电针犊鼻、内膝眼穴对膝骨关节炎大鼠软骨组织退变和自噬水平的影响

摘要

目的 观察电针犊鼻、内膝眼穴对膝骨关节炎（KOA）大鼠软骨组织退变和自噬水平的影响。 方法 取3月龄SPF级雄性SD大鼠36只，采用随机数字表法分为假手术组、模型组、电针组、电针＋激活剂组、电针＋抑制剂组和非穴位对照组，每组6只。除假手术组外，其余各组采用前交叉韧带切断术（ACLT）制备KOA动物模型。造模8周后，电针组予犊鼻、内膝眼穴电针治疗，30 min/次，1次/d，5 d/周，连续干预12周；电针＋激活剂组、电针＋抑制剂组在电针组干预基础上分别联合关节腔注射10 μmol/L自噬激活剂雷帕霉素和5 mmol/L自噬抑制剂3-MA各50 μL，1次/周，连续注射12周；非穴位对照组在犊鼻、内膝眼穴位旁开5 mm的非穴位处行电针治疗，操作和疗程同电针组；假手术组和模型组不做干预。干预完成后，采用苏木素-伊红（HE）染色及甲苯胺蓝染色观察软骨组织退变情况，qPCR法检测软骨组织基质金属蛋白酶-13（MMP-13） mRNA相对表达水平，Western blot检测软骨组织Beclin1、自噬相关蛋白5（Atg5）、微管相关蛋白1轻链3（LC3）及MMP-13蛋白表达量。 结果 模型组大鼠软骨组织发生明显退变，电针组和电针＋激活剂组软骨组织退变程度较模型组明显减轻，电针＋抑制剂组和非穴位对照组软骨组织退变程度改善不明显。与假手术组比较，模型组MMP-13 mRNA相对表达水平和蛋白表达均升高（P＜0.05），Beclin1、Atg5蛋白表达均降低（P＜0.05）。与模型组比较，电针组MMP-13 mRNA相对表达水平和蛋白表达均降低（P＜0.05），Beclin1、Atg5蛋白表达及LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ均升高（P＜0.05）。与电针组比较，电针＋激活剂组MMP-13 mRNA相对表达水平和蛋白表达均降低（P＜0.05），Beclin1、Atg5蛋白表达及LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ均升高（P＜0.05）；电针＋抑制剂组MMP-13 mRNA相对表达水平和蛋白表达均升高（P＜0.05），Beclin1、Atg5蛋白表达及LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ均降低（P＜0.05）；非穴位对照组MMP-13 mRNA相对表达水平和蛋白表达均升高（P＜0.05），Beclin1、Atg5蛋白表达及LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ均降低（P＜0.05）。 结论 电针犊鼻、内膝眼穴可延缓KOA模型大鼠软骨组织退变，抑制MMP-13表达，促进自噬相关蛋白表达，提高自噬水平。

Graphical abstract

关键词

膝骨关节炎 / 电针 / 犊鼻穴 / 内膝眼穴 / 自噬 / 基质金属蛋白酶-13

±

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骨关节炎（osteoarthritis，OA）是中老年人常见的慢性退行性骨关节病之一，具有较高的致残率，严重影响中老年人的生活质量和健康^［1-2］。软骨细胞肥大、细胞外基质（ECM）降解、软骨下骨骨重建失衡是OA的主要病理变化，而自噬在维持软骨组织和软骨细胞稳态中发挥重要作用，是OA治疗的潜在靶点^［3-5］。研究表明，通过上调Beclin1表达，激活软骨细胞自噬，能降低基质金属蛋白酶-13（MMP-13）表达，抑制ECM降解，从而保护关节软骨^［6］。

犊鼻穴和内膝眼穴是治疗膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）使用频次最高的一组穴位^［7-8］，电针犊鼻、内膝眼穴可疏通局部经络气血，达到行气活血、通络止痛的功效。基础研究显示，电针可以促进软骨细胞增殖^［9］，抑制MMP-13表达和ECM降解^［10-11］，促进关节软骨修复^［12］。本研究通过观察电针犊鼻、内膝眼穴对前交叉韧带切断（ACLT）模型大鼠膝关节软骨组织退变和自噬水平的影响，探讨电针犊鼻、内膝眼穴治疗KOA的机制。

