平脂颗粒对高脂饮食诱导非酒精性脂肪性肝病大鼠的防治作用

Preventive and Therapeutic Effects of Pingzhi Granules on Non-Alcoholic Fatty Liver Disease Induced by High-Fat Diet in Rats

摘要

目的 探讨平脂颗粒对高脂饮食诱导的非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）大鼠的防治作用及其可能作用机制。 方法 采用随机数字表法将SD大鼠分为正常组、模型组、平脂颗粒低剂量组（简称低剂量组）、平脂颗粒中剂量组（简称中剂量组）、平脂颗粒高剂量组（简称高剂量组）和阳性对照组，每组10只。正常组喂养大鼠普通基础饲料，其余各组均喂养大鼠高脂饲料以诱发NAFLD模型，均持续喂养6周。造模的同时，低、中、高剂量组分别按3.89、7.78、15.56 g/（kg·d）给予平脂颗粒药液灌胃，阳性对照组按33.33 mg/（kg·d）给予辛伐他汀药液灌胃，正常组和模型组按10 mL/（kg·d）给予生理盐水灌胃，均连续灌胃6周。观察干预后大鼠体型、毛色、精神以及活动情况；称量大鼠体质量和肝脏质量，并计算肝脏指数；测定血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）含量；HE染色观察肝组织病理形态学；Western blot检测肝组织生长因子受体结合蛋白2（GRB2）相关结合蛋白2（Gab2）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）蛋白表达量。 结果 一般情况比较：模型组体型肥胖，毛色灰暗，精神困倦，活动度少；各剂量组与阳性对照组毛色、精神和活动度均较模型组改善。HE染色结果显示：模型组肝组织呈现中重度脂肪病变，肝小叶体积变大，细胞胞浆中充满大小不一的小泡状脂滴，形成脂质空泡，导致肝窦变窄，肝索紊乱，汇管区受压变小；与模型组比较，低、中、高剂量组及阳性对照组肝细胞脂肪变性程度均明显减轻，脂滴数量少且体积小，细胞体积变小，未见到明显脂质空泡。与正常组比较，模型组肝脏质量和肝指数均明显升高（P＜0.05）；血清TC、TG、LDL-C、AST和ALT含量均明显升高（P＜0.05），HDL-C含量明显降低（P＜0.05）；肝组织Gab2和p-Akt蛋白表达量均明显升高（P＜0.05）。与模型组比较，低、中剂量组及阳性对照组肝脏质量和肝指数均明显降低（P＜0.05），高剂量组肝脏质量明显降低（P＜0.05）；低、中、高剂量组和阳性对照组血清TG、LDL-C和AST含量均明显降低（P＜0.05），HDL-C含量差异无统计学意义（P＞0.05），低剂量组和阳性对照组TC含量均明显降低（P＜0.05），低、中剂量组ALT含量均明显降低（P＜0.05）；低、中、高剂量组肝组织Gab2蛋白表达量均明显降低（P＜0.05），中、高剂量组p-Akt蛋白表达量均明显降低（P＜0.05）。 结论 平脂颗粒可改善NAFLD大鼠肝功能，降低血脂，减轻肝细胞脂肪变性作用，可能与下调Gab2和p-Akt蛋白表达有关。

