the medial and lateral femoral muscles, the medial and lateral patellar support bands, the lateral patellar ligament on the patella, and the attachment point of the gastrocnemius tendon to the tibial medial condyle for acupotomy release, once a week for 4 times. The other two groups were raised normally and only underwent the same grasping and fixation without treatment. One week after the intervention, knee joint cartilage tissue samples were taken from the rabbits in all groups. Using toluidine blue staining, the morphological changes of the cartilage tissue were observed. Western blot and RT-qPCR were used to detect the relative protein expression levels and mRNA transcriptional levels of key apoptotic indicators, such as tumor protein P53 (P53), B-cell lymphoma-2 protein (Bcl-2) related X protein (Bax), cytochrome C (Cyt C), caspase-3, caspase-9, and anti-apoptotic key indicators such as Bcl-2 in the cartilage cells of the mitochondrial apoptotic pathway. Results Compared with the blank group, the cartilage surface of the model group was rough, the arrangement of chondrocytes was loose and disordered, the number of chondrocytes decreased, there were obvious vacuoles, blue staining decreased obviously, the tide line was blurred, the relative expression of P53, Bax, Cyt C, Caspase-3, Caspase-9 protein relative expressions and mRNA transcription levels increased (P<0.05), Bcl-2 protein relative expression and mRNA transcription level decreased (P<0.05); Compared with the model group, the smoothness of cartilage surface improved, chondrocytes arranged more evenly and the number of which increased, blue staining decreased slightly, the fuzzy degree of tidal line improved, the relative expression of P53, Bax, Cyt C, Caspase-3, Caspase-9 protein relative expressions and mRNA transcription levels decreased (P<0.05), Bcl-2 protein relative expressions and mRNA transcription level increased in the acupotomy group (P<0.05). Conclusion The acupotomy peripatellar relaxation method can affect the mitochondrial apoptosis pathway, effectively reduce the expression of apoptotic genes like P53, Bax, Cyt C, Caspase-3, and Caspase-9 in KOA rabbits, and increase the expression of anti-apoptotic gene Bcl-2, and delaying cartilage degeneration.

Graphical abstract

关键词

膝骨性关节炎 / 针刀 / 线粒体 / 凋亡 / 软骨细胞

Key words

knee osteoarthritis / acupotomy / mitochondrion / apoptosis / chondrocyte

膝骨性关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是最常见的一种关节退化形式，主要病理表现为软骨退变及骨赘增生，临床表现为关节疼痛、僵硬及下肢肌肉无力，进而导致活动功能受限^［1］。《素问·痿论》曰：“宗筋主束骨而利机关也。”中医经筋理论常从力学角度出发，认为“筋骨失衡”是引起KOA发病的主要原因。膝关节作为人体最大、最复杂的关节，当年龄、肥胖、外伤、劳损等多种因素引起膝关节软组织受损时，受损组织周围将逐渐形成“筋结”，导致其“约束诸骨、协理关节”的功能失调，进而加重骨关节的负荷，引发“骨病”。与此同时，“骨病”所表现的力线异常和应力分布不均将进一步加剧“筋伤”，促使更多“筋结”形成。这种“筋伤”与“骨病”互为因果、相互促进的恶性循环，构成了KOA发生发展的关键机制^［2-3］。近几十年来KOA的患病率和发病率不断增加，已影响着全球超过2.5亿的人口，KOA在50岁以上人群的全球残疾性疾病中排名第12位^［4］。因此，积极探寻一种作用机制明确且有助于延缓疾病进展的干预手段具有重要意义。

据报道，针刀疗法的松解功效有助于解除关节周围局部的异常高张力点，改善KOA发病过程中关节软骨面应力集中的问题，从而延缓软骨退变^［5-6］。本课题组前期研究发现：KOA软骨细胞的凋亡率明显高于正常软骨细胞，应用针刀疗法干预后，软骨细胞的凋亡率显著降低，软骨退变状况有所改善^［7］。细胞凋亡是一种细胞程序性死亡过程，属于“免疫沉默式”细胞非裂解型死亡^［8］。细胞凋亡主要受死亡受体活化通路、线粒体信号通路和内质网信号通路的调控，其中线粒体信号通路在细胞凋亡过程中发挥重要作用^［9］。

