基于代谢组学探讨火龙罐综合灸联合常规治疗和康复训练改善卒中后疲劳的效应机制

摘要

目的 分析火龙罐综合灸联合常规治疗和康复训练对卒中后疲劳（PSF）患者血清代谢组学特征的影响，并探讨其促进PSF康复的作用机制。 方法 选取2023年9月—2024年9月于福建中医药大学附属人民医院神经内科住院的PSF患者35例，在常规治疗和康复训练基础上联合火龙罐综合灸治疗，连续干预9 d。分别于治疗前后空腹状态下抽取肘静脉血液，运用超高液相色谱-质谱联用技术（UHPLC-QE-MS）检测代谢物，比较干预前后血清代谢组学变化。 结果 共检测出1 628个代谢物，筛选出差异代谢物178个，干预后吲哚-3-乙酰胺、真菌代谢物、花生四烯酰、4-甲基苯磺酰胺等13个代谢物显著上调，N-甲基谷氨酸、精氨酸-丙氨酸等165个代谢物显著下调。差异代谢物KEGG分类共涉及55条代谢通路，主要包括氨基酸的生物合成、甘油磷脂代谢、ABC转运蛋白、氨酰-tRNA生物合成、癌症中的胆碱/中心代谢等。差异代谢物KEGG富集分析主要涉及15条代谢途径，主要包含氨基酸生物合成、甘油磷脂代谢、氨酰-tRNA生物合成。代谢通路分析主要包括氮代谢、丙氨酸/天冬氨酸和谷氨酸代谢、氨酰-tRNA生物合成、泛醌和其他萜类-醌生物合成、甘油磷脂代谢5条代谢通路。 结论 火龙罐综合灸联合常规治疗和康复训练可能通过调节氨基酸代谢、脂质代谢等多条代谢途径，促进PSF的康复。

Graphical abstract

关键词

卒中后疲劳 / 火龙罐 / 灸法 / 代谢组学 / 氨基酸代谢

卒中后疲劳（post-stroke fatigue，PSF）是指卒中患者在心理和身体上经历的一种主观感受，表现为持续的疲倦、乏力和厌倦感，即便经过充分休息也无法缓解^［1］。最新流调学发现，我国40岁及以上人群脑卒中现患人数达1 242万，PSF作为脑卒中后常见后遗症，发病率高达39%～75%，影响患者的心理、认知、社会和运动功能，降低其生活质量^［2-3］。卒中后多因气血阴阳失调、脏腑虚损而发“虚劳”，《素问·至真要大论》云：“劳者温之……损者温之”。火龙罐综合灸是一种创新的中医传统疗法，融合推拿、艾灸、拔罐和刮痧的综合应用，发挥通经活络、调和气血、温补阳气、滋补身体的功效^［4］，可用于治疗PSF。非靶向代谢组学是对生物样本中检测到的所有代谢产物进行全面、系统、无偏向性和无假设的分析，广泛应用于标志代谢物的识别及潜在作用机制的探索，与中医整体观相一致^［5］。本研究运用非靶向代谢组学技术筛选PSF患者血清中的差异代谢产物，旨在探究火龙罐综合灸联合常规治疗和康复训练改善PSF的机制，为开发临床治疗方法提供理论支持。

1 临床材料

1.1 西医诊断标准

缺血性脑卒中诊断参考《中国各类主要脑血管病诊断要点 2019》^［6］。疲劳严重度量表（fatigue severity scale，FSS）评分≥4分作为PSF的诊断阈值，评分越高代表疲劳越严重^［7］。

1.2 纳入标准

① 45岁＜年龄＜75岁；② 近1个月未接受过PSF相关药物和物理治疗，如镇静安眠药奥沙西泮、阿普唑仑、艾司唑仑和针灸等；③ 首发卒中，病程≤6个月；④ 无认知、感知觉障碍或失语；⑤ 操作部位皮肤完好无破损；⑥ 无任何辅助情况下，能够站立5 min以上，步行6 min；⑦ 知情同意并签署知情同意书。

1.3 排除标准

① 进展性脑卒中；② 出凝血功能障碍；③ 精神分裂症生活质量量表（schizophrenia quality of life scale，SS-QQL）中情绪维度得分≤14分^［8］；④ 合并有糖尿病伴神经病变者；⑤ 接触性过敏或艾烟过敏；⑥ 合并有贫血、肝炎、癌症、免疫系统疾病、帕金森病引起的继发性疲劳。

1.4 一般资料

选取2023年9月—2024年9月于福建中医药大学附属人民医院神经内科住院的PSF患者35例，对干预前后进行代谢组学分析。本研究已通过福建中医药大学附属人民医院伦理委员会审批（审批号：2023-097-02）。

