蛇床子银纳米粒喷膜剂制备工艺的研究

摘要

目的 以蛇床子银纳米粒（Cm-AgNPs）为主药，成膜材料为载体，加入其他辅料共同制备Cm-AgNPs喷膜剂，并验证其抗浅部真菌的效果。 方法 采用单因素实验，以喷膜剂的溶液状态、喷雾效果、成膜时间、流动性（以运动黏度为评定指标）、膜性能为评价指标，考察筛选聚乙烯比咯烷酮K30（PVPK30）、聚乙烯醇0588（PVA0588）、甘油、乙醇及Cm-AgNPs这5个因素的较优含量，进一步以PVPK30、PVA0588和甘油3个因素进行响应面优化，得到最佳成膜处方；通过喷膜剂性状、酸碱度（pH）、运动黏度、成膜时间、透气性、吸湿性、膜的显微特征及差式扫描量热法（DSC）对Cm-AgNPs喷膜剂、空白基质（不含Cm-AgNPs）、PVPK30、PVA0588、Cm-AgNPs以及空白基质与Cm-AgNPs物理混合物6组组分进行吸热分析，作初步质量评价；设立Cm-AgNPs喷膜剂组、Cm-AgNPs混悬液组、蛇床子提取液组、氟康唑组、特比萘芬组、空白对照组、溶剂对照（DMSO）组，参照美国临床实验室标准，采用微量稀释法测定各组对须癣毛癣菌、红色毛癣菌和白色念珠菌的最低抑菌浓度（MIC），考察其体外抗浅部真菌活性。 结果 单因素实验筛选出上述5个因素的较优含量：PVPK30 2.5 g，PVA0588 1.6 g，甘油1 mL，乙醇30 mL，Cm-AgNPs 50 mg。响应面优化后的最佳喷膜剂处方为每50 mL中含PVPK30 2.46 g、PVA0588 1.61 g和1 mL甘油。喷膜剂性状为棕褐色液体，具有乙醇味和辛凉薄荷味；平均pH为6.22，流动性良好，运动黏度不低于28 mm²/s；平均成膜时间为330 s；平均透气性为51.69%；平均吸湿性为17.60%；显微镜下结果显示：200倍镜和500倍镜下均未见明显气泡及颗粒；DSC结果分析显示：PVPK30组、Cm-AgNPs喷膜剂组、空白基质与Cm-AgNPs物理混合组和空白基质组均在80 ℃左右存在吸热峰，PVA0588组在190 ℃存在吸热峰，合成Cm-AgNPs喷膜剂后此峰消失。体外抗菌实验结果表明：Cm-AgNPs喷膜剂对须癣毛癣菌、红色毛癣菌和白色念珠菌的MIC分别为2.34、1.17、1.17 μg/mL，均低于Cm-AgNPs混悬液组和蛇床子提取液组（P＜0.05）；与Cm-AgNPs喷膜剂组比较，特比萘芬组对红色毛癣菌和须癣毛癣菌的MIC值均降低（P＜0.05），氟康唑组对红色毛癣菌和白色念珠菌的MIC值降低（P＜0.05），而对须癣毛癣菌的MIC值则升高。溶剂对照组和空白对照组均对真菌生长无影响。 结论 本研究成功制备了Cm-AgNPs喷膜剂，工艺简便且重复性好，成膜时间较短，具有良好稳定性、透气性及较强的抗浅部真菌活性，扩大了蛇床子银纳米粒的临床应用范围。

Graphical abstract

关键词

蛇床子银纳米粒 / 喷膜剂 / 处方优化 / 浅部真菌感染 / 质量评价

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蛇床子是伞形科植物蛇床Cnidiummonnieri （L.） Cuss.的干燥成熟果实，具有祛风杀虫止痒等功效，现代药理学研究表明，其抗菌消炎作用较强^［1-5］。银纳米（AgNPs）是由银原子组成的、粒径通常在1～100 nm的颗粒，相比普通银，AgNPs抗菌活性更强^［6-7］。本实验室前期利用蛇床子绿色合成粒径小且稳定性好的银纳米粒，并在测试其体外抗菌性能后发现：蛇床子银纳米粒（Cm-AgNPs）明显抑制红色毛癣菌和须癣毛癣菌的活性，同时对白色念珠菌也产生较强的抑制作用，与氟康唑具有相似疗效，展示出该纳米粒子在抗浅部真菌感染的巨大潜力^［8］。