该通路的关键调控环节发生于线粒体膜上：B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）家族蛋白定位于线粒体外膜，其成员间的平衡直接控制着线粒体膜的通透性。当接收到凋亡刺激信号时，凋亡关键指标如Bcl-2相关X蛋白（Bax）的表达增加，并迁移至线粒体膜上，导致膜通透性增加，促使细胞色素C（Cyt C）从线粒体间隙释放到细胞质中。释放出的Cyt C会与凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）及半胱氨酸蛋白酶-9（Caspase-9）前体结合，共同形成“凋亡小体”，从而启动下游包括半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）在内的Caspase级联反应，最终不可逆地执行细胞凋亡程序。而肿瘤蛋白p53（p53）作为重要的上游调控因子，可转录激活Bax等促凋亡蛋白的表达，进一步整合并放大凋亡信号^［10］。

基于上述机制，本研究聚焦于针刀疗法对线粒体凋亡通路的核心分子，通过检测能够直接反映线粒体膜调控的Bcl-2/Bax蛋白、反映线粒体内容物释放的Cyt C蛋白及下游凋亡小体形成与激活的Caspase-9、Caspase-3蛋白等这一连续过程的关键指标，旨在从分子层面探寻针刀疗法是否通过干预线粒体凋亡通路来抑制软骨细胞凋亡，从而延缓KOA软骨退变。

1 实验材料

1.1 实验动物

购进18只6月龄健康雄性新西兰兔，体质量2.00～2.25 kg，由杭州富阳红凤养兔场提供，实验动物生产许可证：SCXK（浙）2020-0004，饲养于福建中医药大学实验动物中心，实验动物使用许可证号：SYXK（闽）2020-0003。实验室12 h昼暗交替，维持温度、湿度适宜恒定。单笼喂养、自由进水、摄食。实验全程均遵照相关动物保护的规定实施并已通过福建中医药大学动物实验伦理委员会批准（审批号：FJTCMIACUC2022202）。

1.2 主要实验试剂

戊巴比妥钠（美国Sigma-Aldrich公司，货号：P3761）；甲苯胺蓝染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号：G2543）；P53（货号：60283-2-Ig）、Caspase-3（货号：19677-1-AP）、β-肌动蛋白（β-actin，货号：66009-1-Ig）抗体均购自武汉三鹰生物技术有限公司；Bax（货号：bs-0127R）、Cyt C（货号：bs-0013R）、Caspase-9（货号：bs-20773R）、Bcl-2（货号：bsm-33411M）抗体均购自北京博奥森生物技术有限公司；山羊抗鼠（货号：AWS0001）及山羊抗兔（货号：AWS0002）二抗均购自长沙艾碧维生物科技有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，货号：AR0146）；ECL化学发光试剂盒（大连美仑生物技术有限公司，货号：MA0186）；骨组织RNA快速提取试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司，货号：RN5401）；MonScript™ RTIII All-in-One Mix with dsDNase试剂盒（货号：MR05101M）及MonAmp™ SYBR^® Green qPCR Mix试剂盒（货号：MQ10701S）均购自莫纳（苏州）生物科技有限公司。

1.3 主要实验仪器

一次性无菌小针刀（江西老宗医医疗器械有限公司，型号：0.40 mm×40 mm，货号：202405005）；高分子石膏（河北邦恩斯医疗器械有限公司，型号：335）；自动组织脱水机（型号：ZT-12P3）和组织包埋机（型号：YB-6LF）均购自孝感市亚光医用电子技术有限公司；切片机（德国Leica公司，型号：HistoCore）；台式高速低温离心机（德国Eppendorf公司，型号：Centrifuge 5420）；酶标仪［帝肯（上海）贸易有限公司，型号：Tecan Spark］；超微量分光光度计（型号：NanoDrop One）和梯度PCR仪（型号：Veriti 96）均购自美国Thermo Fisher公司；多功能化学发光成像仪（型号：ChemiDoc XRS+ System）和实时荧光定量PCR仪（型号：CFX Opus 96）均购自美国Bio-Rad公司。

2 实验方法

2.1 动物分组与造模

将兔适应性喂养1周后，根据体质量从轻到重进行编号，采用随机数字表法将兔分为空白组、模型组和针刀组，每组6只。模型组和针刀组参考改良的Videman法建立兔KOA模型^［11］，即保持兔左后肢膝关节处于伸直0°位，放置一石膏托于髌骨前方，使用高分子石膏自大腿根部向下均匀缠绕并将踝关节固定至背屈60°，最后在石膏表面覆盖一层防咬绷带，连续固定6周。空白组正常喂养，允许兔于笼内自由活动。造模期间3组兔精神良好，无死亡。6周后拆除石膏，参考Lequesne MG行为学评分对造模情况进行评价，以总分≥4分认为造模成功^［12］。