2 研究方法

2.1 治疗方法

参照《中西医结合脑卒中防治专家共识（2020）》^［9］进行改善脑循环、改善脑代谢、抗血小板聚集等治疗。根据受试者血压、血脂、血糖的控制情况对症治疗。同时根据《中国脑卒中早期康复治疗指南》^［10］指导患者进行常规康复训练，包括：良肢位设置、关节被动/主动活动、早期床边坐位平衡训练。在常规治疗和康复训练基础上联合火龙罐综合灸，具体步骤如下。① 部位：督脉、足太阳膀胱经、足少阴肾经，重点穴位“百会”“肾俞”“太溪”。② 精油介质：选择薰衣草单方精油（阿芙精油，广州栋方生物科技股份有限公司）。③ 皮肤敏感试验：将少量单方精油涂抹于患者手臂内侧，观察24 h内有无红肿、瘙痒等过敏症状^［11］。④ 操作：取舒适体位后充分暴露治疗部位，涂抹精油。将直径25 mm×高度20 mm的艾柱（商品名称：拔罐器小号艾柱；厂家名称：武汉嘉达烨达健康管理有限公司）固定在火龙罐内，每天选取一条经络，即督脉、足太阳膀胱经、足少阴肾经，3条经络每天轮换，采用点、叩、推、揉、熨、烫等手法进行运罐治疗。重点穴位百会穴施以补法，肾俞穴与太溪穴则行泻法。每次治疗约30 min，每3 d为1个疗程，连续进行3个疗程。⑤ 注意患者隐私和防烫伤。

2.2 血清采集和代谢物提取

分别于治疗前后空腹状态下抽取肘静脉血液5 mL，置于肝素钠抗凝管中轻轻颠倒旋转使之混匀，静置30 min后，4 ℃下3 000 r/min离心10 min，将血清转移至EP管中，保存于-80 ℃冰箱中。代谢物提取：取100 μL样品到EP管中，加入400 μL提取液［甲醇∶乙腈＝1∶1（V/V）］，涡旋振荡混匀30 s，超声10 min（冰水浴），-40 ℃下静置1 h后，将样品在4 ℃的低温离心机以12 000 r/min离心15 min，取所有样品吸取等量上清液混合成质控（quality control，QC）样品上机，采用超高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司，型号：Vanquish）、高分辨质谱（美国Thermo Fisher Scientific公司，型号：Orbitrap Exploris 120），运用超高液相色谱-质谱联用技术（UHPLC-QE-MS）检测代谢物。

2.3 代谢组学分析

2.3.1 原始数据

原始数据经ProteoWizard软件转成mzXML格式后，使用合作编写的R包进行代谢物鉴定，所用数据库为BiotreeDB（V3.0），然后用自主编写的R包进行可视化分析。对获取的数据进行主成分分析（PCA）以揭示数据的内部结构、分析样本间总体分布趋势及样本变异度，进行正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）以获取更加可靠的代谢物组间差异及与PSF相关程度信息，最后进行7次循环交叉验证、应用置换检验以防止模型出现过度拟合及判断模型有效性。

2.3.2 差异代谢物筛选

本研究进行差异代谢物筛选时结合单元变量和多元变量统计分析结果，使用的卡值标准基于以下2个指标：学生t检验（Student's t-test）的P值＜0.05；OPLS-DA模型第一主成分的变量投影重要度（VIP）＞1。将筛选差异代谢物的结果以火山图的形式进行可视化。

2.3.3 差异代谢物的层次聚类分析

将数据进行归一化处理，所有样品以完全连锁方法对差异代谢物进行聚类，并以热力图进行展示。

2.3.4 差异代谢物的代谢通路分析

① 代谢物富集到代谢通路的KEGG pathway数据库ID，确认代谢物数量和名称，将差异代谢物在KEGG通路图上进行标记。② 根据差异代谢物在KEGG代谢通路中的富集结果，计算Rich Factor，该值越大表示富集程度越大。③ 通过差异代谢物对KEGG、PubChem等权威代谢物数据库进行映射，代谢通路分析的结果以气泡图展示。

3 结　果

1例干预6 d后出院，1例干预2 d后脑出血转神经外科手术治疗，因此本次针对干预前35个样本和干预后33个样本进行代谢组学分析。

3.1 原始数据分析

原始数据包含8个QC样本和68个实验样本，PCA得分图显示样本聚集性好，方法稳定，见图1。

3.2 OPLS-DA模型置换检验

干预前、干预后分离明显，聚合度较好，表明干预前后差异代谢产物明显，见图2。Q²的回归线从-0.74开始呈上升趋势，R²Y的回归线从0.71开始呈下降趋势，说明模型存在过拟合现象，见图3。