Abstract

Objective To investigate the preventive and therapeutic effects of Pingzhi granules on rats with high-fat diet-induced non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) and explore its potential mechanism of action. Methods SD rats were divided into normal group, model group, low-dose Pingzhi granules group (referred to as the low-dose group), medium-dose Pingzhi granules group (referred to as the medium-dose group), high-dose Pingzhi granules group (referred to as the high-dose group), and positive control group Using the random number table method, with 10 rats in each group. The normal group was fed standard chow, while all other groups were fed a high-fat diet to induce the NAFLD model, both for a duration of 6 weeks. During modeling, the low, medium, and high dose groups were intragastrically administered Pingzhi granules solution at doses of 3.89, 7.78, and 15.56 g/(kg·d), respectively. The positive control group received simvastatin solution at a dose of 33.33 mg/(kg·d) via intragastric administration. The normal control and model groups received normal saline at a dose of 10 mL/(kg·d) via intragastric administration. All administrations continued for 6 weeks. After intervention, the body size, coat color, mental state, and activity of rats were observed. The body mass and liver mass of rats were weighed, and the liver index was calculated. Serum levels of total cholesterol (TC), triglycerides (TG), high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C), low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C), aspartate aminotransferase (AST), and alanine aminotransferase (ALT) were measured. Hepatic histopathological morphology was observed by HE staining. The protein expression of growth factor receptor bound protein 2 (GRB2)-associated-binding protein 2 (Gab2) and phosphorylated protein kinase B (p-Akt) in liver tissue were detected by Western blot. Results General observations of rats showed that the model group had an obese body shape, dark fur color, lethargic spirit, and low activity; the fur color, spirit, and activity of each dose group and the positive control group were improved compared to the model group. HE staining results showed that the liver tissue of the model group exhibited moderate to severe steatosis, with an increased volume of liver lobules, filled with small vesicular lipid droplets of varying sizes in cytoplasm, forming lipid vacuoles, leading to narrowed hepatic sinusoids, disordered liver cords, and compressed and reduced portal areas; compared with the model group, the low, medium, and high dose groups, as well as the positive control group, exhibited a significant reduction in the degree of hepatocyte steatosis, with fewer and smaller lipid droplets, decreased cell volume, and no obvious lipid vacuoles observed. Compared with the normal group, the liver mass and liver index in the model group significantly increased (P<0.05); the contents of serum TC, TG, LDL-C, AST, and ALT significantly increased (P<0.05), while the content of HDL-C significantly decreased (P<0.05); the protein expression of Gab2 and p-Akt in liver tissue significantly increased (P<0.05). Compared with the model group, the liver mass and liver index significantly reduced in the low and medium dose groups and the positive control group (P<0.05), and the liver mass significantly reduced in the high dose group (P<0.05); the serum levels of TG, LDL-C, and AST significantly decreased in the low, medium, and high dose groups and the positive control group (P<0.05), while there was no significant difference in HDL-C levels (P>0.05); the serum level of TC significantly reduced in the low dose and positive control groups (P<0.05), and serum level of ALT significantly reduced in the low and medium dose groups (P<0.05); the protein expression of Gab2 in liver tissue significantly decreased in the low, medium, and high dose groups (P<0.05), and the protein expression of p-Akt significantly reduced in the medium and high dose groups (P<0.05). Conclusion Pingzhi granules can improve liver function, reduce blood lipids, and alleviate hepatocyte steatosis in NAFLD rats, which may be related to the downregulation of Gab2 and p-Akt protein expression.

Graphical abstract

关键词

非酒精性脂肪性肝病 / 平脂颗粒 / 高脂饮食 / Gab2 / p-Akt

Key words

non-alcoholic fatty liver disease / Pingzhi granules / Gab2 / p-Akt

非酒精性脂肪肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一种以肝细胞内脂肪积累和肝细胞变性为特征的病理综合征，与肝脏脂肪代谢紊乱密切相关，可进展为非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化，甚至是肝癌，流行病学表明我国NAFLD成人患病率接近30%^［1-2］。肝脏脂代谢受到细胞因子、激素和小分子等多种因素的复杂调控，包括酪氨酸受体信号等多种信号通路参与其中。生长因子受体结合蛋白2（growth factor receptor bound protein 2，GRB2）相关结合蛋白2（GRB2-associated-binding protein 2，Gab2）介导多种酪氨酸受体的信号，在NAFLD形成发展过程中具有重要的枢纽作用^［3］。研究表明：高脂饮食可诱导Gab2蛋白升高，并通过调控蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）等多种细胞信号通路引起肝脏脂代谢紊乱，与NAFLD病理发展关系密切^［3-5］。

