从脊髓背角5-羟色胺2A受体探讨腕踝针治疗急性内脏痛的作用机制

Mechanism of Wrist-Ankle Acupuncture in Treating Acute Visceral Pain Based on 5-hydroxytrypta⁃mine 2A Receptor in Spinal Dorsal Horn

摘要

目的 探讨脊髓背角5-羟色胺2A受体（5-HT_2AR）在腕踝针治疗急性内脏痛的镇痛作用机制。 方法 采用随机数字表法将SD大鼠分为对照组、模型组、腕踝针组、腕踝针+激动剂组和拮抗剂组，每组10只。模型组、腕踝针组、腕踝针+激动剂组、拮抗剂组均按10 mL/kg腹腔注射1%乙酸溶液，制备急性内脏痛模型；对照组按10 mL/kg腹腔注射0.9%氯化钠溶液。模型制备成功后，腕踝针组与腕踝针+激动剂组采用一次性无菌毫针以15°平刺入双侧踝部“下1”“下2”区，刺入深度为1.5 mm，留针6 h，每日1次，共针刺7次；腕踝针＋激动剂组于第3、5、7天分别按1 mg/kg鞘内注射5-HT_2AR激动剂DOI hydrochloride；拮抗剂组于第3、5、7天分别按1 mg/kg鞘内注射5-HT_2AR拮抗剂酮色林；对照组和模型组仅对大鼠进行常规抓取和固定处理，不施加任何干预措施。观察最后1次取针后1 h内扭体反应次数并记录；Western blot检测脊髓背角5-HT_2AR蛋白表达量；ELISA检测脊髓背角γ-氨基丁酸（GABA）含量；免疫荧光法检测脊髓背角5-HT_2AR、GABA含量，并计算5-HT_2AR、GABA皮尔森相关系数。 结果 与对照组比较，模型组扭体次数均明显增加（P＜0.05）；脊髓背角5-HT_2AR蛋白表达量明显升高（P＜0.05），GABA含量均明显降低（P＜0.05），5-HT_2AR、GABA皮尔森相关系数均明显降低（P＜0.05）。与模型组比较，腕踝针组和拮抗剂组扭体次数均明显减少（P＜0.05）；脊髓背角5-HT_2AR蛋白表达量均明显降低（P＜0.05），GABA含量均明显升高（P＜0.05），5-HT_2AR、GABA皮尔森相关系数均明显升高（P＜0.05）。与腕踝针组比较，腕踝针＋激动剂组的扭体次数明显增加（P＜0.05）；脊髓背角5-HT_2AR蛋白表达量明显升高（P＜0.05），GABA含量明显降低（P＜0.05），5-HT_2AR、GABA皮尔森相关系数明显降低（P＜0.05）。腕踝针组和拮抗剂组扭体次数和脊髓背角5-HT_2AR蛋白表达量、GABA含量以及5-HT_2AR、GABA皮尔森相关系数比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。 结论 腕踝针刺激双侧踝部“下1”“下2”区可有效缓解大鼠急性内脏痛，其机制可能与下调脊髓背角5-HT_2AR表达、上调GABA含量，进而恢复中枢痛觉抑制平衡有关；其中5-HT_2AR可能是腕踝针治疗急性内脏痛的关键靶点之一。