3.3 干预前后差异代谢物筛选结果

共检测出1 628个代谢物，筛选出差异代谢物178个，干预后对比上调差异物质13个，下调差异物质165个。差异代谢物火山图见图4，部分差异代谢物数据见表1。

3.4 干预前后差异代谢物表达聚类分析

观察整个热力图的颜色分布发现，1-甲基-4-哌啶甲酸、腺苷、精氨酸-丙氨酸等10个代谢物含量由高表达转为低表达，吲哚-3-乙酰胺、真菌代谢产物等10个代谢物表达含量由低变高，说明火龙罐综合灸联合常规治疗和康复训练对生物体的代谢产生广泛而显著的影响。见图5。

3.5 干预前后差异代谢物KEGG分类

本研究共涉及55条代谢通路，图6为差异代谢物富集于KEGG代谢通路中占比排名前15位的通路，主要包括氨基酸的生物合成、甘油磷脂代谢、ABC转运蛋白、氨酰-tRNA生物合成、癌症中的胆碱/中心代谢等。

3.6 干预前后差异代谢物KEGG富集分析

主要涉及15条代谢途径，氨基酸生物合成、甘油磷脂代谢、氨酰-tRNA生物合成3条代谢通路的圆点尺寸较大（Count多），可能是受火龙罐干预后影响最广泛的核心代谢通路。见图7。

3.7 干预前后差异代谢物代谢通路气泡图

氮代谢、丙氨酸/天冬氨酸和谷氨酸代谢、氨酰-tRNA生物合成、泛醌和其他萜类-醌生物合成、甘油磷脂代谢5条代谢通路可能是火龙罐综合灸联合常规治疗和康复训练改善PSF的重要通路，可作为后续研究的重点。见图8。

4 讨　论

PSF可归于“虚劳”范畴，肾精不足则髓海空虚，脑失所养，而发疲乏，说明肾虚髓减是本病发生的基础，病位主要在肾与脑，贯穿疾病全程。脑为元神之府，调理神志当以治脑为主；肾主藏精，乃五脏阴阳之根本，调理脏腑功能、改善躯体症状宜以治肾为先^［12］。基于“脑肾相济”理论，督脉因与脑、脊髓存在密切关联，成为脑部病变治疗的优先选择经脉；足太阳膀胱经循行于背部，包含肝俞、肾俞等重要背俞穴，可实现脏腑精气的转输；足少阴肾经则直接与肾脏相连，是培补元精的关键经脉。此3条经脉共同构建“脑-肾”之间的经络联属系统，在调节全身脏腑阴阳方面发挥着关键作用。百会穴属督脉，又为“诸阳之会”，能通达脑肾，升阳醒神^［13］；肾俞穴作为足太阳膀胱经要穴，能补益先天精气，充养髓海^［14］；太溪穴作为足少阴肾经原穴，有补肾益精、滋阴壮阳、固本培元之效^［12］。三穴配伍，由上至下，共奏通调督阳、益肾填精、充养脑髓之效。相关文献研究表明，火龙罐疗法可有效缓解老年2型糖尿病患者的疲劳症状，提升患者的生活质量^［15］；“通督调神”火龙罐疗法则能够改善PSF患者的疲劳状态并减轻其负性情绪^［16］。因此，本研究基于非靶向代谢组学探究火龙罐综合灸联合常规治疗和康复训练对PSF患者的代谢特征，以明确其作用机制。

