牡丹皮改善脂多糖诱导的血管内皮通透性的作用及机制研究

摘要

目的 采用网络药理学探讨牡丹皮改善脓毒症血管通透性的作用和机制研究，并进行实验验证。 方法 利用TCMSP数据库和文献检索筛选牡丹皮活性成分；使用PharmMapper、SwissTargetPrediction数据库对牡丹皮的活性成分作用靶点进行预测，利用GeneCards和OMIM数据库分别筛选脓毒症与血管通透性的疾病靶点，通过Venny分析筛选出脓毒症与血管通透性可能有交互作用的疾病靶点，再将活性成分作用靶点与疾病靶点取交集，得到活性成分与疾病的交集靶点；运用Cytoscape 3.7.1软件绘制活性成分-交集靶点-疾病网络图；利用STRING数据库构建交集靶点的蛋白质与蛋白质相互作用（PPI）网络并筛选核心靶点；采用DAVID数据库对交集靶点进行基因本体（GO）功能和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路的富集分析以及可视化分析。实验验证牡丹皮对LPS诱导的血管内皮细胞通透性的改善作用及其机制：利用LPS刺激HUVECs细胞建立血管通透性模型；同时将牡丹皮制备成牡丹皮乙醇提取物冻干粉，使用DMSO配制成128 mg/mL的药物溶液。将模型细胞分为对照组、12.5 μg/mL牡丹皮醇提物组（A组）、25 μg/mL牡丹皮醇提物组（B组）、50 μg/mL牡丹皮醇提物组（C组）、100 μg/mL牡丹皮醇提物组（D组）、200 μg/mL牡丹皮醇提物组（E组）共6组，采用CCK-8法测定6组细胞活力。再将细胞分为空白组、模型组（1 μg/mL LPS）、地塞米松组（0.5 mmol/L地塞米松）及牡丹皮醇提物低、中、高剂量组（12.5、25、50 μg/mL），采用Transwell实验考察不同浓度的牡丹皮醇提物对单层HUVECs细胞通透性的影响，并通过Western blot检测细胞间紧密连接蛋白Claudin-5（密蛋白5）、Occludin（闭合蛋白）、ZO-1（紧密黏连蛋白1）及ERK1/2和mTOR/HIF-1α/VEGF信号通路相关蛋白表达量的表达情况。 结果 网络药理学筛选得到牡丹皮活性成分共11个，活性成分靶点共636个，疾病靶点共815个，交集靶点90个。GO功能富集分析结果显示：交集靶点共涉及565个生物过程（BP），62个细胞成分（CC），90个分子功能（MF），其中BP主要包括凋亡过程负向调控、对脂多糖的反应、对缺氧的反应等；CC主要涉及细胞表面、细胞外空间、细胞外区域等；MF主要涉及相同的蛋白质结合、酶结合位点、内肽酶活力等。KEGG通路富集分析结果共富集到90条信号通路，包括癌症通路、代谢通路、c型凝集素受体信号通路等。与对照组比较，A、B、C、D组细胞活力差异均无统计学意义（P＞0.05），E组细胞活力明显降低（P＜0.05），说明牡丹皮醇提物在100 μg/mL以下对细胞活力无显著影响，提示在该浓度范围内无细胞毒性；与空白组比较，模型组通透性升高，Claudin-5、Occludin、ZO-1蛋白相对表达量均降低（P＜0.05），p-ERK1/2、p-mTOR、HIF-1α、VEGF的蛋白相对表达量则升高（P＜0.05）；而与模型组比较，牡丹皮醇提物低、中、高剂量组及地塞米松组通透性均降低（P＜0.05），Claudin-5、Occludin、ZO-1蛋白相对表达量均升高（P＜0.05），p-ERK1/2、p-mTOR、HIF-1α、VEGF的蛋白相对表达量均降低（P＜0.05）。 结论 牡丹皮中的活性成分增强紧密连接蛋白的表达从而发挥改善血管通透性，机制可能与ERK1/2/mTOR/HIF-1α/VEGF信号通路有关。