6周造模结束后，Lequesne MG行为学评分结果表示，与空白组相比，模型组和针刀组左膝关节Lequesne MG评分显著升高（P＜0.05），总分均≥4分，表明造模成功。见表1。

2.2 干预方法

干预过程中由一名助手将兔以仰卧位稳妥放置于专用固定架内。助手左手轻柔捂住兔眼以减少其视觉应激，右手牢固固定非干预侧的后肢，以防止其乱动。干预者则用左手稳定住待干预侧的后肢膝关节，使术区充分暴露并保持稳定，右手执一次性无菌小针刀进行规范操作。 参考《中国经筋学》^［13］选取针刀组的干预位点，对针刀组兔膝周进行常规消毒后，使用一次性无菌小针刀对股内侧肌、股外侧肌、髌内侧支持带、髌外侧支持带、髌韧带在髌骨上的附着点以及鹅足腱胫骨内髁附着点进行提插松解治疗。针刀刀体垂直皮肤刺入，针刀抵达病变部位后提插松解2～3刀，出刀后使用一次性无菌棉签按压1 min。每周干预1次，连续干预4周。其余2组正常饲养，只进行同样抓取及固定，不予治疗。

2.3 取 材

干预结束后1 d，按体质量10 mg/kg腹腔注射1%戊巴比妥钠对3组兔进行麻醉，采用耳缘静脉空气栓塞处死。将兔放置于冰面上，迅速解剖左膝关节。每组随机取3只兔，使用手术刀片小心完整地刮取其股骨髁软骨组织，装入预冷且已标记的EP管中，于干冰上速冻，随后转移至-80 ℃冰箱保存，以备后续分子生物学检测；同组的另3只兔，则用咬骨钳截取股骨髁组织块，立即置于4%多聚甲醛溶液中固定，用于后续形态学观察。

2.4 观察指标

2.4.1 甲苯胺蓝染色观察软骨组织形态学变化

股骨髁软骨组织经4％多聚甲醛固定48 h后行脱钙处理。每2～3 d更换1次脱钙液，当用针顺利刺透股骨髁软骨组织且无阻力感时，则证明组织脱钙完成。脱钙后的股骨髁经缓慢流水冲洗1 h，去除组织中多余的酸，之后行常规脱水、石蜡包埋并制备切片。切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水。滴加甲苯胺蓝染色液染色30 min，随后采用蒸馏水洗2 min，95%乙醇分化，无水乙醇脱水2 min，二甲苯透明处理，中性树胶封片，于显微镜下观察。

2.4.2 Western blot检测P53、Bax、Cyt C、Caspase-3、Caspase-9及Bcl-2蛋白相对表达量

取适量软骨组织放入提前预冷的研钵中，其间不断加入液氮将组织反复研磨成细粉。收集细粉，按照每10 mg软骨组织加入100 µL RIPA裂解液的比例加入裂解液，冰上静置10 min，使得组织充分裂解。在4 ℃条件下，按照12 000 r/min离心 15 min，将离心后的上清转移至新的离心管中。采用BCA法进行蛋白浓度测定。加入5×Loading Buffer于100 ℃条件下煮沸10 min。SDS-PAGE凝胶电泳，冰浴转膜，将蛋白从凝胶转移至PVDF膜上。使用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，TBST溶液清洗3次后加入一抗，于4 ℃条件下孵育过夜。次日使用TBST溶液对条带清洗后，在室温条件下进行二抗孵育1 h，结束后TBST溶液清洗3次。避光条件下在条带上均匀覆盖ECL发光液，运用多功能成像系统拍照。使用Image Lab软件分析蛋白条带灰度值，以β-actin作为内参蛋白进行校准，采用目标蛋白条带灰度值/β-actin条带灰度值来表示目的蛋白相对表达水平。

2.4.3 RT-qPCR检测P53、Bax、Cyt C、Caspase-3、Caspase-9及Bcl-2 mRNA转录水平

取适量软骨组织放入提前预冷的研钵中，期间不断加入液氮将组织反复研磨成细粉，而后根据RNA快速提取试剂盒的说明提取软骨组织中的总RNA。使用分光光度计进行总RNA浓度检测，记录OD260/OD280值和RNA浓度。根据逆转录试剂盒的说明配制反应液，逆转录合成cDNA。使用MonAmp™ SYBR^® Green qPCR Mix预混液试剂盒进行扩增。反应结束后获得每个样品的Ct值，计算目的基因mRNA转录水平。目的基因及内参的引物序列见表2。