喷膜剂作为结合膜剂、喷雾剂优点于一体的新型外用给药剂型，制备工艺简单，使用方法简便，即按压喷瓶把成膜溶液定量喷于患处，溶剂迅速挥干后形成均一透明药膜，持续给药的同时，还能隔离保护创面，提高其生物利用度^［9-13］。本实验在前期基础上以Cm-AgNPs为主药，加入适宜成膜材料及挥发性溶剂等，制备Cm-AgNPs喷膜剂，有望为患有皮肤癣病的患者提供一种新型快速长效抗真菌制剂，提高其生活质量。

1 仪器与材料

1.1 仪器

万分之一电子天平［奥豪斯仪器（常州）有限公司，型号：EX225DZH］；超纯水机（德国Think-lab公司，型号：Labonova Direct Pro）；集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市创远仪器制造有限公司，型号：DF-101Z）；恒温烘箱（上海一恒科学仪器有限公司，型号：DHG-9245A）；pH计（上海梅勒特-托利多仪器有限公司，型号：FiveEasy Plus）；光学显微镜（日本奥林巴斯株式会社，型号：Olympus BX53）；差示扫描量热仪（日本日立株式会社，型号：HITACHI STA200）；CO₂细胞培养箱（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司，型号：BC-J160）；生物安全柜（北京东联哈尔仪器制造有限公司，型号：BSC-1360 Ⅱ A2）。

1.2 材料与试剂

Cm-AgNPs由本课题组实验室提供；聚乙烯比咯烷酮K30（PVPK30，天津市众联化学试剂有限公司，批号：20230911）；聚乙烯醇0588（PVA0588，上海臣启化工科技有限公司，批号：20231117008）；丙三醇（四川西陇科学有限公司，批号：2309151）；薄荷脑（天津市众联化学试剂有限公司，批号：20231011）；氟康唑（中国食品药品检定研究院，批号：100314-201605）；盐酸特比萘芬（中国食品药品检定研究院，批号：100563-202103）；RPMI 1640液体培养基（武汉博士德生物工程有限公司，批号：18C10A35）；沙保罗琼脂培养基（法国Bio Mérieux公司，批号：20162400355）；细胞计数板（日本WATSON公司，批号：02270113）；96孔细胞培养板（美国Corning公司，批号：25624102E）；其他试剂均为分析纯。

1.3 菌株

须癣毛癣菌（Trichophyton mentagrophytes，北京北纳创联生物技术研究院，菌种编号：BNCC340405）；红色毛癣菌（Trichophyton rubrum，北京北纳创联生物技术研究院，菌种编号：BNCC 340195）；白色念珠菌（Candida albicans）来自临床分离株，由中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院检验科提供。

2 实验方法

2.1 Cm-AgNPs的制备

本实验室前期将中药蛇床子加热回流、减压浓缩后得到蛇床子提取液并调节pH＝10，另取4 mL硝酸银溶液加纯水稀释至12.5 mmol/L，以700 r/min转速进行磁力搅拌，将蛇床子提取液缓慢滴加至烧杯中并继续常温搅拌，反应1 h，成功制得抗浅部真菌活性较强的Cm-AgNPs^［8］。

2.2 前期预实验基础

为筛选最佳成膜材料组合，前期实验以溶液状态、喷雾效果和膜性能为指标，筛选出最佳成膜材料组合PVPK30和PVA0588，其浓度范围分别在4%～8%和3%～6%时，各指标结果良好，因此在该基础上可进行下一步的条件优化。

基本制备工艺如下：取2.5 g PVPK30和1.5 g PVA0588置于烧杯内，90 ℃下以700 r/min转速进行加热磁力搅拌溶胀1 h，待溶胀完全后，加入30 mg Cm-AgNPs后继续常温磁力搅拌，另取50 mg薄荷脑以20 mL无水乙醇溶解后加入混匀，最后再加入2 mL甘油，室温搅拌1 h至溶液均匀，纯水稀释至50 mL，装瓶。

