白茶通过抑制氧化应激-炎症级联反应保护阿霉素诱导的斑马鱼心肌损伤

摘要

目的 探讨白茶（WTE）通过抑制氧化应激-炎症级联反应保护阿霉素（Dox）诱导的斑马鱼心肌损伤。 方法 分别用不同浓度的WTE干预斑马鱼12、24 h，通过斑马鱼心率、出膜率以及存活率筛选出WTE的最佳干预浓度为0.025、0.05、0.1 mg/mL。待野生型AB系斑马鱼胚胎生长至12 hpf时，分为对照组、Dox组、WTE低浓度组、WTE中浓度组和WTE高浓度组。WTE低、中、高浓度组分别用0.025、0.05、0.1 mg/mL WTE干预12 h，对照组和Dox组使用斑马鱼培养水进行培养；干预结束后，Dox组和WTE低、中、高浓度组用20 μg/mL Dox干预 24 h，对照组使用斑马鱼培养水进行培养。观察5组心包水肿情况，测量心率和计算心包水肿率；采用中性粒细胞特异性表达绿色荧光的转基因Tg（mpx：EGFP）系斑马鱼胚胎进行干预并统计心脏中性粒细胞数量；DCFH-DA荧光探针检测活性氧（ROS）活性；比色法检测丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）含量；qPCR检测核因子相关因子2（nrf2）、溶质载体家族7成员11（slc7a11）、磷脂过氧化氢谷胱甘肽过氧化物酶（gpx4a）、前列腺素内过氧化物合酶2（ptgs2a）、酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（acsl4a）mRNA相对表达水平。 结果 与对照组比较，Dox组心包水肿率、ROS平均荧光强度和MDA含量均明显升高（P＜0.05），心脏中性粒细胞荧光数量明显增加（P＜0.05），心率和SOD含量均明显降低（P＜0.05）；nrf2、slc7a11、gpx4a，acsl4a mRNA相对表达水平均明显降低（P＜0.05），ptgs2a mRNA相对表达水平明显升高（P＜0.05）。与Dox组比较，WTE低、中、高浓度组心包水肿率和ROS平均荧光强度均明显降低（P＜0.05），心脏中性粒细胞荧光数量均明显降低（P＜0.05），心率和SOD含量明显升高（P＜0.05）；WTE低、中浓度组MDA含量均明显降低（P＜0.05）；WTE低浓度组nrf2、slc7a11、gpx4a、acsl4a mRNA相对表达水平均明显升高（P＜0.05），ptgs2a mRNA相对表达水平明显降低（P＜0.05）；WTE中浓度组gpx4a、acsl4a mRNA相对表达水平均明显升高（P＜0.05），ptgs2a mRNA相对表达水平明显降低（P＜0.05）；WTE高浓度组nrf2 mRNA相对表达水平明显升高（P＜0.05）。 结论 WTE通过激活抗氧化应激-炎症级联反应，有效缓解Dox诱导的斑马鱼心肌损伤。

Graphical abstract

关键词

心肌损伤 / 阿霉素 / 心脏毒性 / 白茶 / 氧化应激 / 炎症反应 / 斑马鱼

蒽环类抗肿瘤药阿霉素（doxorubicin，Dox）因疗效确切而被广泛用于乳腺癌、淋巴瘤等多种实体瘤^［1-2］，但其累积剂量引起的心脏毒性限制了其临床应用^［3-4］。目前临床应用右雷佐生可降低Dox诱导的心脏毒性，但其存在骨髓抑制、二次肿瘤等风险^［5］，故临床亟需安全、价廉、易服的替代方案。研究表明：Dox诱导的心肌病（doxorubicin-induced cardiomyopathy，DIC）发病机制包括氧化应激、线粒体破坏和自噬等^［6］。活性氧（reactive oxygen species，ROS）过度产生和心肌细胞凋亡会在Dox诱导的心肌损伤中出现，过量ROS会诱导生物大分子的氧化损伤，并破坏细胞膜的完整性和功能^［7］。此外，Dox诱发的氧化应激可通过外源性和内源性凋亡途径直接引发大量心肌细胞凋亡，并导致严重的心功能障碍^［8］。近年来研究发现DIC与无菌性炎症有关^［9］，Dox可上调心脏组织多种炎症因子水平，而ROS的产生也会激活炎性小体 ^［10］。