2.5 统计学方法

采用SPSS 27.0统计学软件进行统计分析。计量资料服从正态分布时使用（\overline{x}±s）表示，方差齐时选择LSD-t检验，方差不齐时选择Dunnett T3检验，组间比较采用One-Way ANOVA；计量资料不服从正态分布时使用M（IQR）表示，采用Kruskal-Wallis秩和检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结　果

3.1 3组软骨组织形态比较

甲苯胺蓝染色结果显示，空白组软骨面平滑，软骨细胞排列均匀整齐、结构正常，潮线清晰；与空白组比较，模型组软骨面粗糙，软骨细胞排列疏松紊乱，数量减少，存在明显空泡细胞，蓝染明显减少，潮线模糊；与模型组比较，针刀组软骨面平滑程度有所改善，软骨细胞排列较为均匀，数量有所增加，蓝染稍减少，潮线模糊程度有所改善。见图1。

3.2 3组P53、Bax、Cyt C、Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2蛋白相对表达量比较

见图2。

3.3 3组P53、Bax、Cyt C、Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2 mRNA转录水平比较

见图3。

4 讨　论

在KOA的病理进程中，软骨细胞凋亡是导致软骨退行性变的核心环节之一。近年来，基于经筋理论的针刀疗法，通过“循经针刺”和“松解筋结”恢复力学平衡，从而在KOA治疗中展现出良好的临床前景^［14-15］。本课题组前期的形态学研究已证实，针刀髌周松解能有效降低兔KOA模型中的软骨细胞凋亡率^［7］。本研究在此基础上，进一步从分子层面探讨了针刀干预是否通过调控线粒体凋亡通路来发挥其软骨保护作用。

本研究结果表明，成功构建的KOA兔模型软骨组织中线粒体相关的软骨细胞凋亡通路被激活，具体表现为凋亡关键指标P53、Bax、Cyt C、Caspase-9及Caspase-3的蛋白相对表达量和mRNA转录水平显著升高，而抗凋亡关键指标Bcl-2的蛋白相对表达量和mRNA转录水平则受到抑制。这一系列分子变化与软骨组织病理损伤表现出的软骨面粗糙、细胞排列紊乱等结果相互印证，证实了线粒体凋亡通路在KOA软骨退变中的重要作用，这与其他学者的研究结论一致^［16］。尤为重要的是，经过4周的针刀髌周松解干预后，上述促凋亡指标的表达水平均出现显著回升，同时Bcl-2的表达得以恢复，由此可知，抑制线粒体凋亡通路很可能是针刀疗法延缓软骨细胞凋亡、治疗KOA的关键分子机制之一。

针刀作为一种局部机械松解手段，其作用的核心可能在于对异常机械应力的调节。软骨细胞是机械敏感细胞，其存活与凋亡高度依赖于周围力学微环境的稳定^［17］。KOA状态下，膝关节周围的“筋结”破坏了正常的力学分布，导致关节内应力集中，从而对软骨细胞产生异常的机械刺激。这种异常应力可能通过上调P53蛋白，进而启动线粒体凋亡级联反应^［18］。而本研究中针刀髌周松解通过切割、松解病变“筋结”，从根本上改善膝关节周围的力学环境。使得力学负荷的减轻降低了对p53的激活，从而通过下调Bax/Bcl-2比值，稳定了线粒体膜电位，减少了Cyt C的释放，最终抑制了下游Caspase-9和Caspase-3的活化，将软骨细胞在凋亡的不可逆阶段前挽回^［19］。

综上所述，本研究不仅再次验证了线粒体凋亡通路在KOA发病中的重要性，更是从该通路的角度揭示了针刀髌周松解疗法的潜在作用靶点。本研究说明针刀并非直接作用于软骨，而是通过“松解筋结-纠正力学-影响细胞信号通路”这一“由外及内”的整体调节方式，间接调控软骨细胞的状态。这为“经筋理论”和针刀疗法的科学性提供了现代分子生物学依据，也为后续深入研究其他信号通路奠定了基础。然而，针刀所产生的力学信号在体内如何被精确感知和传导，其具体细节仍有待进一步探索。

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基金资助

国家自然科学基金项目(82104969)

福建省自然科学基金项目(2024J01140)

宁德市自然科学基金联合项目(2022J68)