八宝丹抑制大肠癌细胞增殖与干性及Akt信号通路活化

Inhibitory Effect of Babao Dan on Proliferation, Stemness, and Akt Signaling Pathway Activation in Colorectal Cancer Cells

摘要

目的 探讨八宝丹对大肠癌细胞增殖及干性的影响，以及对Akt信号通路的调控作用。 方法 将SW480细胞分为0、0.25、0.5、0.75 mg/mL组，分别用0、0.25、0.5、0.75 mg/mL八宝丹溶液干预24 h。倒置显微镜下观察4组细胞形态，并采用台盼蓝染色法计算细胞存活率；流式细胞术检测侧群细胞比例；克隆球形成实验观察克隆球数量；Western blot检测SRY相关HMG盒转录因子2（SOX2）、蛋白激酶B（Akt）和p-Akt蛋白表达量。 结果 与0 mg/mL组比较，0.25、0.5、0.75 mg/mL组细胞存活率、侧群细胞比例均明显降低（P＜0.05），克隆球数量均明显减少（P＜0.05），SOX2蛋白表达量和p-Akt/Akt均明显降低（P＜0.05）；同时八宝丹浓度与细胞存活率呈显著负相关（r＝-0.997，P＝0.003），与侧群细胞比例呈负相关（r＝-0.932，P＝0.068），与克隆球数量呈显著负相关（r＝-0.989，P＝0.011），与SOX2蛋白表达量呈显著负相关（r＝-0.991，P＝0.010），与p-Akt/Akt呈负相关（r＝-0.941，P＝0.059）。 结论 八宝丹可抑制大肠癌细胞的增殖、干性以及Akt信号通路的活化。

Abstract

Objective To investigate the effect of Babao Dan on the proliferation and stemness of colorectal cancer cells and its regulatory role on the Akt signaling pathway. Methods SW480 cells were divided into 0, 0.25, 0.5, and 0.75 mg/mL groups and intervened with 0, 0.25, 0.5, and 0.75 mg/mL Babao Dan solution for 24 hours, respectively. Cell morphology was observed under the inverted microscope, and the cell survival rate was determined by trypan blue staining. The proportion of side population cells was analyzed by flow cytometry. The number of colony formation was assessed using the colony formation assay. The protein expression of SRY-box transcription factor 2 (SOX2), protein kinase B (Akt), and p-Akt were detected by Western blot. Results Compared with the 0 mg/mL group, the 0.25, 0.5, and 0.75 mg/mL groups showed a significant decrease in cell survival rate, proportion of side population cells, the number of colony formation, the protein expression of SOX2, and the p-Akt/Akt ratio (P<0.05). Furthermore, the concentration of Babao Dan was significantly negatively correlated with the cell survival rate (r=-0.997, P=0.003), the proportion of side population cells (r=-0.932, P=0.068), the number of colony formation (r=-0.989, P=0.011), the protein expression of SOX2 (r=-0.991, P=0.010), and the p-Akt/Akt ratio (r=-0.941, P=0.059). Conclusion Babao Dan can inhibit the proliferation, stemness, and Akt signaling pathway activation in colorectal cancer cells.

Graphical abstract

关键词

大肠癌 / 八宝丹 / 增殖 / 干性 / Akt信号通路

Key words

Colorectal cancer / Babao Dan / proliferation / stemness / Akt signaling pathway

大肠癌又称为结直肠癌，是常见消化系统恶性肿瘤之一。大肠癌的病死率和发病率分别处于全球癌症的第二位和第三位^［1］，严重危害人类健康。目前，大肠癌的早期治疗以手术为主，中、晚期治疗以放、化疗为主，在取得一定疗效的同时，仍存在骨髓抑制、严重胃肠道反应及外周神经毒性等毒副作用^［2］，亟待寻找毒副作用更低、更有效的治疗手段。肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）具有无限增殖和自我更新的特性，可驱动细胞增殖并分化形成恶性肿瘤，是导致大肠癌发生、发展的重要原因^［3-4］。因此，针对CSC的研究对防治大肠癌具有重大意义。研究发现Akt信号通路激活不仅可以促进大肠癌细胞增殖，同时可促进大肠癌干细胞的生长和成球能力^［5］。因此，抑制Akt信号通路的活化，进而抑制大肠癌干细胞的增殖及干性，是药物发挥抑制大肠癌发生、发展作用的重要方式之一。

