易黄汤调控AIM2介导的细胞焦亡对裸鼠宫颈癌移植瘤HPV及相关因子的影响

摘要

目的 探讨易黄汤对脾虚湿热型宫颈癌移植瘤裸鼠中HPV表达及AIM2/GSDMD-N/Caspase-1通路与细胞焦亡因子IL-18、IL-1β的影响。 方法 将30只裸鼠随机分为对照组、模型组以及易黄汤低、中、高浓度组共5组，每组6只。除对照组外，其余4组均通过湿热环境和高脂高糖饮食以及接种CaSki细胞构建脾虚湿热型宫颈癌移植瘤裸鼠模型。当小鼠出现嗜卧懒动、易激惹、形体消瘦、进食及饮水量减少、毛发疏松粗糙、粪便时干时溏、肛温稍有增加，且小鼠右腋下可触及直径≥5 mm结节时即认为造模成功。对照组按常规方式喂养，低、中、高剂量组均按体质量40.0 mL/kg分别予含生药浓度0.25、0.50、1.00 g/mL易黄汤药液灌胃，模型组和对照组予同等剂量生理盐水灌胃，均隔日1次，干预3周。干预结束后比较5组移植瘤体质量、体积；RT-PCR技术测定裸鼠移植瘤组织HPV16 E7 mRNA转录水平；ELISA法检测裸鼠血清及移植瘤组织中的白细胞介素-18（IL-18）、白细胞介素-1β（IL-1β）水平；Western blot检测裸鼠移植瘤组织AIM2、GSDMD-N、Caspase-1蛋白相对表达量。 结果 与对照组比较，模型组移植瘤质量和体积均升高（P＜0.05），HPV16 E7 mRNA转录水平升高（P＜0.05），AIM2、GSDMD-N、Caspase-1蛋白相对表达量均升高（P＜0.05），瘤组织IL-18、IL-1β水平以及血清中的IL-18、IL-1β水平均升高（P＜0.05），且呈浓度依赖性升高（P＜0.05）；与模型组比较，易黄汤低、中、高浓度组移植瘤体积和质量均降低（P＜0.05），瘤组织HPV16 E7 mRNA转录水平降低（P＜0.05），血清中IL-18、IL-1β均降低（P＜0.05），且呈浓度依赖性降低（P＜0.05），而瘤组织而AIM2、GSDMD-N、Caspase-1蛋白相对表达量及IL-18、IL-1β均升高（P＜0.05），且同样呈浓度依赖性升高（P＜0.05）。 结论 脾虚湿热可轻度激活细胞焦亡，促进肿瘤生长及HPV表达；易黄汤呈浓度依赖性激活AIM2/GSDMD-N/Caspase-1通路诱导焦亡，抑制宫颈癌生长并降低HPV载量。

Graphical abstract

关键词

易黄汤 / 脾虚湿热证 / 移植瘤 / AIM2/GSDMD-N/Caspase-1信号通路 / 细胞焦亡因子

根据2022年全球癌症统计数据，发展中国家宫颈癌位居女性恶性肿瘤第五位^［1］，近几年我国宫颈癌发病率也呈逐年上升趋势^［2］，对宫颈癌的防治刻不容缓。目前已明确宫颈癌是高危型人乳头状瘤病毒（HR-HPV）持续感染所致、与炎症密切相关的肿瘤^［3］，因此机体感染HR-HPV如能及时清除，就可以减少宫颈癌的发生。但目前西医对HR-HPV无有效药物或治疗方法，中医基于“正气存内，邪不可干”理论，通过整体观念和辨证论治可发挥对病毒的精准干预和有效控制。大量研究发现，中草药含有众多复杂的化学成分发挥多种生物学效应，对HR-HPV相关的宫颈病变具有增强机体免疫功能和抑制病毒双向作用。本课题组前期临床研究表明：中药易黄汤能有效改善患者脾虚湿热状态、提高HR-HPV转阴率^［4］，但具体机制不详。宫颈病变的发生、进展高度依赖于HPV感染所驱动的慢性炎症反应。细胞焦亡作为炎性程序性死亡方式，可通过组装炎症小体、释放焦亡相关效应因子触发异常免疫炎症应答，其信号通路异常已被证实参与炎症相关性肿瘤的发生和发展与治疗抵抗；而中药及其有效成分对细胞焦亡介导的多种炎性疾病均具有确切的调控效应与干预潜力^［5］，因此细胞焦亡为研究中药抗病毒、抗肿瘤作用机制提供了新方向。本研究旨在通过AIM2/GSDMD/Caspase-1信号通路观察易黄汤对裸鼠宫颈癌移植瘤及细胞焦亡因子的影响，从而探讨易黄汤对HPV相关宫颈疾病的作用机制。