白茶通过自然萎凋与干燥加工而成，可最大限度保留甲基化儿茶素、O-没食子酰基化黄烷-3-醇及茶氨酸等独特成分，其抗氧化特性能够清除自由基，并提高抗氧化酶活性，同时抑制脂质过氧化^［11-12］。多项体外实验证明，白茶兼具强效抗氧化的功能，且可药食同源^［13-14］。因此白茶作为天然产物中用于降低蒽环类心脏毒性的候选资源，值得系统深入研究。斑马鱼胚胎透明，其心脏可在24 h发育完成，其编码基因与人类蛋白编码基因同源率达到70%，可高通量、实时观察心功能的变化，是快速筛选心脏保护剂的理想模型。斑马鱼使用符合3R原则的要求^［15］，常常用于评估心脏、神经、肝脏和肾脏等器官的毒性^［16］。因此本研究以“氧化应激-炎症”为主线，利用斑马鱼构建Dox心肌损伤模型，探讨白茶提取物（white tea extract，WTE）对斑马鱼心肌损伤的影响，为临床肿瘤辅助治疗提供新策略。

1 实验材料

1.1 实验动物

600枚野生型AB系和中性粒细胞特异性表达绿色荧光的转基因Tg（mpx：EGFP）系斑马鱼受精后12 h（12 hpf）胚胎，来源于福建医科大学基础医学院斑马鱼实验室。成年斑马鱼饲养于福建医科大学基础医学院斑马鱼实验室，实验动物使用许可证号：SYXK（闽）2022-0003，室温控制的养殖系统中，照明14 h/黑暗10 h，环境温度28 ℃，湿度50%。斑马鱼培养水（0.3×Danieaus' buffer）：20.34 g NaCl、0.313 g KCl、0.592 g MgSO₄·7H₂O、0.850 g Ca（NO₃）₂·4H₂O和7.12 g N-2-羟乙基哌嗪- N'-2-乙磺酸（HEPES）溶解于H₂O，并定容至20 L。斑马鱼发育成熟后（约3个月），即可交配产胚胎，供实验研究。所有实验均符合规范，严格遵循3R原则进行动物饲养和实验操作。

1.2 实验药物

WTE由福建中医药大学药学院李华教授制备提供。WTE溶液配置：将WTE溶解在超纯水中，使其终浓度为50 mg/mL，保存于-20 ℃冰箱中备用。Dox（货号：E2516）购自美国Selleck Chemicals公司，Dox药液配置：将Dox粉末溶解于超纯水中，使其终浓度为3 mg/mL，保存于-20 ℃冰箱中备用。

1.3 实验试剂

逆转录试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司，货号：017E2991IC）；SYBR qPCR Super Plus试剂盒（苏州近岸蛋白质科技股份有限公司，货号：05238502）；ROS检测试剂盒（货号：KGA7308-100）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）测试盒（货号：KGA7101-100）均购自江苏凯基生物技术股份有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，货号：A001-1-2）。

1.4 实验仪器

光照培养箱（中国上海一恒科学仪器有限公司）；荧光体式显微镜（日本Nikon公司）；荧光酶标仪（瑞士Tecan公司）；Real-time PCR仪（美国Bio-Rad公司）。

2 实验方法

2.1 斑马鱼心肌损伤模型建立

随机挑选健康无畸形的24 hpf野生型AB系斑马鱼胚胎至六孔板中，每孔30枚胚胎，根据实验室前期研究确定的Dox造模浓度^［17］，采用20 μg/mL Dox干预斑马鱼胚胎24 h，每12 h换水换药1次。