Graphical abstract

关键词

牡丹皮 / 脓毒症 / 血管内皮通透性 / 网络药理学 / ERK1/2 / mTOR/HIF-1α/VEGF信号通路

脓毒症（sepsis）是指感染导致的失控的全身性炎症反应，通常会导致多器官衰竭和休克，是威胁人类生命和经济发展的重大卫生问题^［1］。研究表明，在脓毒症早期阶段就会出现微血管损伤，并可能导致多器官功能障碍甚至死亡^［2］。在脓毒症中，血管内皮细胞激活及受损所致微循环功能障碍是其重要病理机制。血管通透性增高使患者出现组织水肿、引起毛细血管渗漏综合征、进而加重组织细胞缺氧和微循环障碍，直至终末端器官衰竭^［3］。临床上应用的糖皮质激素对炎症因子诱导的内皮损伤具有负性调控作用，同时使用血浆白蛋白、羟淀粉和甘露醇来增加血管内晶体的渗透压。然而临床研究表明，上述治疗方式对降低微血管渗漏引起的死亡率没有明显影响^［4］。因此，寻找能够稳定脓毒症期间血管通透性的药物至关重要。

牡丹皮为毛茛科芍药属植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.的干燥根皮，性微寒，味辛、苦，归心、肝、肾经，具有清热凉血、活血化瘀的功效，是中医临床治疗血热出血证的重要药物，具有降低多种病理因素引起的血管通透性增高的药理作用。研究表明，牡丹皮可以抑制速发型过敏反应及动脉粥样硬化引起的血管通透性增加^［5-6］，牡丹皮中丹皮酚对脂多糖（LPS）致大鼠肠系膜细静脉内血浆蛋白渗漏有抑制作用^［7］。然而，牡丹皮改善血管通透性的作用及其机制尚不清楚。因此，本研究利用网络药理学结合实验验证牡丹皮对脓毒症血管内皮通透性的保护作用及其机制。

1 实验材料

1.1 细胞

人脐静脉内皮细胞（HUVECs，上海中乔新舟生物科技有限公司，货号：ZQ1099）。

1.2 药品与试剂

牡丹皮（厦门燕来福制药有限公司，批号：230510）；LPS（美国SIGMA-ALDRICH公司，货号：L2630-25MG）；胎牛血清（上海逍鹏生物科技有限公司，批号：2418299）；PBS（武汉赛维尔生物科技有限公司，货号：G4202-500ML）；RPMI 1640培养基（赛默飞世尔仪器有限公司，批号：6124164）；地塞米松（上海源叶生物科技有限公司，货号：S17003-1g）；Transwell小室（货号：14341）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体（货号：G0100）和CCK-8检测试剂（货号：CK001）均购自北京兰博利德科技有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术有限公司，批号：P0012）；无蛋白快速封闭液（上海雅酶生物医药科技有限公司，批号：PS108P）；飞克特超敏ECL发光液（美仑生物技术有限公司，货号：MA0186-2）。密蛋白5（Claudin-5）抗体（美国英杰生命技术有限公司，批号：35-2500）；闭合蛋白（Occludin）抗体（批号：91131）、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（phospho-mTOR）抗体（批号：5536s）、mTOR抗体（批号：2983s）、缺氧诱导因子-1亚基α（HIF-1α）抗体（货号：14179s）均购自美国Cell Signaling Technology公司；紧密黏连蛋白1（ZO-1）抗体［圣克鲁斯生物技术（上海）有限公司，批号：sc-33725］；磷酸化细胞外调节蛋白激酶（P-ERK1/2）抗体（成都正能生物技术有限责任公司，批号：301245）；ERK1/2抗体（批号：11257-1-AP）、血管内皮生长因子（VEGF）抗体（批号：19003-1-AP）均购自武汉三鹰生物技术有限公司。