八宝丹是国家中药保护品种，由三七、珍珠、天然麝香、蛇胆、天然牛黄、羚羊角等多种名贵中药材组成，具有清热利湿、祛黄止痛、活血化瘀等功效。中医学对癌症病机的认识复杂多元，湿热蕴毒为其核心病机之一，故治疗以清热解毒为主，这与八宝丹的功效相符。前期基础研究显示，八宝丹可通过抑制癌细胞的生长、增殖、转移以及诱导癌细胞凋亡等方式，发挥抑制胃癌、肝癌、肺腺癌的作用^［6-10］，然而，八宝丹是否对大肠癌及其干细胞具有类似的抑制作用，以及其具体分子机制有待进一步研究。因此，本研究探讨八宝丹对大肠癌细胞及干细胞的干预作用及其可能作用机制。

1 实验材料

1.1 实验细胞

人大肠癌细胞系SW480购自上海中科院细胞库。

1.2 实验药物

八宝丹（批号：180901）由厦门中药厂提供。将八宝丹研磨成药粉，溶解于灭菌后的纯水中，配制成浓度为25 mg/mL的八宝丹母液，分装于1.5 mL离心管中，并保存于-20 ℃冰箱。

1.3 实验试剂

L-15不完全培养液（江苏凯基生物技术股份有限公司，货号：KGM1300）；胎牛血清（货号：10091-148）、Pierce™ BCA蛋白定量检测试剂盒（货号：23227）、0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液（货号：25200-072）、Hoechst 33342细胞核染料（货号：H3570）均购自美国Thermo Fisher Scientific公司；青霉素-链霉素溶液（上海格来赛生命科技有限公司，货号：SV30010）；盐酸维拉帕米（美国Sigma-Aldrich公司，货号：V4629）；磷酸酶抑制剂（瑞士Roche公司，货号：4906837001）；细胞裂解液（上海碧云天生物技术有限公司，货号：P0013）；β-actin抗体（美国Abbkine公司，货号：A01010）；蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）抗体（货号：4691）、p-Akt（Ser473）抗体（货号：4060）、SRY相关HMG盒转录因子2（SRY-box transcription factor 2，SOX2）抗体（货号：23064）均购自美国CST公司；台盼蓝染色液（北京索莱宝科技有限公司，货号：C0040-50）。

1.4 实验仪器

细胞计数仪（上海睿钰生物科技有限公司，型号：IC1000）；流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司，型号：MoFlo XDP）；倒置显微镜（德国Leica公司，型号：DMIL LED）；酶标仪（上海赛默飞世尔仪器有限公司，型号：357-911802）；超高灵敏化学发光成像系统（美国Bio-Rad公司，型号：734BR4832）；医用低温保存箱（青岛海尔特种电器有限公司，型号：DW-86L626）；高速冷冻离心机（上海力申科学仪器有限公司，型号：Neo 13R）。

2 实验方法

2.1 分组和干预

将SW480细胞分为0、0.25、0.5、0.75 mg/mL组，分别用0、0.25、0.5、0.75 mg/mL八宝丹溶液干预24 h。

2.2 细胞形态观察

于倒置显微镜下观察干预后SW480细胞的形态，并进行图像采集。

2.3 台盼蓝染色法计算细胞存活率

将干预后的细胞消化、离心后，弃上清，加入新鲜培养基重悬，取出10 μL悬液与10 μL台盼蓝混匀，分别移入细胞计数板中，测量视野上、中、下位置，记录数据并计算细胞存活率。

2.4 流式细胞术检测侧群细胞比例

干预后的细胞经消化、离心收集后，用L-15完全培养液重悬，制备成密度为1.5×10⁶个/mL的单细胞悬液。每组取适量悬液，加入5 μg/mL Hoechst33342细胞核染料，其中0 mg/mL组分出一半样本，额外加入50 μmol/L维拉帕米作为阳性对照组（用于确认侧群特异性并辅助设门），于37 ℃避光水浴90 min。染色后，用预冷PBS溶液洗涤，加入含2% 胎牛血清的PBS溶液重悬细胞，并放置于冰上。随后使用流式细胞仪进行分析，以阳性对照组中抑制的细胞群为参照，在4组散点图左下角圈定侧群细胞，即为大肠癌干细胞，由仪器软件自动计算其比例。

2.5 克隆球形成实验观察克隆球数量

干预后的细胞经消化后收集细胞，按1×10³个/mL的密度接种于低黏附6孔板中，使用干细胞专用培养液进行常规培养。培养期间每3 d每孔补充1 mL干细胞专用培养液。10 d后置于倒置显微镜下观察和采集图像，并进行克隆球计数。

2.6 Western blot检测SOX2、p-Akt和Akt蛋白表达量

干预后弃去上清，用PBS溶液清洗2次，随后加入细胞裂解液于冰上裂解30 min提取总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。经SDS-PAGE电泳分离，将蛋白转至PVDF膜，封闭液封闭2 h。TBST溶液清洗3次后，置于SOX2（1∶1 000）、p-Akt（1∶1 000）、Akt（1∶1 000）一抗中4 ℃孵育过夜。TBST清洗后，加入相应种属HRP标记的二抗（1∶5 000），室温孵育2 h，采用ECL化学发光法在凝胶成像仪上进行显影检测。