2.2 WTE安全浓度筛选

待野生型AB系斑马鱼胚胎生长至12 hpf，随机挑选健康且无畸形的胚胎至六孔板中，每孔30枚胚胎。

每孔分别加入0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mg/mL WTE干预12 h，干预完成后换为斑马鱼培养水继续培养，分别在24、48 hpf于体式显微镜下观察斑马鱼胚胎存活情况，并计算胚胎存活率。24 hpf时，与0 mg/mL组比较，1.0、2.0 mg/mL组斑马鱼胚胎存活率明显降低（P＜0.05）。48 hpf时1.0、2.0 mg/mL组斑马鱼全部死亡。24 hpf和48 hpf的IC₅₀分别为0.787 8 mg/mL和0.691 5 mg/mL。随后剔除WTE 1.0、2.0 mg/mL组，且剔除48 hpf观察拍照，继续摸索斑马鱼出膜率。

每孔分别加入0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6 mg/mL WTE干预12 h，于体式显微镜下观察斑马鱼胚胎出膜情况，并计算出膜率。与0 mg/mL组比较，0.2、0.4、0.6 mg/mL组出膜率均明显降低（P＜0.05），提示0.2、0.4、0.6 mg/mL WTE对斑马鱼出膜率具有抑制作用。其中0.6 mg/mL抑制作用最明显，故剔除0.6 mg/mL组，观察斑马鱼心率。

每孔分别加入0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL WTE干预12 h，于体式显微镜下观察斑马鱼心率情况。与0 mg/mL组比较，0.4 mg/mL组心率明显降低（P＜0.05）。

以上结果提示，0～0.1 mg/mL对斑马鱼存活率、出膜率及心率均无明显影响，为安全浓度范围。因此选取0.025、0.05、0.1 mg/mL作为WTE的干预浓度。见图1。

2.3 分组和干预

待野生型AB系斑马鱼胚胎生长至12 hpf时，随机挑选健康无畸形的胚胎至六孔板中，分为对照组、Dox组、WTE低浓度组、WTE中浓度组和WTE高浓度组，每组30枚胚胎。WTE低、中、高浓度组分别用0.025、0.05、0.1 mg/mL WTE干预12 h，对照组和Dox组使用斑马鱼培养水进行培养；干预结束后，Dox组和WTE低、中、高浓度组用20 μg/mL Dox干预24 h，对照组使用斑马鱼培养水进行培养，每12 h换水换药。

2.4 心率测量和心包水肿率检测

显微镜下观察5组胚胎及心包水肿情况并进行拍照，测量心率和计算心包水肿率。

2.5 中性粒细胞数量检测

采用中性粒细胞特异性表达绿色荧光的转基因Tg（mpx：EGFP）系斑马鱼胚胎，按“2.3”项下分组和干预方法，干预后每组随机收集20枚胚胎，在荧光体视显微镜下观察并拍照，统计斑马鱼心脏中性粒细胞数量。

2.6 DCFH-DA荧光探针检测ROS活性

收集干预后的胚胎，根据ROS检测试剂盒说明书装载探针DCFH-DA进行ROS检测，在荧光体视显微镜下观察并拍照，随后进行荧光定量分析计算ROS平均荧光强度。

2.7 比色法检测MDA、SOD含量

收集干预后的胚胎，采用比色法检测MDA、SOD含量，根据MDA、SOD试剂盒说明书进行操作，分别于532、550 nm波长下测定吸光度值，并计算MDA、SOD含量。

2.8 qPCR检测nrf2、slc7a11、gpx4a、ptgs2a、acsl4a mRNA相对表达水平

每组随机收集14枚胚胎，TRIzol法提取总RNA，使用cDNA逆转录试剂盒对总RNA样本进行cDNA反转录，以各组cDNA为模板，使用SYBR qPCR Super Plus 试剂盒进行Real-time qPCR，斑马鱼特异性引物是由Primer Premier 5.0软件设计并由擎科生物技术有限公司合成的，β-actin1为内参基因，引物序列见表1。PCR扩增方案：50 ℃ 2 min，95 ℃ 5 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 1 min，40 个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 1 s，采用2^－ΔΔCt法计算目的基因的表达水平变化倍数。根据斑马鱼基因命名规则^［18］，本文中斑马鱼基因均用斜体小写字母表示。