1.3 仪器

CO₂培养箱（美国Thermo Fisher Scientific公司，型号：HERAcell vios 160i）、低温高速离心机（德国Eppendorf公司，型号：Centrifuge 5430 R）；酶标仪（瑞士Tecan公司，型号：InfiniteM200Pro）；凝胶成像分析仪（美国Bio-Rad公司，型号：Chemi Doc XRS+）。

2 方　法

2.1 运用网络药理学构建分子网络

2.1.1 牡丹皮活性成分及作用靶点的筛选

将“牡丹皮”输入TCMSP数据库（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）检索化学成分信息，以口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18为条件，初步获取具备成药潜力的活性成分及其作用靶点。同时通过查阅相关文献^［8］，补充牡丹皮活性物质4-O-甲基芍药苷，建立牡丹皮活性成分数据库。利用PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库下载活性成分SDF文件，并上传到PharmMapper、Swiss-TargetPrediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）以及PharmMapper（https：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）数据库，设置属性为“Homo sapiens”，对活性成分的作用靶点进行预测，剔除可能性为零的活性成分靶点，最后进行数据合并去重。

2.1.2 脓毒症血管通透性疾病靶点数据库的构建

使用关键词“vascular permeability（血管通透性）”和“sepsis（脓毒症）”分别在GeneCards（https：//www.genecards.org/）和OMIM（https：//www.omim.org/）数据库中依次对相关疾病靶点进行检索，将检索结果合并后剔除重复项，构建脓毒症血管通透性靶点数据库。

2.1.3 活性成分和疾病交集靶点的筛选

借助通用蛋白质资源数据库Uniprot（https：//www.uniprot.org/）对活性成分靶点及疾病靶点的基因名称进行精确检索，并采用生物信息学分析工具Venny 2.1确定牡丹皮中活性成分靶点与疾病靶点之间的交集靶点，并绘制韦恩图。

2.1.4 构建蛋白质-蛋白质相互作用网络

将活性成分与疾病交集靶点（Geme Symbol）上传STRING（https：//string-db.org/） 数据库，在物种参数栏选定为“Homo spaiens”，并设定相互作用置信度阈值为“最高置信度”（highest confidence，0.9），构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络，并将其导入Cytoscape 3.7.1软件进行可视化分析。

2.1.5 牡丹皮活性成分-交集靶点-疾病网络图的构建

使用Cytoscape 3.7.1软件绘制活性成分-交集靶点-疾病的网络图。

2.1.6 GO功能及KEGG通路富集分析

将交集靶点输入DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）数据库进行分析，物种设置“Homo sapiens”，通过GO功能和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，将基因本体（GO）功能结果中生物过程（biological process，BP）、细胞组分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）中P值从小到大的进行排序，选择排名前10位的条目以及KEGG富集分析结果中P值排名前20位的条目进行可视化处理。

2.2 制备牡丹皮乙醇提取物冻干粉

用粉碎机将牡丹皮粉碎后，经过150目的筛分后称量出牡丹皮粉末，在95%乙醇（料液比为1∶10）中浸泡30 min后，回流提取2次，每次1 h，合并滤液。60 ℃减压回收溶剂，冷冻干燥，得到牡丹皮提取物冻干粉，临用时采用DMSO溶解，配制成128 mg/mL样品溶液^［9］。

2.3 细胞实验

2.3.1 HUVECs细胞培养

在37 ℃，5% CO₂的恒温培养箱中，用含10%胎牛血清和1%的青霉素-链霉素1640培养基对HUVECs细胞进行培养。每隔2 d更换1次培养液，当细胞融合度为80%时用胰蛋白酶消化传代。