2.3 单因素实验

前期预实验发现搅拌转速、时间和加热温度仅影响成膜材料的溶解状态及速度，对喷膜剂的质量无明显影响，因此不作单因素考察。根据前期预实验确定的基本处方制备Cm-AgNPs喷膜剂，以喷膜剂的溶液状态、喷雾效果、成膜时间、流动性（以运动黏度为表征）、膜性能为评价指标^［14-16］，筛选成膜处方各组分的较优用量。

2.3.1 PVPK30用量的筛选

固定其他因素不变，设置PVPK30的含量分别为1.5、2、2.5、3.0、3.5 g进行单因素考察，筛选PVPK30的最佳用量。

2.3.2 PVA0588用量的筛选

在选定PVPK30最佳用量的前提下，固定其他因素不变，将PVA0588的含量分别设置为0.6、1.1、1.6、2.1、2.6 g进行单因素考察，筛选PVA0588的最佳用量。

2.3.3 甘油用量的筛选

在选定PVPK30、PVA0588最佳用量的前提下，固定其他因素不变，将甘油的含量分别设置为0、0.5、1、1.5、2 mL进行单因素考察，筛选甘油的最佳用量。

2.3.4 无水乙醇用量的筛选

在选定PVPK30、PVA0588、甘油最佳用量的前提下，固定其他因素不变，将无水乙醇的含量分别设置为20、25、30、35、40 mL进行单因素考察，筛选无水乙醇的最佳用量。

2.3.5 Cm-AgNPs用量的筛选

在选定PVPK30、PVA0588、甘油、无水乙醇最佳用量的前提下，固定其他因素不变，在不影响喷膜剂溶液状态和喷出效果的情况下，尽量加入更多的Cm-AgNPs，即20、30、40、50、60 mg，进行单因素考察，筛选Cm-AgNPs的最佳用量。

2.4 溶液及膜的评价指标

在单因素考察得到的用量基础上，利用Box Behnken优化法筛选最佳成膜处方，结合喷雾效果、成膜时间、流动性和膜性能进行综合评价，各项指标的评分相加即为Cm-AgNPs喷膜剂综合评分的总得分。

2.4.1 喷雾效果

满分25分。21～25分视为细密雾状为最佳状态；15～20分视为半喷雾状态；10～15分视为稀疏线状；1～10分视为线状^［15］。

2.4.2 成膜时间

满分25分。将制备好的Cm-AgNPs喷膜剂以相同的频次均匀喷洒在同样大小的载玻片上，放置于36 ℃的烘箱中并计时，平行3次，观察表面完全干燥后记录成膜时间。成膜时间≤5 min，评分为25分，在此基础上每增加10 s，得分相应减少1分^［14］。

2.4.3 流动性

在外用皮肤制剂中，溶液流动性与患者依从性关系密切^［17］。喷膜剂中溶液喷洒至皮肤表面患处时，流动性差会导致制剂喷涂抹费力甚至拉扯皮肤，以及不透气产生的黏腻闷热等不适症状，进而降低患者用药体验感，影响其依从性。因此溶液流动性越小，患者依从性越强。黏度是流体黏滞性的量度，指流体对流动产生阻抗能力的性质。以运动黏度为评价指标判定溶液流动性，满分25分。以单因素实验所得的运动黏度范围为基础，判断在28～30 mm²/s，评分为25分，在此基础上运动黏度值每增加或减少1 mm²/s（若在1 mm²/s之内，仍按照1 mm²/s判断），得分相应减少1分^［16］。