2.9 统计学方法

采用Graphpad Prism 8.0软件进行数据分析。计量资料符合正态分布以（\overline{x}±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，若方差齐，两两比较采用Dunnett检验，若方差不齐则采用Tamhane's T2检验。采用线性趋势检验进行剂量效应分析。以α＝0.05为检验水平，P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结　果

3.1 5组心包水肿率和心率比较

与对照组比较，Dox组心包水肿率明显升高（P＜0.05），心率明显降低（P＜0.05）；与Dox组比较，WTE低、中、高浓度组心包水肿率均明显降低（P＜0.05），心率明显升高（P＜0.05）。线性趋势检验显示：该指标随剂量变化无显著线性趋势［slope＝-1.071，95%CI（-4.220，2.077），F（1，40）＝0.47，P＝0.50］，提示无剂量依赖性。见图2。

3.2 5组心脏中性粒细胞荧光数量比较

与对照组比较，Dox组心脏中性粒细胞荧光数量明显增加（P＜0.05）；与Dox组比较，WTE低、中、高浓度组心脏中性粒细胞荧光数量均明显降低（P＜0.05）。线性趋势检验显示：该指标随剂量变化无显著线性趋势［slope＝-0.100，95%CI（-0.766，0.566），F（1，12）＝0.11，P＝0.75］，提示无剂量依赖性。见图3。

3.3 5组ROS平均荧光强度和MDA、SOD含量比较

与对照组比较，Dox组ROS平均荧光强度和MDA含量均明显升高（P＜0.05），SOD含量明显降低（P＜0.05）。与Dox组比较，WTE低、中、高浓度组ROS平均荧光强度均明显降低（P＜0.05），SOD含量明显升高（P＜0.05）；WTE低、中浓度组MDA含量均明显降低（P＜0.05）。

线性趋势检验显示：ROS随WTE剂量的增加而明显升高［slope＝4.704，95%CI（2.306，7.101），F（1，9）＝19.70，P＝0.001 6］，存在显著剂量依赖性；MDA随剂量变化无显著线性趋势［slope＝0.394，95%CI（-0.099，0.887），F（1，9）＝3.27，P＝0.104］，提示无剂量依赖性；SOD随剂量增加而显著升高［slope＝0.227 7，95%CI（0.221 5，0.234 0），F（1，21）＝580 8，P＜0.05］，存在极强的剂量依赖性。见图4、图5。

3.4 5组氧化应激和炎症相关因子mRNA相对表达水平比较

与对照组比较，Dox组nrf2、slc7a11、gpx4a、acsl4a mRNA相对表达水平均明显降低（P＜0.05），ptgs2a mRNA相对表达水平明显升高（P＜0.05）。与Dox组比较，WTE低浓度组nrf2、slc7a11、gpx4a、acsl4a mRNA相对表达水平均明显升高（P＜0.05），ptgs2a mRNA相对表达水平明显降低（P＜0.05）；WTE中浓度组gpx4a、acsl4a mRNA相对表达水平均明显升高（P＜0.05），ptgs2a mRNA相对表达水平明显降低（P＜0.05）；WTE高浓度组nrf2 mRNA相对表达水平明显升高（P＜0.05）。

线性趋势检验显示：指标nrf2、slc7a11、gpx4a存在剂量依赖性，而指标ptgs2a随剂量变化无显著线性趋势［slope＝0.007，95%CI（-0.554，0.568），F（1，6）＝0.001，P＝0.976］，提示无剂量依赖性；指标acsl4a随剂量变化无显著线性趋势［slope＝0.024，95%CI（-0.184，0.231），F（1，6）＝0.078，P＝0.789］，提示无剂量依赖性。见图6。