2.3.2 CCK-8法测定细胞活力

HUVECs细胞以5×10³个/孔接种于96孔板中，培养24 h，共分为6组：对照组、12.5 μg/mL牡丹皮醇提物组（A组）、25 μg/mL牡丹皮醇提物组（B组）、50 μg/mL牡丹皮醇提物组（C组）、100 μg/mL牡丹皮醇提物组（D组）、200 μg/mL牡丹皮醇提物组（E组），在每个孔中添加CCK-8试剂10 µL并孵育2 h，在450 nm波长下用酶标仪测定吸光度，计算细胞存活率，筛选出适宜的药物干预浓度。

2.3.3 Transwell实验检测内皮细胞通透性

将HUVECs细胞制备成1×10⁶/mL的悬浮液，向Transwell培养室中加入200 µL的细胞，直到细胞达到90%的融合，分为空白组、模型组（1 μg/mL LPS）、地塞米松组（0.5 mmol/L地塞米松）及牡丹皮醇提物低、中、高剂量组（12.5、25、50 μg/mL），孵育24 h。将FITC-Dextran与1%血清1640按0.1 mg/mL的比例稀释，室温下避光保存。在进行通透性检测前，用200 µL的FITC-Dextran溶液替换上室的液体，用600 µL的1%血清1640溶液替换下室的液体，在室温避光孵育40 min（即检测时间，t值）。从上室和下室分别取100 µL液体，转移到96孔板上，在激发波长485 nm和发射波长538 nm下进行荧光检测，同时测定下室液体积。通透性大小用系数Pa表示，按以下公式^［10］计算：

Pa＝［A］/t×1/A×V/［L］

其中［A］表示下室的吸光值；t表示时间，单位为s；V表示下室体积，单位为mL；A表示Transwell滤膜面积，单位为cm²；［L］表示上室的吸光值。

2.3.4 Western blot检测紧密连接蛋白Claudin-5、Occludin、ZO-1以及ERK1/2和mTOR/HIF-1α/VEGF信号通路相关蛋白表达量

将HUVECs按照5×10⁶个/孔接种于6孔培养板，置于37 ℃、5% CO₂恒温培养箱中培养24 h，待细胞完全贴壁后进行实验分组：对照组（以含1%胎牛血清的培养基培养）、模型组（以含1 μg/mL LPS的1%胎牛血清培养基培养）、牡丹皮醇提物低、中、高剂量组（分别以含12.5、25、50 μg/mL牡丹皮醇提物的1%胎牛血清培养基培养）和地塞米松组（以含0.5 mmol/L地塞米松的1%胎牛血清培养基培养），各组细胞经药物持续干预24 h后，用RIPA裂解液快速裂解目的细胞，获得总蛋白提取物，通过BCA对样品定量分析。样品进行电泳、转膜、封闭后分别加入一抗Claudin-5（1∶1 000）、Occludin（1∶1 000）、ZO-1（1∶1 000）、P-ERK1/2（1∶1 000）、ERK1/2（1∶1 000）、P-mTOR（1∶1 000）、mTOR（1∶1 000）、VEGF（1∶1 000）、HIF-1α（1∶1 000）和GAPDH（1∶1 000），转移至4 ℃冷藏环境进行过夜孵育。TBST洗后加入对应二抗，室温孵育后用ECL化学发光检测试剂盒进行显影反应，采用ImageJ 6.0软件对条带进行灰度值定量分析。

2.3.5 统计学方法

使用SPSS 27.0统计软件分析实验数据，计量资料符合正态分布以（\overline{x}±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，若方差齐时采用LSD法进行组间两两比较，若方差不齐则选用Games-Howell进行分析比较。P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结　果

3.1 牡丹皮活性成分的筛选

基于TCMSP中药数据库的检索分析并结合相关文献，最终锁定11个潜在的牡丹皮活性成分。见表1。

3.2 活性成分和疾病的交集靶点筛选结果

通过PharmMapper和SwissTargetPrediction数据库筛选得到牡丹皮活性成分对应的636个靶点；通过GeneCards和OMIM数据库筛选得到脓毒症和血管通透性共有靶点815个，采用Venny 2.1对3组靶点数据进行取交集，见图1，识别出90个重叠靶点作为潜在的药物干预靶点。