Abstract

Objective To investigate the mechanism of wrist-ankle acupuncture in treating acute visceral pain through the role of 5-hydroxytrypta⁃mine 2A receptor (5-HT_2AR) in the spinal dorsal horn. Methods SD rats were randomly divided into five groups (n=10 per group): control group, model group, wrist-ankle acupuncture group, wrist-ankle acupuncture+agonist group, and antagonist group. The acute visceral pain model was prepared by intraperitoneal injection of 1% acetic acid solution at a dose of 10 mL/kg in the model, wrist-ankle acupuncture, wrist-ankle acupuncture+agonist, and antagonist groups. The control group received an equivalent volume of 0.9% saline. Following successful modeling, rats in the wrist-ankle acupuncture and wrist-ankle acupuncture+agonist groups received acupuncture at bilateral ankle regions "Xia 1" and "Xia 2" with sterile disposable needles inserted subcutaneously at a 15° angle to a depth of 1.5 mm, retained for 6 h, once daily for 7 consecutive days. The wrist-ankle acupuncture+agonist group also received intrathecal injection of the 5-HT_2AR agonist DOI hydrochloride at a dose of 1 mg/kg on days 3, 5, and 7. The antagonist group received intrathecal injection of the 5-HT_2AR antagonist ketanserin at a dose of 1 mg/kg on days 3, 5, and 7. The control and model groups received only routine handling without intervention. One hour after the last needle removal, the number of writhing responses was recorded. The protein expression of 5-HT_2AR in the spinal dorsal horn was measured by Western blot; the content of γ-aminobutyric acid (GABA) in the spinal dorsal horn was measured by ELISA; the levels of 5-HT_2AR and GABA in the spinal dorsal horn were detected by immunofluorescence, and the Pearson correlation coefficient between 5-HT_2AR and GABA were calculated. Results Compared with the control group, the model group showed a significant increase in writhing responses (P<0.05), a significant increase in the protein expression of 5 HT_2AR (P<0.05), a significant decrease in the content of GABA (P<0.05), and a significant decrease in the Pearson correlation coefficient between 5 HT_2AR and GABA (P<0.05). Compared with the model group, both the wrist-ankle acupuncture and antagonist group showed a significant decrease in writhing responses (P<0.05), a significant decrease in the protein expression of 5 HT_2AR (P<0.05), a significant increase in the content of GABA (P<0.05), and a significant increase in the Pearson correlation coefficient between 5 HT_2AR and GABA (P<0.05). Compared with the wrist-ankle acupuncture group, the wrist-ankle acupuncture+agonist group showed a significant increase in writhing responses (P<0.05), a significant increase in the protein expression of 5 HT_2AR (P<0.05), a significant decrease in the content of GABA (P<0.05), and a significant decrease in the Pearson correlation coefficient between 5 HT_2AR and GABA (P<0.05). There were no statistically significant differences in writhing responses, 5 HT_2AR protein expression, GABA content, or Pearson correlation coefficient between the wrist-ankle acupuncture and the antagonist groups (P>0.05). Conclusion Stimulating the "Xia 1" and "Xia 2" areas of both ankles with wrist-ankle acupuncture can effectively alleviate acute visceral pain in rats. The mechanism may be related to the downregulation of 5-HT_2AR expression in the spinal dorsal horn and the upregulation of GABA content, thereby restoring the balance of central pain inhibition. Among them, 5-HT_2AR may be one of the key targets of wrist-ankle acupuncture in the treatment of acute visceral pain.

Graphical abstract

关键词

急性内脏痛 / 腕踝针 / 5-羟色胺2A受体 / 镇痛机制

Key words

acute visceral pain / wrist-ankle acupuncture / 5-hydroxytrypta⁃mine 2A receptor / analgesic mechanism

内脏痛是一种源于内脏器官的疼痛，通常表现为急性且剧烈的疼痛症状，其疼痛定位不明确，常伴有牵涉痛，是临床上常见的病症之一，若未能及时、有效地进行干预，内脏痛可能进展为慢性疼痛，是导致患者残疾的重要因素之一^［1］。近年来，针刺疗法因其确切的镇痛效果受到广泛关注，其中腕踝针作为一种微创针刺方法，已被广泛应用于多种疼痛性疾病的缓解与治疗中^［2-3］。已有研究表明，腕踝针在缓解内脏痛方面具有一定疗效，但其具体作用机制尚不明确^［4］。5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）是中枢神经系统中参与疼痛调节的重要神经递质之一，尤其在下行镇痛系统中发挥关键作用，其中5-羟色胺2A受体（5-hydroxytryptamine 2A receptor，5-HT_2AR）参与了对各种疼痛模型的疼痛调控^［5］。因此，本研究探讨腕踝针是否通过介导5-HT_2AR在中枢神经系统中的活动，从而实现对急性内脏痛的调控作用，以期为腕踝针治疗急性内脏痛提供理论依据与机制支持。

1 实验材料

1.1 实验动物

SPF级SD雄性大鼠50只，体质量220～250 g，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2022-0004，饲养于福建中医药大学实验动物中心，实验动物使用许可证号：SYXK（闽）2019-0007。饲养环境室温控制在24～26 ℃，相对湿度控制在50％～70％，采用自然光照周期，大鼠可自由饮水摄食。本实验方案经福建中医药大学动物伦理委员会批准（伦理号：FJTCM-IACUC-2021151），所有实验操作严格遵循动物伦理准则执行。