2.4.4 膜性能

满分25分。包括揭膜难度10分、感官柔韧性10分、膜有无气泡和均匀度5分。① 揭膜难度：溶液干燥后能完整撕下一层药膜且能搓成条状或细丝状计为7≤分数＜10分，药膜能搓成细条状但不能完整揭下为5≤分数＜7分，判断为难以揭膜且不能搓成细丝状为0≤分数＜5分；② 感官柔软性：以实验人员手背皮肤为实验对象，将喷膜剂在距离5 cm处喷洒3次，待干燥成膜后握拳、松手，感受皮肤紧绷程度，皮肤几乎无紧绷感，柔软为7≤分数＜10分，感到略微紧绷，较柔软为5≤分数＜7分，有紧绷感为0≤分数＜5分；③ 膜有无气泡和均匀度：膜表面无气泡且透明均匀为3≤分数＜5分，表面有小气泡或略显浑浊则评0≤分数＜3分^{［15，18］}。

2.5 响应面优化设计

以Cm-AgNPs喷膜剂中的喷雾效果、成膜时间、运动黏度、膜性能为综合因素考察的综合评分为响应值，在单因素实验的基础上，选取随着各因素含量改变，考察指标均发生不同程度变化且对成膜质量影响较大的3个因素PVPK30含量（A）、PVA0588含量（B）、甘油含量（C）进行考察。根据Box-Behnken设计因素水平表，采用Design-Expert13.0.1.0软件设计17组实验方案。因素水平选取见表1。

3 实验结果

3.1 单因素考察结果

3.1.1 PVPK30用量的筛选结果

随着PVPK30含量的增加，其运动黏度和膜厚度亦有所增加，增加至3 g时呈半喷雾状态喷出，溶液变得黏稠，喷膜剂溶液状态未发生明显变化。PVPK30含量增加使成膜时间呈现出先减小后增大的趋势，但对膜韧性影响不大，仅含量增加至3.5 g时会导致膜较厚。综合考虑，选取2.5 g PVPK30进行后续的单因素考察。见表2。

3.1.2 PVA0588用量的筛选结果

随着PVA0588浓度的增加，喷膜剂溶液状态未发生变化，运动黏度逐渐加大，流动性减小，膜厚度增加，当含量增加至2.1 g呈半喷雾状态喷出，2.6 g时则呈线状喷出，同时延长了成膜时间。PVA0588含量增加使成膜时间呈现出先减小后增大的趋势，但对膜韧性影响不大，仅在2.6 g时导致膜较厚。综合考虑，选取1.6 g PVA0588进行后续的单因素考察。见表3。

3.1.3 甘油用量的筛选结果

随着甘油含量的增加，喷膜剂溶液状态未发生改变，运动黏度逐渐加大，膜性能受到影响，增加至2 mL时喷雾效果呈半喷雾状态，成膜时间延长。作为增塑剂，甘油含量增加使成膜时间呈现缓慢增长的趋势，其含量为0和0.5 mL时，膜韧性较差；其含量为1.5 mL时，虽喷出效果呈雾状，但膜韧性不佳；其含量达到2 mL时，膜韧性差。结合各指标，当甘油用量为1 mL时，膜性能、成膜时间、运动黏度及喷雾效果均良好，故选取1 mL甘油进行后续的单因素考察。见表4。

3.1.4 无水乙醇用量的筛选结果

随着无水乙醇含量的增加，与无水乙醇的挥发性有关，成膜时间随之减少，喷膜剂溶液状态和膜性能均未受明显影响。适当增加无水乙醇的用量可缩短成膜时间，但含量过高可能会对皮肤造成刺激。无水乙醇含量为30 mL时，运动黏度适中，既不会过低导致流动性增大，也不会过高使得溶液粘稠，因此综合考虑选取30 mL无水乙醇。见表5。

3.1.5 Cm-AgNPs含量的筛选结果

20、30、40、50 mg Cm-AgNPs对喷膜剂喷雾效果、成膜时间、流动性及膜性能均无明显影响。Cm-AgNPs含量增加到60 mg时，喷膜剂溶液状态发生变化，出现明显沉淀，影响溶液喷出后的均匀性，综合考虑选取50 mg作为Cm-AgNPs喷膜剂的最佳含量。见表6。