3.3 交集靶点的PPI网络构建结果

将得到的PPI网络文件导入到Cytoscape 3.7.1软件中进行进一步处理和分析，结果见图2。图中共有节点90个，节点尺寸与其Degree值呈显著正相关，共包含1 391条蛋白互作连接。大于平均Degree值并且排名靠前的蛋白分别是TNF、ALB、AKT1等，这些蛋白可能在牡丹皮治疗脓毒症血管通透性过程中起到重要作用。

3.4 药物-活性成分-交集靶点-疾病网络构建

通过Cytoscape 3.7.1软件构建药物-活性成分-交集靶点-疾病网络，见图3，图中共103个节点，191条边。表明了牡丹皮改善脓毒症血管通透性是在多靶点、多成分共同作用的结果，Degree值排名前3的化合物分别为芍药花苷、白桦脂酸、（+）-儿茶素，将这3种活性成分作为牡丹皮治疗脓毒症血管通透性的潜在活性成分。

3.5 GO功能和KEGG通路富集分析结果

GO功能富集分析结果见图4。从生物学过程层面来看，与牡丹皮-脓毒症血管通透性交集靶点密切相关的关键生物学过程包括凋亡过程负向调控、对脂多糖的反应、对缺氧的反应、正向调控ERK1和ERK2级联、平滑肌细胞增殖的正向调节、积极调节细胞迁移，以及炎症反应等；从细胞组分角度分析，牡丹皮-脓毒症血管通透性交集靶点主要富集于细胞表面、细胞外空间、细胞外区域和质膜等；在分子功能维度上，相关靶点所涉及的分子功能主要包括相同的蛋白质结合、酶结合位点、内肽酶活性、蛋白质结合、蛋白激酶活性等。KEGG通路富集分析显示，交集靶点富集的通路主要涉及癌症通路、代谢通路、c型凝集素受体信号通路等。见图5。其中，HIF-1信号通路已被证实参与脓毒症血管通透性的病理和生理过程^［11］，由此可推测牡丹皮可能通过调控HIF-1信号通路进而改善脓毒症血管内皮的通透性。

3.6 6组细胞活力比较

与对照组比较，A、B、C、D组细胞活力差异均无统计学意义（P＞0.05），E组细胞活力明显降低（P＜0.05），说明牡丹皮醇提物在100 μg/mL以下对细胞活力无显著影响，提示在该浓度范围内无细胞毒性；故本研究后续实验中选择12.5、25、50 μg/mL作为牡丹皮醇提物给药浓度。见图6。

3.7 6组通透性和紧密连接蛋白相对表达量比较

与空白组比较，模型组通透性升高，Claudin-5、Occludin、ZO-1蛋白相对表达量均降低（P＜0.05）；与模型组比较，牡丹皮醇提物低、中、高剂量组及地塞米松组通透性均降低（P＜0.05），Claudin-5、Occludin、ZO-1蛋白相对表达量均升高（P＜0.05）。见图7和图8。

3.8 6组ERK1/2和mTOR/HIF-1α/VEGF通路相关蛋白相对表达量比较

与空白组比较，模型组p-ERK1/2、p-mTOR、HIF-1α、VEGF蛋白相对表达量显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，牡丹皮醇提物低、中、高剂量组及地塞米松组上述指标显著降低（P＜0.05），见图9。