1 材料

1.1 实验动物及细胞株

3周龄SPF级BALB/cnu/nu雌性裸鼠30只，体质量18～22 g，购自杭州子源实验动物科技有限公司，动物生产许可证号：SCXK（浙）2019-0004，实验动物使用许可证：SYXK（浙）2019-0004。实验全程均遵循相关动物保护规定实施并已通过上海睿太莫斯生物科技有限公司实验动物伦理委员会批准（审批号：LL-230153）。HPV16阳性CaSki人宫颈癌肠转移细胞（上海中乔新舟生物科技有限公司，产品批号：ZQ0066）。

1.2 主要试剂与仪器

1.2.1 试剂

胎牛血清（美国Gbico公司，产品批号：16000-044）；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（Caspase-1，产品批号：31020-1-AP）、黑色素瘤缺乏因子2（AIM2，产品批号：20590-1-AP）、肌动蛋白（β- actin，产品批号：660009-Ig）均购自美国Proteintech公司；Gasdermin家族蛋白（GSDMD-N，产品批号：Ab215203）购自英国Abcam公司；BCA蛋白定量试剂盒（上海Beyotime公司，产品批号：P0012）；RIPA完全裂解液（上海Beyotime公司，产品批号：P0038）；白细胞介素-18（IL-18）ELISA试剂盒（产品批号：E-EL-M0730）、白细胞介素-1β（IL-1β）ELISA试剂盒（产品批号：E-EL-M0037）均购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司。

1.2.2 仪器

CO₂恒温培养箱（美国Thermo Fisher Scientific公司，型号：Thermo Forma 3111）；酶标检测仪（美国BioTek公司，型号：SYNERGYH1）；低温离心机（美国Scilogex公司，型号：SCILOGEX）；凝胶成像仪（上海天能科技有限公司，型号：5200）；超微量分光光度计（南京五义科技股份有限公司，型号：OneDrop）；掌上离心机（上海碧云天生物技术股份有限公司，型号：E1515）；移液器（美国Gilson公司，型号P/10/100/1000）。

1.3 易黄汤制备

易黄汤组成：炒芡实30 g，炒山药30 g，车前子12 g，白果9 g，黄柏9 g。中药饮片均由福建中医药大学附属第二人民医院中药房提供，参考文献［6］制备中药易黄汤剂，所得药物浓度为1 g/mL。

2 方　法

2.1 宫颈癌裸鼠皮下移植瘤的造模、分组及给药

将30只裸鼠随机分为对照组、模型组以及易黄汤低、中、高浓度组共5组，每组6只。对照组按照常规方式喂养，造模组以及易黄汤低、中、高浓度组参照本课题前期研究的脾虚湿热证模型构建方法和皮下移植瘤造模方法^［6］，即通过湿热环境和高脂高糖饮食以及接种CaSki细胞构建脾虚湿热型宫颈癌移植瘤裸鼠模型。当小鼠出现嗜卧懒动、易激惹、形体消瘦、进食及饮水量减少、毛发疏松粗糙、粪便时干时溏、肛温稍有增加，且小鼠右腋下可触及直径≥5 mm结节时即认为造模成功。低、中、高剂量组均按体质量40.0 mL/kg分别予含生药浓度0.25、0.50、1.00 g/mL易黄汤药液灌胃，模型组和对照组予同等剂量生理盐水灌胃，均隔日1次，干预3周。

2.2 裸鼠移植瘤体积和质量测定

所有裸鼠均于末次给药24 h后摘除眼球采血，全血不加抗凝剂于4 ℃冰箱贮存3 h，以2 000 r/min离心15 min，取血清用于后续ELISA检测；随后通过颈椎脱臼法处死裸鼠，摘取其腋下移植瘤组织，使用游标卡尺测量移植瘤的长度和宽度，计算其体积，并对移植瘤进行称重。

2.3 RT-PCR技术测定裸鼠移植瘤HPV16 E7 mRNA

上述方法取得的5组裸鼠腋下移植瘤组织，使用TRIzol试剂从样品中提取总RNA，反转录合成cDNA，95 ℃加热5～10 min，灭活反转录酶，使RNA-cDNA变性，随后迅速冰浴冷却。将配制好的包含cDNA、引物、探针、聚合酶及缓冲液的反应体系进行扩增反应，以β-actin为内参，根据荧光信号变化分析并计算HPV16 E7 mRNA相对表达量。引物序列见表1。