1.2 实验试剂

乙酸溶液（西陇科学股份有限公司，货号：12700101）；5-HT_2AR特异性激动剂DOI hydrochloride（货号：HY-103124，CAS号：40213-66-7）、5-HT_2AR选择性拮抗剂酮色林（Ketanserin，货号：HY-10562，CAS号：74050-98-9）均购自美国MedChemExpress公司；5-HT_2AR抗体（美国GeneTex公司，货号：GTX37799）；γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）抗体（货号：AFRM81685）、双标三色多重荧光染色试剂盒（货号：AFIHC023）均购自湖南艾方生物科技有限公司；GABA含量检测试剂盒（北京盒子生工科技有限公司，货号：AKAM023C）；一次性无菌毫针（苏州医疗用品有限公司，规格：0.25 mm×13 mm）。

1.3 实验仪器

离心机（德国Eppendorf公司，型号：5430R，转子型号：FA-45-30-R）；化学发光成像系统（美国Bio-Rad公司，型号：ChemiDoc XRS⁺ System）；SPARK酶标仪（瑞士TECAN公司）。

2 实验方法

2.1 分组与造模

SD大鼠经适应性喂养1周后，采用随机数字表法分为对照组、模型组、腕踝针组、腕踝针＋激动剂组和拮抗剂组，每组10只。模型组、腕踝针组、腕踝针＋激动剂组、拮抗剂组均按10 mL/kg腹腔注射1%乙酸溶液，当大鼠出现腹部内凹、躯干与后肢伸展、臀部高起，且乙酸注射10 min后出现身体伸长、腹部肌肉明显收缩、后肢过度伸展等扭体反应，提示急性内脏痛模型制备成功。对照组按10 mL/kg腹腔注射0.9%氯化钠溶液。

2.2 干预

模型制备成功后，参照《实用腕踝针疗法》^［6］，结合临床治疗方法^［7］，腕踝针组与腕踝针＋激动剂组采用一次性无菌毫针以15°平刺入双侧踝部“下1”“下2”区，刺入深度为1.5 mm，留针6 h，每日1次，共针刺7次^［8］；腕踝针＋激动剂组于第3、5、7天分别按1 mg/kg鞘内注射5-HT_2AR激动剂DOI hydrochloride；拮抗剂组于第3、5、7天分别按1 mg/kg鞘内注射5-HT_2AR拮抗剂酮色林^［9-10］；对照组和模型组仅对大鼠进行常规抓取和固定处理，不施加任何干预措施。

2.3 行为学检测

5组大鼠干预后，观察最后1次取针后1 h内扭体次数并记录。扭体反应判定：当大鼠出现转头动作，伴腹部内凹收缩、身体与躯干拉长、后肢伸张的协同动作时，记为1次有效的扭体反应^［11］。

2.4 取材

各组大鼠处死后，一部分大鼠快速分离脊髓并精准截取L₄～L₆节段，在冰浴条件下小心剥离脊髓背角组织，并置于预冷的无菌PBS缓冲液中漂洗2～3次，去除表面残留血液及周围结缔组织，用无菌滤纸吸干组织表面液体，迅速置于液氮中速冻5～10 min，随后转移至-80 ℃超低温冰箱中保存，用于后续的Western blot和ELISA实验。另一部分大鼠进行4%多聚甲醛心脏灌注固定，剥离脊髓并精准截取L₄～L₆节段，放入预冷的4%多聚甲醛固定液中冰浴下漂洗1次，去除表面残留灌注液及杂质，随后转移至新的4 ℃多聚甲醛固定液中续固定24 h，用于后续的免疫荧光实验。

2.5 Western blot检测脊髓背角5-HT_2AR蛋白表达量

取L₄～L₆脊髓背角加入含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液冰浴研磨，4 ℃下12 000 r/min离心30 min，取上清，BCA法定量后调整蛋白浓度，经变性、电泳和转膜后，5%脱脂奶粉封闭2 h。清洗后置于5-HT_2AR抗体（1∶1 000）中4 ℃孵育过夜。TBST溶液清洗，置于荧光二抗（1∶5 000）中室温孵育1.5 h。清洗后加入ECL试剂显影，ImageJ分析5-HT_2AR与GAPDH灰度值比值。