3.2 响应面优化结果

以PVPK30含量（A）、PVA0588含量（B）和甘油含量（C）为影响因子，综合评分为响应值，响应面优化设计结果见表7。

采用软件Design-Expert 13.0.1.0对表7数据进行处理，方差分析结果见表8。得回归拟合方程：

综合评分＝86.2＋0.375A＋4.25B＋0.125C－3.75AB＋3AC＋0.25BC－5.35A²－8.1B²－4.85C²

该模型P＜0.000 1表明差异具有统计学意义，失拟项P＝0.303 0（P＞0.05）表明差异不具有统计学意义，说明该模型可信。拟合方程决定系数为R²＝0.975 2，表明拟合性良好，校正决定系数R²_Adj＝0.943 3，R²_pred＝0.760 2，差值小于0.2，进一步说明模型可用于响应值分析预测。

各因素间交互作用对响应值的影响见图1：曲面图中，坡度越陡呈伞状，各因素间交互作用越显著；等高线图中，形状越椭圆，交互作用越显著。结果表明：随着3个因素浓度增加，曲面图呈伞状，综合评分均呈现先增后减的趋势，说明PVPK30、PVA0588、甘油均对Cm-AgNPs喷膜剂有影响。

根据响应面优化实验中的回归拟合方程分析得到最优处方：Cm-AgNPs喷膜剂每50 mL中PVPK 30含量为2.46 g，PVA0588含量为1.61 g，甘油含量为1 mL。

3.3 最优处方验证

在最优处方条件下，制得3批样品（202479-1、202479-2、202479-3）并进行验证性实验，结果见表9。实际综合评分86.333与Design-Expert软件预测的综合评分86.776相近，表明该处方条件真实可靠，具有可行性。

3.4 Cm-AgNPs喷膜剂制备工艺

经过成膜处方的筛选优化，可得Cm-AgNPs喷膜剂完整制备工艺如下：精密称取2.46 g PVPK30和1.61 g PVA0588置于烧杯内加入适量纯水，于90 ℃条件下搅拌1 h溶胀完全，随后加入50 mg Cm-AgNPs，在50 ℃下继续以700 r/min进行磁力搅拌，另称取50 mg薄荷脑用无水乙醇少量多次溶解后混匀，最后精密吸取甘油1 mL，室温下均匀搅拌1 h，待溶液消泡，最后加入适量纯水稀释至50 mL，混合均匀后装入喷雾瓶中。

4 质量评价

将最优处方制得的3批样品进行重复验证试验，考察其性状、酸碱度（pH）、流动性、成膜时间、透气性、吸湿性等，从而对Cm-AgNPs喷膜剂进行质量评价^［19-24］。

4.1 性状

制备的Cm-AgNPs喷膜剂为棕褐色液体，具有乙醇味和辛凉薄荷味。

4.2 酸碱度

3批Cm-AgNPs喷膜剂pH值见表10，平均值为6.22，RSD为0.35%，由于人体正常皮肤表面pH值在5.0～7.0，基本处于弱酸性条件。因此Cm-AgNPs喷膜剂pH值在正常范围内，不会破坏人体皮肤表面正常pH环境，对皮肤无刺激性。

4.3 流动性

药膜喷出后在治疗部位的流动性影响药物吸收及患者的服从性，因此考察流动性是评价喷膜剂的重要指标之一^［17］。本研究采用平氏毛细管黏度计测定法，计算Cm-AgNPs喷膜剂的运动黏度，以此作为流动性的考察指标。结果显示：Cm-AgNPs喷膜剂的运动黏度不低于28 mm²/s。见表11。

4.4 成膜时间

将制得的3批Cm-AgNPs喷膜剂喷洒在载玻片（76 mm×26 mm）上，置于36 ℃的烘箱中干燥，待膜不粘手时，停止观测，并记录3批喷膜剂的成膜时间。实验表明，Cm-AgNPs喷膜剂的平均成膜时间为330 s。见表12。

4.5 透气性

取2支10 mL试管，标记为1、2号，烘干，取1.0 g无水Na₂SO₄分别加入到试管中，称定总质量，记为M₁、M₂。接着把药膜剪切为适宜尺寸，将试管1封口，放入饱和NaCl溶液中，室温下过夜24 h后取出，除掉密封药膜，称重并做好记录，记为M₁′。将只加等量无水Na₂SO₄不作封口处理的试管2作为对照，放入饱和NaCl溶液中，室温下过夜24 h后取出，称重并做好记录，记为M₂′。实验平行测定5次，按照公式计算膜的透气性，结果见表13。可得，Cm-AgNPs喷膜剂制得的膜平均透气性为51.69%。

