有氧跑台运动对自然衰老模型小鼠血液单细胞类型与差异基因表达的影响

摘要

目的 探讨有氧跑台运动对自然衰老模型小鼠血液单细胞类型与差异基因表达的影响。 方法 将12只16月龄C57BL/6J雄性小鼠按照随机数字表法分为老年组和运动组各6只，取6只6月龄同品系小鼠作为成年组。运动组进行为期7周的有氢跑台运动：第1周进行适应性训练，初始运动速度为4 m/min，按每天2 m/min逐步递增至12 m/min，30 min/d，共5 d；第2周开始系统性训练，以5 m/min低强度进行热身5 min，随后以12 m/min速度完成50 min主训练，再以5 m/min低速运动5 min进行放松，每周7 d，持续6周。成年组、老年组放置于同规格静止水平跑台30 min/d，每周5 d，持续1周，第2周更改为1 h/d，每周7 d，持续6周。干预后采用巴恩斯迷宫系统定量评估3组小鼠运动功能（平均速度、运动距离）；利用血液单细胞RNA测序分别检测3组血液单细胞类型和基因表达情况，比较老年组和成年组（2组合记为A组）与运动组和老年组（2组合记为B组）不同细胞类型的表达情况以及差异基因筛选情况，再分别从A组和B组的差异基因中筛选出组间差异倍数排名前5的标记（Marker）基因，分析其在不同细胞中的表达水平，最后将A组和B组的Marker基因取并集并进行KEGG通路富集分析。 结果 与成年组比较，老年组平均速度、运动距离均下降（P＜0.05）。与老年组比较，运动组平均速度、运动距离均升高（P＜0.05）。血液单细胞测序结果显示：在A组的血液中检测到45 779个细胞，共9种细胞类型，分为24个细胞簇；在B组的血液中检测到45 353个细胞，共7种细胞类型，分为21个细胞簇；与A组比较，B组中B细胞、造血干细胞增加，而自然杀伤细胞、刷细胞、T细胞、中性粒细胞减少；筛选出A组差异基因共49个，其中老年组较成年组表达上升的基因4个，表达下降的基因45个；筛选出B组表达差异基因共11个，其中运动组较老年组表达上升的基因7个，表达下降的基因4个；将A组表达差异基因和B组表达差异基因取交集，得到2个交集基因，分别是颗粒酶A基因（Gzma）和酪氨酸激酶结合蛋白基因（Tyrobp）；将老年组较成年组表达下降的差异基因和运动组较老年组表达上升的差异基因取交集，得到Tyrobp基因；A组中排名前5的Marker基因分别是：S100钙结合蛋白A9（S100a9）、S100钙结合蛋白A8（S100a8）、趋化因子配体3（Ccl3）、趋化因子配体4（Ccl4）及Gzma。其中S100a9、S100a8基因在中性粒细胞、B细胞、自然杀伤细胞、造血干细胞、粒细胞、T细胞、巨噬细胞、刷细胞、间充质干细胞中表达；Ccl3、Ccl4基因在自然杀伤细胞和刷细胞中表达；Gzma基因在自然杀伤细胞中表达。B组中排名前5的Marker基因分别是：溶菌酶2（Lyz2）、干扰素诱导跨膜蛋白1（Ifitm1）、Ccl3、Ccl4、Gzma，其中Lyz2基因在中性粒细胞、B细胞、造血干细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、T细胞、刷细胞中表达；Ifitm1基因在B细胞和刷细胞中表达；Ccl3、Ccl4基因在自然杀伤细胞和刷细胞中表达；Gzma基因在自然杀伤细胞中表达；KEGG通路富集分析共获得到13条信号通路，包括沙门氏菌感染通路、趋化因子信号通路、NF-κB信号通路、B细胞受体信号通路、Toll样受体信号通路、神经活性配体-受体相互作用通路等。 结论 有氧跑台训练可能通过调控血液中Tyrobp、Gzma表达，并调节B细胞、造血干细胞、自然杀伤细胞、T细胞、中性粒细胞的增殖分化，改善衰老导致的运动功能减退。