本研究对干预前后差异代谢物进行KEGG通路富集分析发现：氨基酸类物质和丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代谢及脂质代谢是火龙罐综合灸联合常规治疗和康复训练改善PSF的主要通路。脑卒中后机体出现能量代谢紊乱、兴奋性神经毒性、氧化应激和神经系统损伤等^［17］，氨基酸类物质作为神经递质的前体，脑组织的损伤导致兴奋性神经递质（谷氨酸、天冬氨酸）过度释放，引起钙离子超载、氧自由基过量生成和凋亡基因激活等神经损害作用，从而引发中枢性疲劳^［18］。炎症因子与PSF发生、发展密切相关，促炎细胞因子激活后扰乱谷氨酸信号表达，从而产生疲劳。本研究结果发现：PSF患者促炎因子IL-1、IL-6、肿瘤坏死因子（TNF）出现高水平表达，经火龙罐综合灸联合常规治疗和康复训练后上述促炎因子水平较前下降，抑制性氨基酸类递质γ-氨基丁酸（GABA）含量较前提高，从而减少兴奋性氨基酸的毒性损伤，保护神经元。同时谷氨酸、天冬氨酸及精氨酸具有抗疲劳功效^［19-20］，因此氨基酸代谢的调整可能有助于改善PSF患者的神经功能。同时灸法可以减轻兴奋性氨基酸毒性的功效，改善对神经元的损伤^［21］。此外，脂质在细胞膜结构的构建、能量储存、神经元突触的生长与成熟、神经系统的发育与修复以及参与机体信号传导等方面发挥着关键作用。脂质异常是脑卒中的危险因素，与PSF的发生有明确的关系^［22］。艾灸可显著降低脂质过氧化物的合成，进而抑制铁死亡的发生^［23］。火龙罐综合灸可能通过温热刺激，将热度传到体内，影响血管内皮相关受体及RNA的表达，同时发挥艾灸的作用，进而调节脂类代谢。因此，火龙罐综合灸联合常规治疗和康复训练可能通过调节这些代谢通路，进一步促进PSF患者的神经功能恢复和代谢平衡，从而发挥其治疗作用。

研究结果显示：干预后吲哚-3-乙酰胺、真菌代谢物、花生四烯酰、4-甲基苯磺酰胺、4-（3-甲基-5-氧代-4，5-二氢-1H-吡唑-1-基）苯甲酸较干预前显著上调，这些差异代谢物在PSF的发病机制中可能扮演着重要角色。吲哚-3-乙酰胺是一种天然存在的植物生长素，它在人体内可能参与调节睡眠-觉醒周期，而睡眠障碍是疲劳的诱发因素^［24］。真菌代谢产物为人体微生物维持体内环境动态平衡，大脑和菌群之间存在神经-内分泌-免疫网络^［25］。PSF患者的长期应激反应会增加肠壁通透性，微生物代谢产物更容易通过肠壁进入血液循环，穿过血脑屏障，直接影响身体的认知和行为功能。花生四烯酰作为一种多不饱和脂肪酸，是细胞膜的重要组成部分，最容易发生氧化反应的脂质，损伤细胞膜，进而启动神经元的铁死亡，造成神经系统的损伤^［26-27］。4-甲基苯磺酰胺和4-（3-甲基-5-氧代-4，5-二氢-1H-吡唑-1-基）苯甲酸则可能与能量代谢和氧化应激相关。4-甲基苯磺酰胺是一种磺酰胺类化合物，可能通过影响细胞内信号传导途径，参与调节能量代谢。而4-（3-甲基-5-氧代-4，5-二氢-1H-吡唑-1-基）苯甲酸作为吡唑类衍生物，可能通过其抗氧化特性，参与调节氧化应激反应，进而影响PSF的发展。

干预后N-甲基谷氨酸、精氨酸-丙氨酸、5-甲基-DL-谷氨酸等较干预前显著下调。谷氨酸、精氨酸、同型半胱氨酸等是缺血性脑卒中潜在的生物标志物^［28］，谷氨酸是天冬氨酸是人体大脑中含量最高的兴奋性氨基酸，它们参与中枢神经系统的信息传递，过量摄入会通过兴奋毒性作用对神经元造成显著损害^［29］。精氨酸可破坏线粒体功能，引起Ca²⁺通道功能障碍，高浓度NO导致脑细胞氧化损伤^［30］。胆固醇是构成许多重要生物分子及作为它们前体物质的关键成分，维持胆固醇稳态对细胞稳定和机体生理功能十分重要^［31］。本研究采用火龙罐综合灸联合常规治疗和康复训练后谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、胆固醇代谢物水平下调，提示平衡氨基酸水平、维持胆固醇稳态可能是治疗缺血性脑卒中的一个新思路。这与赵钟辉等^［32］研究相一致，氨基酸代谢物是脑卒中患者恢复期的标志性代谢物。

本研究设计中，代谢组学分析采用单组自身前后对照，存在一定的局限性，提示在评估疗效时需持审慎态度，尚需通过设计更为严谨的随机对照试验予以验证。尽管如此，本研究初步探究了火龙罐综合灸联合常规治疗和康复训练治疗PSF患者的血清代谢组学特征，其结果为进一步确证该疗法在PSF管理中的应用价值提供重要的前期证据与可行性依据。未来的研究可进一步深入探讨这些代谢物在PSF发生、发展中的具体作用机制，以及其作为潜在生物标志物在诊断和治疗方面的潜力。同时，可开展尿液、脑脊液等多类样本的联合研究。

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基金资助

福建省自然科学基金项目(2023J01842)