透气性（％）＝（M₁′－M₁）/（M₂′－M₂）×100％

注：M₁为含无水Na₂SO₄试管1的质量（g）；M₁′为24 h透气后含无水Na₂SO₄试管1的质量（g）；M₂为含无水Na₂SO₄试管2的质量（g）；M₂′为24 h透气后含无水Na₂SO₄试管2的质量（g）。

4.6 吸湿性

将100 mL烧杯洗净，烘干，称重，记为M。将药膜剪切为直径为2 cm的圆，并置于100 mL烧杯中，在50 ℃恒温干燥箱中干燥至恒重（即药膜水分完全蒸发，前后称量重量不变），最后称其总重量，记为M₁。接着将干燥后的药膜放入饱和NaCl溶液中，密闭室温过夜，24 h后取出称重，记为M₂。实验平行测定5次。根据下列公式计算膜的吸湿性，见表14。可得Cm-AgNPs喷膜剂制得的膜平均吸湿性为17.60%。

吸湿率（%）＝（M₂－M₁）/（M₁－M）×100%

注：M为空烧杯质量（g）；M₁为吸湿前膜和空烧杯质量（g）；M₂为吸湿后膜和空烧杯质量（g）。

4.7 膜的表征

通过观察Cm-AgNPs喷膜剂的显微结构，进一步了解成膜材料之间与其他辅料的相容情况^{［14，22-24］}。

4.7.1 膜的显微特征

在载玻片上喷洒制备得到的Cm-AgNPs喷膜剂，分别于显微镜200倍和500倍镜下观察膜的显微特征。结果显示：200倍镜下未见明显气泡及颗粒，500倍镜下可见膜致密均匀，同样无明显气泡，见图2。说明成膜材料与Cm-AgNPs融合良好，质地均匀。

4.7.2 差示扫描量热法分析

设立Cm-AgNPs喷膜剂组、空白基质组（除去Cm-AgNPs，由喷膜剂其他成分组成）、PVPK30组（仅含成膜材料PVPK30）、PVA0588组（仅含成膜材料PVA0588）、Cm-AgNPs组（仅含Cm-AgNPs）以及空白基质与Cm-AgNPs物理混合物组（由Cm-AgNPs和空白基质通过物理搅拌混合而成）。采用差示扫描量热法（DSC）对上述6组进行吸热分析，各组样品量控制在8～11 mg，在氮气保护下，升温速率设置为10 ℃/min，升温范围为30～300 ℃。结果如图所示：PVPK30组、Cm-AgNPs喷膜剂组、空白基质与Cm-AgNPs物理混合组和空白基质组均在80 ℃左右存在吸热峰，PVA0588组在190 ℃存在吸热峰，合成Cm-AgNPs喷膜剂后此峰消失，说明成膜材料与其他基质混合良好。见图3。

5 抗浅部真菌考察

5.1 抗真菌药物的制备

将冷冻干燥24 h后的蛇床子提取液冻干粉和Cm-AgNPs冻干粉用纯水分别配制成浓度为120 mg/mL和0.2 mg/mL的溶液；通过“3.4”项下的制备工艺配制浓度为0.6 mg/mL的Cm-AgNPs喷膜剂；阳性药氟康唑、特比萘芬分别用二甲基亚砜（DMSO）配制成6.4、0.1 mg/mL的溶液。

5.2 菌悬液的配制

须癣毛癣菌、红色毛癣菌和白色念珠菌接种于沙保罗葡萄糖琼脂培养基，28 ℃条件下培养。刮取生长状态良好的菌落，置于生理盐水中吹打混匀，采用血细胞板计数，并使用RPMI-1640培养基调整菌悬液浓度为1×10⁵～1×10⁶ CFU/mL，备用。