Graphical abstract

关键词

衰老 / 运动功能衰退 / 有氧运动 / 血液单细胞RNA测序 / Tyrobp / Gzma

±

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随着机体的自然衰老，运动系统出现生理性功能衰退，表现为骨骼肌退化、机体关节灵活性下降、神经肌肉协调性减弱及中枢运动控制功能退化^［1-2］。其中，骨骼肌的退化尤为明显，表现为骨骼肌纤维数量减少、脂肪浸润以及线粒体功能下降^［3］。这些变化导致机体运动功能受限，使日常活动受限、步态稳定性降低、运动速度减缓以及姿势调整能力受损，显著降低了生活质量^［4］。

有氧运动对老年人运动功能的改善作用已得到广泛验证。有研究证实，有氧运动可改善老年人群的运动执行功能与步态稳定性，提高运动敏捷性^［5］。长期规律的有氧运动可显著提升骨骼肌再生能力，缩短恢复周期，同时通过增加毛细血管密度改善氧气和营养物质的输送效率，为受损肌肉提供修复支持^［6］。虽然有氧运动在促进骨骼肌修复和改善物质输送效率上展现出显著优势，但血液中哪些关键细胞及分子可改善衰老引起的运动功能减退，目前尚未形成清晰的理论框架。本研究旨在探讨有氧跑台运动对自然衰老小鼠运动功能的改善作用，并利用血液单细胞RNA测序技术分析自然衰老小鼠血液单细胞类型与差异基因的变化，探索潜在的标志物及可能的机制途径，旨在为有氧运动改善老年运动功能的临床转化应用提供实验参考和依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

本研究选用18只SPF级C57BL/6J雄性小鼠，6月龄成年组小鼠6只和16月龄老年组小鼠12只，初始体质量28～32 g。实验动物由杭州子源实验动物科技有限公司提供，实验动物生产许可号：SCXK（浙）2019-0004；于福建中医药大学SPF级实验动物屏障系统内完成饲养管理，实验动物使用许可号：SYXK（闽）2020-0002。动物采用独立通风笼具饲养，每笼6只，经1周环境适应后开展实验。饲养环境维持温度为（22±1）℃，并通过灯光自动控制系统实现12 h昼夜节律循环，实验期间动物自由摄食灭菌饲料及饮用水。本研究严格遵循《实验动物福利伦理审查指南》要求，并获得福建中医药大学实验动物伦理委员会审批通过（审批号：FJTCMIACUC2023127）。

1.2 主要实验仪器和试剂

1.2.1 主要实验仪器

小动物跑台（型号：XR-PT-11A）和巴恩斯迷宫（型号：XR-XB108）均购自上海欣软信息科技有限公司；小动物呼吸麻醉机（型号：R500IE）和低温高速离心机（型号：M1324-M1324R）均购自深圳瑞沃德生命科技有限公司；液滴文库构建系统（美国10× Genomics公司，型号：120223）；倒置显微镜（日本Olympus公司，型号：IX73）。

1.2.2 主要实验试剂

BSA试剂盒（加拿大BBI生命科学有限公司，货号：A0332-5G）；台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，货号：C0011）；5M氯化钠（美国赛默飞世尔科技有限公司，货号：AM9760G）；Protease inhibitor cocktail tablets in easypacks（瑞士Roche公司，货号：4693116001）；MGISEQ-2000RS高通量测序试剂套装（深圳华大智造科技股份有限公司，货号：1000012554）。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组及干预方法

经1周环境适应后，将12只16月龄C57BL/6J雄性小鼠按照随机数字表法分为老年组和运动组各6只，取6只6月龄同品系小鼠作为成年组。运动组小鼠进行为期7周的有氧跑台训练，包括适应性训练与系统性训练2个阶段^［7］：第1周进行适应性训练，初始运动速度为4 m/min，按每天2 m/min逐步递增至12 m/min，30 min/d，共5 d；第2周开始系统性训练，以5 m/min低强度进行热身5 min，随后以12 m/min速度完成50 min主训练，再以5 m/min低速运动5 min进行放松，每周7 d，持续6周。成年组、老年组放置于同规格静止水平跑台30 min/d，每周5 d，持续1周，第2周更改为1 h/d，每周7 d，持续6周。所有实验操作均在标准化环境条件下完成，确保各组干预条件的一致性。