平脂颗粒为厦门市医药研究所研发的中药复方颗粒剂^［6］，由葛根、决明子、山楂、丹参等中药提取精制而成，已在临床中用于预防与治疗NAFLD 20余年^［7-8］。前期临床试验结果显示：平脂颗粒可阻止和改善肝脏脂肪变性，同时具有显著的调节血脂作用。基于此，本研究观察平脂颗粒对NAFLD大鼠模型肝脏组织中Gab2、p-Akt相关蛋白表达的影响，以期探讨平脂颗粒对于NAFLD 的疗效及作用机制，为临床应用提供理论依据。

1 实验材料

1.1 实验动物

清洁级雄性SD大鼠60只，体质量（190±20） g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2017-0005，饲养于厦门市医药研究所实验动物室。实验动物饲养条件：湿度65%，温度21～23 ℃，分笼饲养，动物给予12 h昼夜节律，实验过程除特殊要求以外，其余时间自由进食、饮水、活动。大鼠普通基础饲料购自北京华阜康生物科技股份公司（饲料生产许可证：京饲证201406057，生产批号：1810250925）。大鼠高脂饲料购自上海普路腾生物科技公司（饲料生产许可证号：沪饲证201401001，生产批号：20181025-158），高脂饲料成分为酪蛋白、复合矿物质、玉米淀粉、麦芽糊精、蔗糖、纤维素、豆油、碳酸钙等。

1.2 实验药物

平脂颗粒由厦门市医药研究所制剂室制备（批号：180313），将平脂颗粒溶于生理盐水中，配制成浓度为1.04 g/mL的平脂颗粒药液。辛伐他汀片购自杭州默沙东制药公司（批号：23876），将其磨成细粉末后溶于生理盐水中，配制成浓度为2.22 mg/mL的辛伐他汀药液。

1.3 实验试剂

总胆固醇（TC）试剂盒（批号：20181226）、甘油三酯（TG）试剂盒（批号：20181225）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）试剂盒（批号：20181226）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）试剂盒（批号：20181224）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）试剂盒（批号：20190110）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）试剂盒（批号：20190120）均购自南京建成生物工程研究所；Gab2抗体（圣克鲁斯生物技术公司，批号：365590）；β-actin抗体（批号：4970）、磷酸化Akt（p-Akt）抗体（批号：4060）均购自美国CST公司。

1.4 实验仪器

分析天平（瑞士Mettler Toledo公司，型号：ME1002）；全波长酶标仪［美谷分子仪器（上海）有限公司，型号：SpectraMax M3］；电热恒温水浴锅（上海博讯实业有限公司医疗设备厂，型号：HHS）；高速离心机（德国Hettich公司，型号：Universal 320）；石蜡切片机（型号：RM2235）、包埋机（型号：EG1150H）、组织脱水机（型号：TP1020）均购自德国Leica公司。

2 实验方法

2.1 动物分组、造模与干预

SD大鼠适应性饲养4 d，采用随机数字表法分为正常组、模型组、平脂颗粒低剂量组（简称低剂量组）、平脂颗粒中剂量组（简称中剂量组）、平脂颗粒高剂量组（简称高剂量组）和阳性对照组，每组10只。正常组喂养大鼠普通基础饲料，模型组、阳性对照组和低、中、高剂量组大鼠均喂养大鼠高脂饲料以诱发NAFLD模型^［9-10］，均持续喂养6周。病理形态学若发现肝组织脂肪堆积、肝细胞脂肪变性、产生脂质空泡等病理变化，则证实诱发NAFLD模型成功。造模的同时，低、中、高剂量组分别按3.89、7.78、15.56 g/（kg·d）给予平脂颗粒药液灌胃，阳性对照组按33.33 mg/（kg·d）给予辛伐他汀药液灌胃，正常组和模型组按10 mL/（kg·d）给予生理盐水灌胃，灌胃剂量依据大鼠体质量按周计算调整，均连续灌胃6周。