1 实验材料

1.1 实验动物

3月龄SPF级雄性SD大鼠36只，体质量（250±20）g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0010。实验大鼠饲养于福建安布瑞生物实验动物中心，实验动物使用许可证号：SYXK（闽）2022-0002。本研究方案已通过福建安布瑞生物实验动物伦理委员会批准（审批号：IACUC FJABR 2022 093001）。

1.2 主要试剂

异氟烷（山东安特牧业科技有限公司，货号：20221004）；3-MA（货号：A8353）、雷帕霉素（货号：A8167）均购自上海伟寰生物科技有限公司；苏木素染液（货号：7211）、伊红染色液（货号：7111）均购自艾普迪实验器材制造（上海）有限公司；甲苯胺蓝染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号：G2543）；RNAiso Plus（日本TaKaRa公司，货号：9109）；NovoScript^® Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix（货号：E047-01A）、NovoStart^® SYBR qPCR SuperMix Plus（货号：E096-01B）均购自苏州近岸蛋白质科技股份有限公司；RIPA强裂解液（货号：MA0151）、BCA蛋白定量试剂盒（货号：MA0082-2）、ECL显色试剂盒（货号：MA0186-1）均购自大连美仑生物技术有限公司；β-actin抗体（货号：66009-1-Ig）、微管相关蛋白1轻链3（LC3）抗体（货号：14600-1-AP）、Beclin1抗体（货号：66665-1-Ig）、MMP-13抗体（货号：18165-1-AP）、自噬相关蛋白5（Atg5）抗体（货号：10181-2-AP）、HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG（H＋L）（货号：SA00001-1）、HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG（H＋L）（货号：SA00001-2）均购自武汉三鹰生物技术有限公司。

1.3 主要仪器

无菌针灸针（无锡佳健医疗器械股份有限公司，规格：0.25 mm×15 mm）；电子针疗仪（苏州医疗用品厂有限公司，型号：SDZ-V）；自动组织脱水机（湖北孝感阔海医疗科技有限公司，型号：KH-TS）；荧光定量PCR仪（美国Applied Biosystems公司，型号：7300）、PCR仪（美国Bio-Rad公司，型号：PTC100）、超微量紫外可见光分光光度计（北京百泰克生物技术有限公司，型号：ND5000）；低温高速离心机（美国Beckman Coulter公司，型号：Microfuge-22R）；酶标仪（美国Thermo Fisher公司，型号：K3）。

2 方　法

2.1 分组及造模

36只雄性SD大鼠适应性饲养1周后，随机分为假手术组、模型组、电针组、电针＋激活剂组、电针＋抑制剂组和非穴位对照组，每组6只。除假手术组外，其余各组均采用ACLT法制备KOA动物模型^［13］。大鼠用3%异氟烷气体麻醉后，常规备皮、碘伏消毒、铺巾，行左膝前正中切口，切开皮肤和皮下组织，找到白色髌腱，沿其内侧切开关节束，过伸后屈曲大鼠膝关节找到前交叉韧带，用眼科剪剪断，恢复其正常伸直位，之后进行髌骨复位，逐层缝合关节囊、皮下组织和皮肤，包扎伤口。术后进行抽屉试验，验证前交叉韧带断裂。假手术组大鼠暴露关节腔后缝合，不对前交叉韧带做任何处理。

2.2 干预方法

ACLT术后8周开始干预。电针组取术侧犊鼻穴和内膝眼穴，一次性无菌针灸针针刺0.2~0.3寸，针柄接上电子针疗仪，选择疏密波，疏波频率20 Hz，密波频率100 Hz，强度以局部肌肉轻微收缩为度（0.7~1.0 mA），30 min/次，1次/d，5 d/周，连续干预12周。电针＋激活剂组行电针治疗（操作和疗程同电针组）的同时，加用自噬激活剂雷帕霉素（10 μmol/L）干预，用异氟烷麻醉大鼠，切开术侧膝关节皮肤约0.1 cm切口，暴露关节囊，采用胰岛素微量注射器沿髌韧带水平方向插入0.1 cm，针尖稍向内（避免划伤软骨），缓慢注射药物50 μL，用无菌敷料按压针眼约2 min，以防止药物外渗^［14-15］，1次/周，连续注射12周。电针＋抑制剂组行电针治疗的同时，加用自噬抑制剂3-MA（5 mmol/L）干预，电针操作和疗程、3-MA注射方法和剂量同电针＋激活剂组。非穴位对照组针刺位置为犊鼻穴和内膝眼穴各旁开5 mm的非穴位处，操作和疗程同电针组。假手术组和模型组不做干预。