1.3.2 运动行为学

本研究采用改良巴恩斯迷宫系统定量评估小鼠运动能力^［8］，实验流程包括环境适应、行为学习与运动测试3个阶段。实验前24 h将小鼠从固定洞口引入迷宫平台进行4 min自由探索，避免环境陌生性对运动表现的干扰。正式实验周期（第1～4天）每日实施4次标准化测试：将小鼠置于中央圆形启动区（直径15 cm）静置20 s后释放，同步施加85 dB白噪声刺激，连续刺激180 s或当小鼠进入目标洞口时终止刺激。第5天撤除目标装置后执行90 s自由运动测试，采集运动距离、平均运动速度（总位移/有效运动时间）2项核心参数。测试间隔使用75%乙醇彻底消毒接触面以消除气味干扰。

1.3.3 血液单细胞RNA测序筛选差异细胞类型与基因

1.3.3.1 制备单细胞悬液

采用体积分数为3.0%的异氟烷与纯氧混合气体，对小鼠进行诱导麻醉。密切观察小鼠状态，待其进入角膜反射消失、肌肉完全松弛的深度麻醉状态后，迅速开展眼球取血操作。将采集的血液置于含有抗凝剂的采血管中，进行离心。离心结束后，小心吸取各分层中的单细胞层，分别转移至无菌管中，加入适量细胞培养液，轻柔吹打混匀，制备细胞悬液。

1.3.3.2 10× Genomics单细胞表达文库制备

将3组细胞悬液用0.4%台盼蓝染色，在显微镜下镜检并统计活率，活率＞80%即可进入建库环节。随后将准备好的单细胞悬液通过全自动仪器Chromium Controller快速进行单细胞GEMs的生成，并反转录生成cDNA。随后配制破乳反应体系，破坏其乳液结构，使不同相分离，在室温下反应一定时间后对产物进行多次纯化和扩增。扩增纯化后的产物需根据产品要求选择相应检测方法进行文库质检。质检合格后，将PCR产物变性为单链，配制环化反应体系并设置反应程序，得到单链环形产物，同时消化掉未被环化的线性DNA分子。最后，单链环状DNA分子通过滚环复制形成包含多个拷贝的DNA纳米球，将得到的DNA纳米球采用高密度DNA纳米芯片技术加到芯片上的网状小孔内，通过联合探针锚定聚合技术进行上机测序。

1.3.3.3 单细胞数据的质量控制

利用Cell Ranger（v5.0.1）对测序原始数据进行分析，生成标准化基因表达矩阵^［9］。采用R语言Seurat包（v3.2.0）开展单细胞转录组下游分析^［10］。在细胞质量控制环节，基于检测到的基因数量和线粒体基因表达比例，执行以下操作：过滤掉基因检测数量＜200个，或＞最大基因数90%的细胞；按照线粒体基因表达占比将细胞降序排列，移除前15%的异常细胞；通过Doublet Finder算法识别并剔除潜在的双细胞，利用Cell Cycle Scoring函数进行细胞周期分析，消除细胞周期异质性对聚类的影响。

1.3.3.4 主要细胞类型和差异基因的筛选及分析

完成质量控制后，对基因表达矩阵进行归一化处理，随后筛选2 000个高变基因进行主成分分析（PCA）降维。基于PCA结果，利用U-MAP算法进行非线性降维并聚类。针对每个细胞簇，通过SCSA（Single Cell Signature Analysis）算法进行细胞类型注释^［11］。同时，使用Find Markers函数（log₂FC＞0.25，minPct＞0.1，P≤0.05）鉴定3组组间表达差异基因，将老年组与成年组（2组合记为A组）和运动组与老年组（2组合记为B组）表达差异基因取交集，找出有氧运动改善衰老引起的运动功能减退的作用靶点，同时将A组中老年组较成年组表达下降差异的基因和B组中运动组较老年组表达上升的差异基因取交集，并绘制韦恩图；再分别从A组和B组的差异基因中筛选出组间差异倍数排名前5的标记（Marker）基因，分析其在不同细胞中的表达水平；最后将A组和B组排名前5的Marker基因取并集，利用R语言（R-3.1.1）中的Phyper函数对并集基因进行KEGG通路富集分析，其中FDR≤0.05的通路为显著富集，并进行可视化分析。