4 讨　论

Dox介导的心脏毒性可加剧肿瘤患者的病死率，但相关药物治疗措施相对有限。氧化应激和炎症常出现在Dox诱导的心脏毒性中^［19］，ROS是评估氧化应激和炎症反应的重要指标^［20-21］；SOD是生物体内的重要抗氧化酶，也是检测氧化应激的重要指标，具有清除ROS的作用；MDA是脂质过氧化的主要产物，可以反映机体过氧化损伤程度^［22］。中性粒细胞增多则提示炎症的发生^［23］。本研究结果发现：Dox增加了ROS在心脏部位的累积，降低SOD内源性抗氧化酶的活性，并增加MDA的浓度和心脏中性粒细胞的浸润，提示Dox诱导过程发生了氧化应激，即心脏的氧化系统与抗氧化系统平衡被打破，从而导致心肌损伤。而WTE降低了ROS积累，提高了SOD活性，降低了MDA的浓度和中性粒细胞的聚集，提示WTE能够抑制Dox诱导的斑马鱼氧化应激损伤和炎症反应。

斑马鱼胚胎对氧化应激的反应涉及Nrf蛋白家族，最典型的氧化应激反应机制是涉及Nrf2的反应机制^［24］。当ROS升高时，Nrf2从胞质解离并转入核内，启动下游gpx4a、slc7a11等，清除自由基和还原脂质过氧化物^［25-26］。ptgs2a［与人类环氧化酶-2（COX-2）同源］催化花生四烯酸（ARA）生成前列腺素E2（PGE2）等前列腺素，既是炎症信号，也间接促进ROS产生，常被用作脂质过氧化-炎症正反馈的标记^［27］。本研究发现WTE同时靶向4个关键节点：激活nrf2“总开关”、上调gpx4a“灭火酶”、抑制acsl4a“干柴合成”和下调ptgs2a“炎症扩音器”，从而减少氧化应激和炎症的发生。氧化应激促进炎症和组织损伤，导致Dox诱导的心肌损伤疾病的进展。ptgs2a基因对前列腺素合成的环氧合酶2亚型进行双重调节，进一步确立了其作为该模型中氧化应激生物标志物的效用。具体来说，WTE减弱了中性粒细胞向炎症部位的募集，并下调了关键炎症基因，这表明WTE抑制了Dox诱导引发的氧化应激-炎症级联反应。心肌细胞富含线粒体，天然依赖氧化磷酸化供能，也因此成为Dox的“靶场”。本研究观察到Dox组ROS、MDA含量较对照组明显升高，正是这一经典路径的活体印证。本研究结果还发现Dox可显著下调Dox诱导的斑马鱼Nrf2及其下游的gpx4a、slc7a11，与CHEN等^［28］报道的“Nrf2-ARE抗氧化程序被Dox封锁”一致，说明心肌自身的“消防系统”在毒素作用下全面瘫痪。本研究利用Tg（mpx：EGFP）系斑马鱼实时成像，观察到Dox组心脏内中性粒细胞数量明显增加，WTE干预后心脏ROS与心包水肿同步下降，验证了WTE可抑制氧化应激-炎症级联反应，从而保护Dox诱导的斑马鱼心肌损伤。

综上所述，WTE能够通过抑制氧化应激-炎症级联反应保护阿霉素诱导的斑马鱼心肌损伤，验证了WTE“多点灭火”策略。目前Dox诱导的心功能障碍大多指向了铁死亡，而本文nrf2、acsl4a、gpx4a、ptgs2a指标同样也指向了铁死亡，通过斑马鱼模型初步证实了WTE可有效减弱Dox所致心肌损伤，其机制与“氧化应激-炎症有关”，但还存在一定局限性，并不能将WTE保护效应与铁死亡调控直接关联。后续研究将继续进行WTE联合Dox治疗恶性肿瘤的实验研究，拟将机制深入，以“氧化应激-铁死亡”为主线，以期在得到良好抗肿瘤效果的同时，减轻Dox所致的心脏毒副作用。

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基金资助

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