4 讨　论

血管内皮作为血管壁的关键功能层，其屏障特性对于维持血管稳态至关重要。该屏障可通过物理阻隔效应，限制血浆蛋白及循环细胞等物质透过内皮细胞层，从而在防止体液外渗、维持组织微环境稳定方面发挥核心作用。然而，在病理条件下，血浆白蛋白、红细胞等大分子物质可通过细胞间连接介导的跨内皮转运途径发生异常渗漏，这一现象提示：细胞间紧密连接的结构完整性及功能调控对血管通透性的动态平衡具有决定性影响。血管内皮细胞之间的连接包括紧密连接、细胞之间的黏附连接以及内皮细胞-基底膜之间的黏附连接，共同构成对水、溶质和较大分子的选择性屏障^［12］。其中，紧密连接由不同类型的跨膜黏附蛋白（如Occludin、Claudins、连接黏附分子）组成，这些连接蛋白通过内皮细胞的ZO-1和细胞丝状肌动蛋白（filamentous actin，F-actin）相连接。Claudin-5通过形成细胞间离子通道，在细胞旁通透性的物理调节中起着关键作用^［13］。Occludin可以调节紧密连接的形成和分解，并可以通过蛋白激酶C（PKC）、MAPK和肌球蛋白轻链激酶（MLCK）调节跨膜蛋白（肌动蛋白和肌球蛋白）的活性来维持紧密连接的完整性。ZO-1是中间连接器，可以用肌动蛋白紧密结合Claudin-5、Occludin^［14］。

本研究结果表明，牡丹皮醇提物浓度在100 μg/mL以下对细胞活力无显著影响，提示在该浓度范围内无细胞毒性。牡丹皮醇提物低、中、高剂量组可显著降低LPS所致血管内皮通透性，升高Claudin-5、Occludin、ZO-1在HUVECs中的表达，表明牡丹皮醇提物可增强细胞间的紧密连接来降低血管内皮通透性。而牡丹皮醇提物不同剂量分组之间比较，上述指标差异无统计学意义，考虑为药物浓度已达到“剂量-效应关系平台期”或者存在非剂量依赖性的作用机制，这一点还有待后续研究进一步验证。

网络药理学预测结果进一步表明，牡丹皮醇提物改善脓毒症血管通透性与HIF-1α信号通路密切相关。近年来的研究表明ERK1/2（也分别称为MAPK3和MAPK1）激活可增加通透性并改变HUVECs中的细胞间连接^［15-16］；MAPK14又称作p38，p38信号通路在肠上皮屏障、胃黏膜屏障和血脑屏障中被激活，激活p38信号通路可升高紧密连接蛋白的表达^［17］；抑制mTOR通路会降低紧密连接蛋白闭合素表达和细胞增殖，并且提高LPS诱导的内皮通透性^［18］；HIF-1α和血管内皮生长因子A（VEGFA，又写作KDR）在血管通透性增高环节中扮演重要角色，HIF-1α的增加进一步诱导下游因子VEGF表达上调，最终导致血管通透性增加^［19］。VEGF通过促进血管内皮细胞一氧化氮（NO）和前列环素的合成，增加血管通透性^［20］。本研究结果显示：LPS处理HUVECs细胞后，HIF-1信号通路的关键靶点ERK1/2、mTOR的磷酸化水平显著升高，HIF-1α、VEGF表达显著上调，表明牡丹皮提取物可显著降低P-ERK1/2、mTOR，抑制VEGF、HIF-1α的表达。上述结果表明，牡丹皮醇提物可能通过下调活化的ERK1/2和mTOR/HIF-1α/VEGF信号通路，从而稳定其下游的细胞间连接蛋白，改善HUVECs通透性。

本研究采用网络药理学和体外实验验证实牡丹皮醇提物可能通过下调ERK1/2和mTOR/HIF-1α/VEGF信号通路活化，显著改善脓毒症血管内皮通透性。这为传统中药牡丹皮治疗血热出血证的临床应用提供了实验基础，为阐释牡丹皮清热凉血的科学内涵提供了实验依据。也为今后进一步开展体内实验研究来阐释中医清热凉血的科学内涵提供了方向。

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基金资助

国家中医药管理局临床中药学高水平中医药重点学科建设项目(国中医药人教函〔2022〕226号)

福建省自然科学基金项目(2023J01857)

福建中医药大学财政补助专项项目(X2023005)