1.4 统计学方法

采用GraphPad Prism 9.0软件作图和SPSS 25.0进行数据统计分析。采用Shapiro-Wilk检验验证数据正态性；满足正态分布时，再用Levene's检验评估方差齐性。若数据同时满足正态分布和方差齐性条件，计量资料以（\overline{x}±s）表示，使用单因素方差分析进行组间差异比较，组间两两比较采用Bonferroni事后检验方法，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结　果

2.1 3组运动功能比较

老年组较成年组运动的平均速度和运动距离均显著降低（P＜0.05）；运动组较老年组运动的平均速度和运动距离均显著上升（P＜0.05），见图1。3组运动轨迹示意图，见图2。

2.2 3组血液单细胞RNA测序分析结果

在A组血液中检测到45 779个细胞，共9种细胞类型：间充质干细胞、自然杀伤细胞、B细胞、粒细胞、刷细胞、造血干细胞、T细胞、中性粒细胞及巨噬细胞，分为24个细胞簇，见图3和图4；在B组血液中检测到45 353个细胞，共7种细胞类型：自然杀伤细胞、B细胞、单核细胞、刷细胞、造血干细胞、T细胞、中性粒细胞，分为21个细胞簇，见图5和图6。与A组比较，B组中B细胞、造血干细胞数量增加，而自然杀伤细胞、刷细胞、T细胞、中性粒细胞数量减少，见表1。

A组中上述9种细胞类型中的表达差异基因共有49个，其中老年组较成年组表达上升的基因有4个，表达下降的基因有45个；B组中上述7种细胞类型中的表达差异基因共有11个，其中运动组较老年组表达上升的基因有7个，表达下降的基因有4个。将A组和B组表达差异基因取交集，得到2个交集基因，分别是颗粒酶A基因（Gzma）、酪氨酸激酶结合蛋白基因（Tyrobp），见图7。老年组较成年组表达下降差异的基因和运动组较老年组表达上升的差异基因取交集，得到Tyrobp基因，见图8。

A组中排名前5的Marker基因分别是：S100钙结合蛋白A9（S100a9）、S100钙结合蛋白A8（S100a8）、趋化因子配体3（Ccl3）、趋化因子配体4（Ccl4）及Gzma。其中S100a9、S100a8基因在中性粒细胞、B细胞、自然杀伤细胞、造血干细胞、粒细胞、T细胞、巨噬细胞、刷细胞、间充质干细胞中表达；Ccl3、Ccl4基因在自然杀伤细胞和刷细胞中表达；Gzma基因在自然杀伤细胞中表达；B组中排名前5的Marker基因分别是：溶菌酶2（Lyz2）、干扰素诱导跨膜蛋白1（Ifitm1）、Ccl3、Ccl4、Gzma，其中Lyz2基因在中性粒细胞、B细胞、造血干细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、T细胞、刷细胞中表达；Ifitm1基因在B细胞和刷细胞中表达；Ccl3、Ccl4基因在自然杀伤细胞和刷细胞中表达；Gzma基因在自然杀伤细胞中表达。见图10。

Marker基因KEGG通路富集结果显示：共富集到13条信号通路，包括沙门氏菌感染、Toll样受体信号通路、病毒蛋白与细胞因子相互作用、趋化因子信号通路、人类巨细胞病毒感染、细胞因子-受体相互作用、胞质DNA感应通路、B细胞受体信号通路等。见图11。