2.6 ELISA检测脊髓背角GABA含量

取L₄～L₆脊髓背角组织，按照GABA含量检测试剂盒说明书进行操作，应用酶标仪在640 nm波长下测量吸光度值，并计算GABA含量。

2.7 免疫荧光法检测脊髓背角5-HT_2AR、GABA含量

取出固定后的脊髓背角，经70%、80%、90%、95%、100%乙醇梯度脱水和透明处理，浸蜡包埋。使用石蜡切片机制作5 μm厚的脊髓背角横切片，贴于载玻片备用。脱蜡后，切片经PBS洗涤、0.3% Triton X-100孵育增加膜通透性，再经PBS洗涤后用5% BSA封闭1 h。弃封闭液后滴加5-HT_2AR（1∶500）、GABA（1∶500）一抗混合液于4 ℃湿盒孵育过夜，次日PBS洗涤后直接滴加Polymer-HRP二抗，室温避光孵育30 min。再次PBS溶液洗涤后，切片直接滴加TSA-520/570荧光染料均匀覆盖组织，室温孵育5 min，PBS溶液洗涤后，用DAPI染液复染细胞核，最后用抗荧光淬灭封片剂封片，在荧光显微镜下，以相同参数采集图像。图像采集完成后，采用ImageJ软件中的JACoP插件进行定量分析，计算脊髓背角区域5-HT_2AR（红色荧光）与GABA（绿色荧光）信号的皮尔森相关系数，以反映二者的共定位相关性。

2.8 统计学方法

采用SPSS 23.0软件进行数据分析。计量资料符合正态分布以（\overline{x}±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，若方差齐，两两比较采用LSD-t检验；若方差不齐则采用秩和检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结　果

3.1 5组扭体次数比较

与对照组比较，模型组扭体次数明显增加（P＜0.05）；与模型组比较，腕踝针组和拮抗剂组扭体次数均明显减少（P＜0.05）；与腕踝针组比较，腕踝针＋激动剂组的扭体次数明显增加（P＜0.05），拮抗剂组扭体次数差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

3.2 5组脊髓背角5-HT_2AR蛋白表达量比较

对照组比较，模型组脊髓背角5-HT_2AR蛋白表达量明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，腕踝针组和拮抗剂组脊髓背角5-HT_2AR蛋白表达量均明显降低（P＜0.05）；与腕踝针组比较，腕踝针＋激动剂组脊髓背角5-HT_2AR蛋白表达量明显升高（P＜0.05），拮抗剂组脊髓背角5-HT_2AR蛋白表达量差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1、表2。

3.3 5组脊髓背角GABA含量比较

与对照组比较，模型组脊髓背角GABA含量明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，腕踝针组、拮抗剂组脊髓背角GABA含量均明显升高（P＜0.05）；与腕踝针组比较，腕踝针＋激动剂组脊髓背角GABA含量明显降低（P＜0.05），拮抗剂组GABA含量差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

3.4 5组脊髓背角5-HT_2AR、GABA皮尔森相关系数比较

与对照组比较，模型组脊髓背角5-HT_2AR、GABA皮尔森相关系数明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，腕踝针和拮抗剂组脊髓背角5-HT_2AR、GABA皮尔森相关系数均明显升高（P＜0.05）；与腕踝针组比较，腕踝针＋激动剂组脊髓背角5-HT_2AR、GABA皮尔森相关系数明显降低（P＜0.05），拮抗剂组脊髓背角5-HT_2AR、GABA皮尔森相关系数差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2、表4。

4 讨　论

急性内脏痛归属于中医学“腹痛”“胃痛”等范畴，《灵枢·邪气脏腑病形》明确记载：“大肠病者，肠中切痛而鸣濯濯”“胃病者，腹䐜胀，胃脘当心而痛”，揭示了古代医家已认识到内脏疾病与疼痛之间的密切联系。腕踝针是一种基于中医经络学说中十二皮部理论发展而来的特色针灸疗法，通过皮下浅刺腕部、踝部特定区域来调节经络气血和调和脏腑功能，其镇痛机制与经络系统“通调表里、运行气血”的核心功能高度契合^［12］。该疗法因操作简便、无痛留针、安全性高等优势，在临床疼痛性疾病治疗中应用广泛，疗效确切^［13-14］，尤其在治疗胃肠道疾病方面展现出独特优势^［15-16］。腕踝针不仅在腹腔镜胆囊切除术后引起的内脏痛中具有良好疗效^［4］，还能快速缓解急性结石性肾绞痛引起的疼痛，具有即时镇痛作用^［17-18］。