2.2 一般情况和肝脏指数

观察第6周大鼠体型、毛色、精神以及活动情况。最后1次灌胃后禁食12 h称重，麻醉后剪开大鼠胸腹部，暴露心脏，针头扎入心尖取出血液，血液样品常温放置4 h，3 000 r/min 离心10 min，分离出血清，每只大鼠血清样品均分成3份，置于EP管中，超低温冰箱保存。分离大鼠肝脏，生理盐水漂洗血迹，称量大鼠肝脏质量，并计算肝脏指数，最后将每个肝脏样品分为2份，一部分置于10%福尔马林固定液固定用于HE染色，另一部分置于液氮后转移至-80 ℃冰箱冷冻保存，用于后续Western blot实验。

2.3 血清脂代谢和肝功能指标检测

采用COD-PAP单试剂微板法检测TC含量，采用GPO-PAP酶法检测TG含量，采用直接均相法检测HDL-C、LDL-C含量，采用速率法检测AST、ALT含量。根据试剂盒说明书，用酶标仪测定血清TC、TG、HDL-C、LDL-C、AST和ALT的吸光度值并计算其含量。

2.4 HE染色观察肝组织病理形态学

对固定后的肝组织进行脱水、石蜡包埋、病理切片和常规脱蜡，再用苏木精浸染10 min，流水轻柔漂洗1 min，1%盐酸乙醇溶液浸染2 s快速返蓝，再经0.5%伊红染液浸染5 s，染色完毕的标本经脱水、中性树脂封片，最后于光镜下观察其形态学变化并拍照。大鼠肝组织细胞脂肪变性判断标准：低倍镜下，肝细胞脂肪变性；占肝小叶1/3～1/2为轻度脂肪肝；占肝小叶＜1/2～3/4为中度脂肪肝，占肝小叶＞3/4以及肝细胞弥漫脂肪性变性为重度脂肪肝^［11］。

2.5 Western blot检测肝组织Gab2、p-Akt蛋白表达量

各组随机选取4份肝组织，应用RIPA蛋白裂解液提取肝组织总蛋白，BCA法测定蛋白质浓度。经蛋白变性、电泳、转膜及封闭后，将PVDF膜置于Gab2（1∶1 000）、p-Akt（1∶1 000）、β-actin（1∶2 000）一抗中4 ℃下摇床过夜，清洗后置于二抗（1∶5 000）中孵育，TBST溶液漂洗，加入ECL发光液，凝胶成像仪上显影拍照，ImageJ凝胶图像软件分析光密度值。

2.6 统计学方法

采用SPSS 21.0软件进行数据处理。计量资料符合正态分布以（\overline{x}±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，若方差齐，两两比较采用LSD-t检验，若方差不齐则采用Dunnett's T3检验。不符合正态分布以M（P₂₅，P₇₅）表示，两两比较采用Mann-Whitney U检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 结　果

3.1 6组一般情况比较

正常组体型瘦长，皮毛色泽光亮，活动度好；模型组体型肥胖，毛色灰暗，精神困倦，活动度少；各剂量组与阳性对照组毛色、精神和活动度均较模型组改善。

3.2 6组肝组织病理形态比较

光镜下正常组未发现肝细胞脂肪变性或坏死，肝小叶结构正常，肝组织内未见有脂滴存在，且肝窦清楚可见，无炎性细胞出现。模型组肝组织呈现中重度脂肪病变，肝小叶体积变大，细胞胞浆中充满大小不一的小泡状脂滴，形成脂质空泡，导致肝窦变窄，肝索紊乱，汇管区受压变小，但结构基本正常，从病理组织学角度上提示NAFLD大鼠模型造模成功。与模型组比较，低、中、高剂量组及阳性对照组肝细胞脂肪变性程度均明显减轻，脂滴数量少且体积小，细胞体积变小，未见到明显脂质空泡。见图1。

3.3 6组肝脏质量和肝指数比较

与正常组比较，模型组肝脏质量和肝指数均明显升高（P＜0.05）。与模型组比较，低、中剂量组及阳性对照组肝脏质量和肝指数均明显降低（P＜0.05），高剂量组肝脏质量明显降低（P＜0.05）。见表1。