5.3 最低抑菌浓度的测定

根据美国临床实验室标准化研究所M38和M27-A3方案^［25-26］，采用微量稀释法测定Cm-AgNPs喷膜剂对须癣毛癣菌、红色毛癣菌和白色念珠菌的最低抑菌浓度。

设立Cm-AgNPs喷膜剂组、Cm-AgNPs混悬液组、蛇床子提取液组、氟康唑组、特比萘芬组、空白对照组、溶剂（DMSO）对照组，以2倍数进行倍比稀释，将各组药物稀释至不同浓度。① Cm-AgNPs喷膜剂组：精密吸取配制的0.6 mg/mL Cm-AgNPs喷膜剂溶液50 μL与150 μL培养基混合，稀释浓度为75、37.50、18.75、9.38、4.69、2.34、1.17、0.59、0.29 μg/mL。② Cm-AgNPs混悬液组：精密吸取配制的0.2 mg/mL Cm-AgNPs混悬液50 μL与150 μL培养基混合，稀释浓度为25、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.20、0.10 μg/mL。③ 蛇床子提取液组：精密吸取配制的120 mg/mL 蛇床子提取液50 μL与150 μL培养基混合，稀释浓度为15 000、7 500、3 750、1 875、937.50、468.75、234.38、117.19、58.59 μg/mL。④ 氟康唑组：精密吸取配制的6.4 mg/mL 氟康唑溶液1 μL与199 μL培养基混合，稀释浓度为16、8、4、2、1、0.50、0.25、0.13、0.06 μg/mL；念珠菌培养板中，精密吸取配制的6.4 mg/mL氟康唑溶液2 μL与198 μL培养基混合，稀释浓度为32、16、8、4、2、1、0.50、0.25、0.13 μg/mL。⑤ 特比萘芬组：精密吸取配制的0.1 mg/mL特比萘芬溶液1 μL与199 μL培养基混合，稀释浓度为0.25、0.13、0.06、0.03、0.02、0.008、0.004、0.002、0.001 μg/mL；念珠菌培养板中，精密吸取配制的0.1 mg/mL 特比萘芬溶液2 μL与198 μL培养基混合，稀释浓度为0.5、0.25、0.13、0.06、0.03、0.02、0.008、0.004、0.002 μg/mL。⑥ 空白对照组：精密吸取200 μL RPMI-1640培养基。⑦ 溶剂对照组：毛癣菌培养板加0.5%DMSO，念珠菌培养板加1% DMSO。

根据M38和M27-A3方案，于28 ℃条件下将白色念珠菌培养24 h，须癣毛癣菌和红色毛癣菌培养7 d。通过2名实验者肉眼观察，以阳性对照孔菌落清晰，阴性对照孔无菌生长为判定标准，完全无菌生长孔的最低药物浓度作为最低抑菌浓度（MIC），平行实验3次，其MIC波动范围不超过1个药物浓度，即视为结果数据可靠，并以高浓度MIC为准，若不符，则再次测量^［27-28］。

5.4 7组药物对不同菌株的MIC值比较

根据 Shapiro-Wilk检验结果，各组的MIC数据不服从正态分布（P＜0.05），故采用Kruskal-Wallis检验检测组间差异。Cm-AgNPs喷膜剂对须癣毛癣菌、红色毛癣菌和白色念珠菌的MIC分别为2.34、1.17、1.17 μg/mL，均低于Cm-AgNPs混悬液组和蛇床子提取液组（P＜0.05），表明其抗浅部真菌效果优于混悬液组和蛇床子提取液组。与Cm-AgNPs喷膜剂组比较，特比萘芬组对红色毛癣菌和须癣毛癣菌的MIC值均降低（P＜0.05），氟康唑组对红色毛癣菌和白色念珠菌的MIC值降低（P＜0.05），而对须癣毛癣菌的MIC值则升高（P＜0.05），说明Cm-AgNPs喷膜剂对须癣毛癣菌的抗菌活性较氟康唑更优。溶剂对照组和空白对照组均对真菌生长无影响。见表14。