2.7 统计学方法

采用SPSS 27.0软件进行数据分析。计量资料符合正态分布以（\overline{x}±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，若方差齐，两两比较采用LSD-t检验；若方差不齐，采用Wilcoxon秩和检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。此外，若方差齐，采用Pearson相关分析明确两者间是否存在浓度依赖性的剂量-效应关系；若方差不齐，采用Spearman秩相关分析。

3 结　果

3.1 4组细胞存活情况比较

与0 mg/mL组比较，0.25、0.5、0.75 mg/mL组细胞间空隙逐渐变大，细胞密度逐渐下降，细胞存活率均明显降低（P＜0.05）。同时，经Pearson相关分析，八宝丹浓度与大肠癌细胞存活率呈显著负相关（r＝-0.997，P＝0.003）。见图1、图2。

3.2 4组侧群细胞比例比较

阳性对照组维拉帕米有效阻断了Hoechst33342染料的外排，其侧群细胞比例为0.06%，并据此设定了统一的分析门。与0 mg/mL组比较，0.25、0.5、0.75 mg/mL组侧群细胞比例均明显降低（P＜0.05）。同时，经Pearson相关分析，八宝丹浓度与侧群细胞比例呈负相关（r＝-0.932，P＝0.068）。见图3、图4。

3.3 4组克隆球形成能力比较

0 mg/mL组克隆球密集，与0 mg/mL组比较，0.25、0.5、0.75 mg/mL组克隆球数量均明显减少（P＜0.05）；同时，经Pearson相关性分析，八宝丹浓度与克隆球数量呈显著负相关（r＝-0.989，P＝0.011）。见图5、图6。

3.4 4组SOX2蛋白表达量和p-Akt/Akt比较

与0 mg/mL组比较，0.25、0.5、0.75 mg/mL组SOX2蛋白表达量和p-Akt/Akt均明显降低（P＜0.05）；同时，经Pearson相关分析，八宝丹浓度与SOX2蛋白表达量呈显著负相关（r＝-0.991，P＝0.010），与p-Akt/Akt呈负相关（r＝-0.941，P＝0.059）。见图7、图8。

4 讨　论

肿瘤干细胞的存在是肿瘤发生、发展、复发及转移的主要原因^［11］。在常规治疗之后，肿瘤干细胞因具有化疗抵抗能力，可逃避化疗药物的杀伤作用，残存的CSC通过自我更新、分化，导致肿瘤复发，甚至转移^［11］。因此，以CSC为靶向对象是防治大肠癌的有效措施之一。

八宝丹是国家保密配方，起源于明代，距今已有400多年的历史，其包含皂苷类、胆汁酸类、氨基酸、大分子环酮类等成分，具有提高机体免疫力、抑制多种恶性肿瘤及化疗增效等作用^［12-13］，但对大肠癌细胞及其干细胞的干预效果及其作用机制尚未完全阐明。本研究台盼蓝染色结果发现，八宝丹可显著降低SW480细胞存活率，直接证明其对大肠癌细胞增殖的抑制作用。此外，八宝丹可以显著降低大肠癌干细胞比例，并削弱其自我更新能力。

研究表明，Akt信号通路不仅具有调控大肠癌细胞生长的作用^［14］，并且对大肠癌干细胞的自我更新、定向分化等干性特征具有重要的调节作用^［5］。当Akt被磷酸化活化后，可进一步激活下游增殖细胞核抗原（PCNA）和细胞髓细胞瘤病癌基因（c-Myc）等与细胞增殖相关的蛋白，以及SOX2和同源盒转录因子Nanog等与细胞干性相关的转录因子，最终促进肿瘤增殖和干性维持^［15］。其中，SOX2是维持肿瘤细胞干性，如诱导CSC自我更新及致瘤性的重要调节基因^［16］。本研究结果显示：经八宝丹干预后，大肠癌细胞中SOX2的表达明显下调，且p-Akt/Akt也被抑制。结合已有研究报道癌细胞维持干性特征高度依赖Akt通路，以及本研究中八宝丹对Akt活化的抑制程度，与八宝丹干预降低干细胞比例、克隆球形成能力、SOX2表达等癌干性核心指标的趋势完全一致，可初步推测八宝丹-Akt信号通路-癌干性特征之间的潜在调控关联，具体的调控机制有待后续深入研究。

综上所述，八宝丹兼具抑制大肠癌细胞增殖与削弱大肠癌干细胞干性的双重作用，且抑制Akt信号通路活化可能是其发挥上述作用的重要机制之一。

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基金资助

福建中医药大学“国家自然科学基金面上项目培育专项”(X2023016)