2.3 标本采集

大鼠干预完成后进行CO₂安乐死。用咬骨钳剪断左膝关节关节腔上下方的骨头获得完整的膝关节组织，一部分剔除多余肌肉组织后置于4%多聚甲醛固定48 h，用于病理染色；一部分刮取软骨组织，保存于-80 ℃低温冰箱。

2.4 观察指标

2.4.1 软骨组织退变情况

采用苏木素-伊红（HE）染色及甲苯胺蓝染色观察大鼠膝关节软骨组织退变情况。HE染色方法：膝关节组织固定后充分脱钙，常规石蜡包埋、切片、脱蜡、水合后，采用苏木素染液染色5 min，伊红染液染色15 s，快速脱色、脱水，二甲苯透明，通风晾干后用中性树胶封片。甲苯胺蓝染色方法：软骨组织包埋块切片、脱蜡、至水后，采用甲苯胺蓝染色30 min，流水冲洗后脱水，二甲苯透明，通风晾干后用中性树胶封片。倒置光学显微镜下观察软骨组织退变情况，并采集图像。

2.4.2 qPCR检测软骨组织MMP-13 mRNA相对表达水平

软骨组织加入液氮后研磨成粉末状，加入TRIzol试剂提取总RNA，检测浓度后根据逆转录试剂盒说明书配制反应液，逆转录合成cDNA。根据荧光定量试剂盒说明书配制反应液，扩增条件：95 ℃预变性1 min；循环扩增，95 ℃变性20 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸38 s，循环40次；熔解曲线，60 ℃复性1 min，95 ℃变性15 s，以缓慢速率（约0.1~0.5 ℃/s）从60 ℃升至95 ℃。以GAPDH为内参基因，使用2^-ΔΔCT方法计算MMP-13相对表达水平。本研究所用引物委托福州尚亚生物公司合成，引物序列见表1。

2.4.3 Western blot检测软骨组织自噬相关蛋白及MMP-13蛋白表达量

软骨组织加入液氮后研磨成粉末状，加入RIPA裂解液裂解，4 ℃下12 000 r/min离心20 min，取上清。BCA法测总蛋白浓度，变性后加样进行SDS-PAGE电泳、转膜，用5%脱脂奶粉常温封闭2 h，加入β-actin（1∶12 000）、Beclin1（1∶6 000）、MMP-13（1∶4 000）、Atg5（1∶5 000）、LC3（1∶5 000）一抗4 ℃孵育过夜，二抗常温孵育2 h。加入ECL显影液，成像系统显影，ImageJ软件分析条带灰度值，以β-actin为内参进行半定量。

2.5 统计学方法

采用SPSS 23.0软件进行统计分析。计量资料符合正态分布采用（\overline{x}±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，方差齐时选择LSD-t法进行两两比较，方差不齐时选择Tamhane's T2法。P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结　果

3.1 6组软骨组织染色情况比较

HE染色结果显示，假手术组软骨组织表面光滑，各层结构清晰、染色均匀，潮线清晰可见，细胞排列整齐、均匀。模型组软骨组织表面粗糙不整，结构层次不清、染色不均，细胞排列紊乱，可见大量炎细胞浸润。电针组软骨组织表面较平整，结构层次较模型组改善，潮线清晰，软骨细胞分布均匀。电针＋激活剂组软骨组织表面完整光滑，各层染色均匀，潮线清晰可见，软骨细胞分布均匀。电针＋抑制剂组软骨组织表面粗糙，软骨结构不清，染色不均，潮线不清。非穴位对照组软骨组织表面尚平整，软骨层次结构较模型组改善，潮线欠清晰，细胞分布欠整齐。见图1。