3 讨　论

本实验结果显示，经过7周系统性跑台训练干预后，运动组小鼠平均速度和运动距离较老年组小鼠显著上升，证明跑台运动可以改善自然衰老导致的机体运动功能衰退。SCHEFER和TALAN^［12］研究了C57BL6小鼠的跑台速度与最大摄氧量之间的线性相关性，并证明老年小鼠在20 m/min的速度下达到最大摄氧量。又有研究表明，在水平跑台干预中，老年C57BL6小鼠在9.2～18 m/min之间的速度为有氧运动的速度区间^［13］。本实验中，小鼠跑台最大速度为12 m/min，处在有氧运动的速度区间，同样证实有氧运动可以改善自然衰老导致的机体运动功能减退。这与HOU和SUN^［14］研究结论一致，进一步拓展了在基础层面上有氧运动改善老年运动功能的实验证据。

在衰老进程中，免疫系统的慢性激活是骨骼肌退化的主要因素之一^［15-16］。本研究结果显示：老年组较成年组小鼠Gzma表达上升、Tyrobp表达下降，A组较B组血液中自然杀伤细胞、T细胞及中性粒细胞数量增加。这一现象可能与以下机制有关：自然杀伤细胞、T细胞及中性粒细胞的异常活化会持续释放颗粒酶、穿孔素及促炎细胞因子，直接诱导肌细胞凋亡并加剧氧化应激损伤^［17-20］，慢性炎症状态可能导致免疫细胞的过度活化和Gzma表达的异常升高，从而加速肌肉组织损伤，Tyrobp的表达可能因慢性炎症或代谢紊乱而受到抑制^［21-22］。

本研究结果中运动组较老年组小鼠干预后血液中Gzma表达下降、Tyrobp表达上升，以及B组较A组血液中B细胞、造血干细胞增加，自然杀伤细胞、T细胞、中性粒细胞减少。这一现象可能与以下机制有关：Gzma是自然杀伤细胞和细胞毒性T细胞释放的关键效应分子，参与靶细胞的杀伤过程^［23-25］。有研究发现，长期有氧运动可以恢复机体免疫系统平衡，从而抑制自然杀伤细胞、T细胞和中性粒细胞的过度激活，致使Gzma表达下降^［26-27］。此外，有氧运动还可能通过外泌体在细胞间传递生物信号的方式调控免疫反应。有研究发现，运动个体来源的外泌体富含miRNA和功能性蛋白，可以抑制炎症反应并促进组织修复^［28-30］。炎症反应的消退使机体内免疫细胞由过度激活态变为正常态，从而降低Gzma的表达^［31-34］。Tyrobp作为免疫受体信号转导的关键适配分子，在调节免疫细胞的激活中起重要作用。Tyrobp表达上升可恢复免疫受体信号转导通路的正常调控，从而减轻肌细胞凋亡与氧化应激损伤^［35］。B细胞不仅是体液免疫的核心效应细胞，近年研究还发现其可通过分泌细胞因子或直接与肌细胞相互作用参与组织修复^［36-37］。同时，有氧运动可通过机械刺激和代谢调节促进造血干细胞的自我更新^［34］。这些因素协同作用，促使有氧运动后机体免疫系统与相关分子表达层面产生适应性改变，进而改善衰老引起的相关运动功能。

4 结　论

本研究利用行为学和血液单细胞RNA测序证实，有氧跑台训练可以改善自然衰老小鼠的运动功能，其作用机制可能是通过调控血液中Tyrobp、Gzma表达，并调节B细胞、造血干细胞、自然杀伤细胞、T细胞、中性粒细胞的增殖分化，改善衰老导致的运动功能减退。该发现为阐释有氧运动干预改善衰老相关运动功能的分子机制提供了新的依据。然而，本研究仍存在一定局限性：本研究虽揭示了有氧跑台运动通过调控血液Tyrobp和Gzma表达改善衰老小鼠运动功能的机制，但仍存在机制解析深度不足的问题，仅从血液单细胞层面验证了Tyrobp和Gzma的表达变化，有氧跑台训练影响机体运动功能的具体分子通路尚未明确。因此，后续研究将采用组织特异性条件Tyrobp基因敲除和Gzma基因过表达小鼠模型，利用免疫共沉淀、Western blot等技术明确Tyrobp和Gzma的下游调控网络，系统验证二者在运动干预中的细胞生物学功能与信号调控机制。

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基金资助

福建中医药大学校青年科研拔尖人才项目(XQB202203)