6 讨　论

浅部真菌病抗菌药品的外用制剂有乳膏剂（复方酮康唑等）、凝胶剂（特比萘芬等）、霜剂（咪康唑等）、洗剂及涂膜剂等^［29-33］，在临床使用中均存在一定局限：软膏释药性差且油腻不宜清洗；膜剂载药量少且吸收率不高；凝胶剂载药量较小且不可调节剂量，润滑性较差，又容易失水和霉变；洗剂和霜剂则有皮肤渗透性较差，易流散挥发的缺陷^{［31，34-37］}。而喷膜剂作为结合膜剂、喷雾剂优点于一体的新型外用给药剂型，能够为皮肤真菌感染外用制剂提供一个新思路。

目前有关喷膜剂的研究多集中于中药或是复方上，未有结合蛇床子银纳米粒的相关报道。本课题采用Cm-AgNPs为主药，加入适宜成膜材料及乙醇、甘油等，制备Cm-AgNPs喷膜剂，为皮肤癣菌病的治疗提供新思路。本研究以成膜时间、喷雾效果、运动黏度为表征的流动性及膜性能为评价指标，对成膜处方进行筛选，并通过响应面优化法得到最优处方为PVPK30 2.46 g、PVA0588 1.61 g、甘油1 mL。由此可得Cm-AgNPs喷膜剂制备工艺为：于烧杯内加适量纯水将精密称取的2.46 g PVPK30和1.61 g PVA0588成膜材料混合，90 ℃下搅拌1 h溶胀完全，接着加50 mg Cm-AgNPs，50 ℃下以700 r/min进行磁力搅拌，另取50 mg薄荷脑用无水乙醇少量多次溶解后混匀，最后精密吸取甘油1 mL，室温下均匀搅拌1 h，待溶液消泡后加入适量纯水稀释至50 mL，混合均匀后装入喷雾瓶中。

由于《中华人民共和国药典》暂未收录喷膜剂，为了对该剂型进行科学的质量评价，本研究从性状、酸碱度、流动性、透气性、吸湿性和成膜时间等方面综合考察Cm-AgNPs喷膜剂，得到其性状为棕褐色透明液体；平均pH值为6.22；流动性良好；平均成膜时间为330 s；平均透气性为51.69%；平均吸湿性为17.60%。Cm-AgNPs喷膜剂酸碱度适中，不会对皮肤产生刺激，成膜时间较短且膜透气，表征结果成膜材料与Cm-AgNPs能够较好融合，具有良好的柔韧性。因此本研究进行初步质量评价，提高药品质量，便于后续喷膜剂稳定性、急毒性的考察，增强临床用药安全性及合理性。

须癣毛癣菌、红色毛癣菌作为我国浅部真菌感染致病菌种，生长速度较快，菌落形态明显，易于实验室培养保存，是研究抗真菌药物体外实验的首选受试菌种^［38-41］。不同于上述皮肤癣菌，白色念珠菌是人体正常菌群，仅在机体免疫力降低时引发真菌感染，并且适用于多种培养基，极易培养，繁殖速度迅速，便于实验操作。为进一步研究Cm-AgNPs喷膜剂抗浅部真菌作用，故将上述3种菌群列入本研究。体外抗真菌实验结果表明：单独的Cm-AgNPs混悬液对须癣毛癣菌、红色毛癣菌和白色念珠菌的最低抑菌浓度分别为6.25、3.13、3.13 μg/mL，而本研究制备的Cm-AgNPs喷膜剂对须癣毛癣菌、红色毛癣菌和白色念珠菌的最低抑菌浓度分别为2.34、1.17、1.17 μg/mL，可能是Cm-AgNPs被成膜材料包覆着，比单独的Cm-AgNPs混悬液更具有缓慢释放药效的能力，使药物浓度逐渐蓄积，因此具有比单纯原料药更强的抑制浅部真菌疗效。

本研究制备的Cm-AgNPs喷膜剂，工艺简便且重复性好。在抗浅部真菌的考察中表现出较强的抗菌效果，为蛇床子银纳米粒在抗浅部真菌感染的应用提供了参考，也为喷膜剂在中药领域的应用提供了思路。

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基金资助

福建省自然科学基金项目(2021J011274)

中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院面上项目(2022MS18)