甲苯胺蓝染色结果显示，假手术组各层结构清晰，全层呈均匀深染，潮线锐利可辨，软骨细胞镶嵌于饱满基质内，排列规整。模型组软骨层次紊乱，软骨基质染色整体浅淡不均，软骨细胞蓝染范围缩小、聚集成簇，潮线模糊断裂。电针组软骨基质深染区域较模型组增多，潮线较清晰，细胞分布渐趋规整。电针＋激活剂组软骨全层深染，较为均匀，潮线清晰锐利，软骨细胞排列尚整齐。电针＋抑制剂组软骨基质染色浅淡不均，潮线不清，软骨细胞蓝染减少。非穴位对照组软骨各层染色深浅不均，潮线欠清晰，细胞欠整齐。见图2。

3.2 6组软骨组织MMP-13 mRNA相对表达水平比较

见表2。

3.3 6组MMP-13及自噬相关蛋白表达量比较

见图3和表3。

4 讨　论

MMP-13作为介导软骨基质降解的关键酶，是基质金属蛋白酶家族中破坏关节软骨最强的酶，与OA发病非常密切^［16］。MMP-13被激活后可降解胶原蛋白、层粘连蛋白、基底膜糖蛋白等ECM成分，并可通过裂解软骨细胞表面受体，加速软骨退变^［17］。本研究结果显示，电针犊鼻、内膝眼穴可以延缓KOA模型大鼠软骨组织退变，抑制MMP-13转录与蛋白表达。自噬激活剂雷帕霉素可协同电针进一步降低MMP-13表达，而自噬抑制剂3-MA则阻断了电针抑制软骨退变和MMP-13表达的作用，提示软骨细胞自噬的激活可能是电针调控MMP-13的上游靶点。非穴位对照组抑制软骨退变和MMP-13表达的作用远不及电针组，进一步表明了穴位特异性是电针发挥KOA治疗效应的关键前提，单纯的电针物理刺激无法替代穴位的靶向调节作用。犊鼻穴属足阳明胃经，为胃经气血输注于膝关节外侧的特定腧穴；内膝眼穴为经外奇穴，位于膝关节内侧，与犊鼻穴内外对应，共同环绕膝关节腔，是经络气血在膝部汇聚、濡养关节的关键节点^［7-8］。电针刺激该组穴位可疏通膝关节局部经络、调和气血；而非穴位处虽有皮肤、肌肉等组织分布，但并非经络气血的关键输注部位，缺乏与膝关节病理状态的特异性关联。

软骨细胞具有较低的自我更新率，自噬对于软骨细胞维持代谢平衡具有重要意义^［3-5］。Beclin1是自噬体形成的一个必需因子，是自噬通路中的重要调节器^［18］。细胞在内外刺激的诱导下，Beclin1等自噬调控基因启动；Beclin1作为分子反应“平台”，可介导Atg蛋白定位于吞噬泡，并与多种蛋白反应，调控自噬体形成与成熟。已有研究表明，通过调节Beclin1激活自噬，可对ECM产生影响，促进软骨组织修复^［19］。定位于自噬体膜上的LC3，可作为自噬体形成的标记物。LC3一般以可溶性的LC3 Ⅰ形式存在；自噬发生后，在多个Atg蛋白的调控下，LC3 Ⅰ经泛素样加工修饰，转化为脂溶性的活化形式LC3 Ⅱ，LC3 Ⅱ的表达与自噬活性成正比^［20］。本研究结果显示，电针犊鼻、内膝眼穴可以显著提高软骨组织Beclin1、Atg5及LC3 Ⅱ蛋白表达，提示电针对软骨细胞Beclin1-Atg5复合体介导的自噬体形成这一关键环节具有调控作用。针对自噬设置的对照研究发现，电针联合雷帕霉素可以进一步促进自噬相关蛋白表达，增强对软骨组织的保护效应；电针联合3-MA则抑制了自噬相关蛋白表达，逆转电针的治疗效果；提示对自噬水平的调控是电针抑制软骨组织退变的重要环节。

综上所述，电针犊鼻、内膝眼穴可延缓KOA模型大鼠软骨组织退变，抑制MMP-13表达，其机制可能与电针促进自噬相关蛋白表达，提高自噬水平有关。

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基金资助

福建省自然科学基金项目(2021J01894)

福建中医药大学附属人民医院国家自然科学基金基础提升计划专项(JCZX202406)

福建省中医药重点学科建设项目(闽卫中医函〔2024〕363号)