腕踝针采用皮下浅刺方式，不强调酸、麻、重、胀的得气感，可在无痛状态下长时间留针，从而延长针刺效应的持续时间。其刺入点多位于十二经脉“标本”理论中的“本”部及“五输穴”范围内，治疗效应与特定腧穴的主治规律一致^［19］ 。本研究选取双侧腕踝针“下1”“下2”区，分别位于足少阴、足厥阴循行路线，依据“经脉所过，主治所及”原则，上述区域可覆盖肝、胃、脐周、胆囊等多部位内脏痛的主治范围^［7］，这也是腕踝针能够缓解急性内脏痛的重要理论基础。

研究表明，脊髓背角是痛觉信号传递与整合的关键中枢，5-HT及相关受体系统在脊髓痛觉调控中发挥核心效应^［20-21］。其中，5-HT_2AR广泛表达于脊髓背角神经元膜表面，通过激活蛋白激酶信号通路促进递质释放，增强痛觉信号传导^［22］。焦海霞等^［23］研究表明：鞘内注射5-HT_2AR拮抗剂可有效缓解大鼠慢性内脏痛痛觉敏化反应。本研究进一步发现：乙酸诱导的急性内脏痛大鼠模型脊髓背角5-HT_2AR蛋白表达及免疫荧光信号明显上调，伴随大鼠扭体次数显著增加，提示5-HT_2AR可能是急性内脏痛发生的关键分子，而腕踝针干预“下1”“下2”区后，上述行为学及5-HT_2AR蛋白表达水平指标均明显改善。值得关注的是，腕踝针组与拮抗剂组在扭体次数、脊髓背角5-HT_2AR蛋白表达及GABA含量上比较，差异无统计学意义，提示5-HT_2AR拮抗剂的核心作用是特异性阻断5-HT_2AR信号传导，而腕踝针镇痛效应源于对脊髓背角5-HT_2AR表达的抑制，与既往同类研究结论一致^［9］。结合腕踝针＋激动剂组扭体次数、脊髓背角5-HT_2AR蛋白表达及GABA含量的结果，直接佐证了5-HT_2AR是腕踝针治疗急性内脏痛的关键靶点，明确了腕踝针发挥镇痛作用的核心分子环节。因此，腕踝针可能通过抑制脊髓背角5-HT_2AR的表达，从而缓解乙酸所致的急性内脏痛。

脊髓背角的痛觉调控依赖兴奋性与抑制性神经递质的平衡，GABA作为中枢神经系统主要的抑制性神经递质，通过激活GABAA/GABAB受体抑制痛觉神经元放电，是痛觉抑制通路的核心分子^［24-25］。已有研究证实：激活5-HT_2AR可通过抑制GABA能神经元的活性，使疼痛信号传递“去抑制”增强，致疼痛加重^［26］。本研究发现，急性内脏痛模型大鼠脊髓背角GABA含量降低，经腕踝针治疗或鞘内注射5-HT_2AR拮抗剂后，GABA含量明显增多，且腕踝针＋激动剂组GABA含量明显减少，表明腕踝针可能通过抑制脊髓背角5-HT_2AR来促进GABA表达，缓解急性内脏痛。上述研究结果与针刺镇痛的机制相呼应，有研究证实电针可能通过上调疼痛大鼠背根神经节GABA含量来缓解切口痛^［27］，针刺还可能通过激活vlPAG区GABA能神经元改善肠易激综合征小鼠内脏痛^［28］，而本研究进一步明确了5-HT_2AR在腕踝针调控GABA通路中的关键介导作用。

综上所述，本研究证实腕踝针刺激踝部“下1”“下2”区可通过抑制脊髓背角5-HT_2AR表达，上调脊髓背角GABA含量，从而发挥急性内脏痛镇痛效应。其中，腕踝针组与拮抗剂组的效应一致性，为5-HT_2AR作为针刺镇痛关键靶点提供了直接证据，未来需进一步探索5-HT_2AR上游调控机制及临床转化应用，为腕踝针精准化、个体化治疗提供更全面的理论支撑。

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基金资助

福建省卫健委科技计划项目(2023QNA079)

福建中医药大学康复学科开放课题(KF2022004)