3.4 6组血清脂代谢和肝功能指标比较

与正常组比较，模型组血清TC、TG、LDL-C、AST和ALT含量均明显升高（P＜0.05），HDL-C含量明显降低（P＜0.05）。与模型组比较，低、中、高剂量组和阳性对照组血清TG、LDL-C和AST含量均明显降低（P＜0.05），HDL-C含量差异均无统计学意义（P＞0.05）；低剂量组和阳性对照组TC含量均明显降低（P＜0.05）；低、中剂量组ALT含量均明显降低（P＜0.05）。见表2。

3.5 6组肝组织Gab2和p-Akt蛋白表达量比较

与正常组比较，模型组肝组织Gab2和p-Akt蛋白表达量均明显升高（P＜0.05）。与模型组比较，低、中、高剂量组肝组织Gab2蛋白表达量均明显降低（P＜0.05），中、高剂量组p-Akt蛋白表达量均明显降低（P＜0.05）。见图2。

4 讨　论

现代学者多将NAFLD归属中医学“胁痛”“积证”“肝著”“肥气”“积聚”“癥瘕”“肥气”“肝癖”等范畴。中医古籍中关于NAFLD的论述最早出自《难经》中提及的“肝之积，名曰肥气”，“肥气”的形成是因过食肥甘厚味、肝中积滞过多所致。《素问·奇病论》指出：“此人必数食甘美而多肥也。肥者令人内热，甘者令人中满”，提示嗜食肥甘厚味可导致湿热蕴结脾胃，久病致肝、脾、肾功能失调，痰浊、瘀血停滞于肝脏而逐渐形成。现在认为NAFLD是由于饮食不节、劳逸失度、情志失调、久病体虚、禀赋不足，引起肝体用失调，肝失疏泄，脾失健运，致痰、热、湿、瘀互结，壅滞肝络，体内肥浊之气蓄积于肝，为本虚标实之证^［12］。

平脂颗粒是在名老中医黄文传教授临床验方基础上研制而成的一种中药复方制剂，方中决明子清肝泄热，通便化浊降脂，为君药；泽泻利水渗湿、泄热，配合决明子起清热利湿之功效，为臣药；山楂行气、散瘀、化浊；丹参活血化瘀；葛根升发阳气、舒筋通络，共为佐药，全方共奏清肝利湿、化浊降脂、理气化瘀之效。

研究显示Gab2和Akt信号通路在NAFLD的发展中发挥着重要的作用^［3-5］。有研究通过敲除Gab2可以有效抑制高脂饲养所诱导的NAFLD形成和脂肪性肝炎的发生^［3］，表明Gab2在NAFLD形成中发挥着重要的促进作用。而激活Akt信号能促进脂肪的合成和积累，导致NAFLD形成^［13］。研究发现高脂饮食可以诱导小鼠脂肪组织中Gab2蛋白表达升高，同时激活Akt信号通路，从而引起脂代谢紊乱^［14］。本研究结果显示：平脂颗粒不仅可以有效改善NAFLD大鼠的血脂水平和肝功能，病理形态学表明平脂颗粒能阻止和改善肝脏脂肪变性和脂肪堆积，并且可以抑制高脂饮食诱导NAFLD中Gab2和p-Akt蛋白的表达，表明平脂颗粒可能通过影响Gab2和Akt信号通路调控NAFLD的发展。

综上所述，平脂颗粒对大鼠NAFLD具有良好的预防和治疗作用，其机制可能与下调Gab2和p-Akt蛋白表达有关。同时，本研究仍有一定局限性，尽管Gab2可以调控Akt信号通路，但研究显示Akt信号通路受到众多不同信号通路的调控^［15］，本次研究只是表明平脂颗粒可以同时下调Gab2和p-Akt的表达，而平脂颗粒是如何通过调控Gab2来影响Akt信号通路需要进一步的研究。因此综合利用高通量筛选技术、遗传学和分子生物学方法去研究平脂颗粒改善NAFLD的深层次分子机制是接下来的研究计划。

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基金资助

厦门市科技局科技惠民计划项目(3502Z20184055)