2.4 ELISA法检测裸鼠血清及移植瘤组织IL-18和IL-1β水平

将“2.2”项中提取的血清样本及移植瘤组织，按照试剂盒操作步骤检测IL-18和IL-1β表达水平。

2.5 Western blot检测裸鼠移植瘤组织中的AIM2、GSDMD-N和Caspase-1蛋白相对表达量

取5组裸鼠移植瘤组织（每组3个生物学重复），加入预冷的RIPA细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂PMSF）冰浴裂解后，设置低温离心机的参数为：4 ℃、12 000 r/min，离心10 min后提取上清获得总蛋白。采用BCA法测定蛋白浓度并调整至同一水平，加入上样缓冲液后置于水浴锅中95 ℃变性，上样至10% SDS-PAGE凝胶进行电泳分离。电泳结束后将蛋白转移至经甲醇激活的PVDF膜，用5%脱脂奶粉TBST封闭1 h；加入1∶500稀释的目的蛋白一抗4 ℃孵育过夜，PBST洗膜后加入1∶2 000稀释的二抗常温孵育1 h。采用ECL发光液显影并通过凝胶成像系统拍摄条带，以β-actin为内参，运用ImageJ软件计算目的蛋白条带灰度值，通过目的蛋白与β-actin灰度值的比值表示目的蛋白相对表达量。

2.6 统计学方法

采用SPSS 27.0软件进行统计学分析。计量资料符合正态分布以（\overline{x}±s）表示，两两比较采用LSD-t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结　果

3.1 5组移植瘤质量和体积的比较

与对照组比较，模型组移植瘤质量和体积明显增加（P＜0.05）；与模型组比较，低、中、高浓度组移植瘤质量和体积均降低（P＜0.05），且随着易黄汤浓度增加，移植瘤的质量和体积逐渐下降（P＜0.05）。见图1、表2。

3.2 5组HPV16 E7 mRNA转录水平比较

见表3。

3.3 5组血清中IL-18和IL-1β水平比较

见表4。

3.4 5组移植瘤组织中IL-18和IL-1β水平比较

见表5。

3.5 5组移植瘤组织AIM2、GSDMD-N和Caspase-1蛋白相对表达量比较

见图2和表6。

4 讨　论

HR-HPV持续感染是宫颈癌发生的主要因素，而HR-HPV致病过程中最重要的环节是病毒整合于宿主基因后致癌蛋白E6、E7持续表达，干扰宿主细胞的增殖，从而促进细胞异常增生和肿瘤形成，因此E6、E7是HPV病毒生命周期中重要的蛋白^［7］。它们的作用机制复杂多样：HPV E6蛋白可诱导抑癌基因p53降解，干扰细胞周期调控和DNA损伤修复；HPV E7蛋白则通过降解Rb蛋白，释放E2F转录因子，促进细胞提前进入S期，进而诱导细胞异常增殖^［8］。此外，HPV E6/E7蛋白也可通过激活端粒酶、调控多种细胞周期调节因子等方式促进细胞癌变^［9］。特别是HPV E7可通过上调组蛋白去乙酰化酶SIRT1表达，改变组蛋白修饰状态，从而促进宫颈癌增殖和侵袭能力^［10］，因此测定HPV E7表达可反映HPV的致病力。故本课题通过检测HPV16 E7 mRNA表达水平可反映易黄汤对裸鼠皮下移植瘤中HPV的影响。本研究结果显示：与正常条件喂养的裸鼠比较，脾虚湿热状态可使HPV16阳性宫颈癌裸鼠皮下移植瘤体积和质量明显增加，移植瘤中HPV16 E7 mRNA水平明显升高，提示脾虚湿热可促进HPV相关宫颈病变进展，这与本课题组之前的研究结果^［6，11］相符。

中医古籍无“HPV感染”“宫颈癌”病名，据其“带下臭秽、癥块积聚”等临床表现，可将其归于“带下病”“癥瘕”等范畴，其中脾虚湿热证为常见证型。中医学认为，“带下病”多因湿邪为患，湿性黏滞胶着，故起病隐缓，病程缠绵难愈，湿郁久化热，湿热搏结、互为因果，共同影响疾病进展^［12］。此过程与HR-HPV感染相关宫颈病变的病程特征极为相似。宫颈病变初始多为下焦湿热邪侵，病机核心在于湿热内蕴。若邪气久留不退，渐致脏腑功能失调，则出现由实致虚的病理演变，这也是HR-HPV持续感染并进一步向宫颈癌转化的关键机制。“邪之所在，皆为不足”，脏腑功能失调的根本当责脾胃。脾胃为后天之本，运化水谷精微，化生气血津液，是维持人体正气的关键。脾胃功能失调，机体正气不足，病势由表及里、由浅入深，逐渐形成局部“瘀、毒、虚”互结的癌前微环境，最终酿生癌毒^［13］。

针对HR-HPV持续感染所致的宫颈病变，临床多从湿、热、虚三方面入手治疗，治以清热祛湿、健脾扶正，攻补兼施，从而达到祛除病邪、恢复正气的治疗目标。本实验结果显示：与模型组比较，易黄汤呈浓度依赖性降低裸鼠皮下移植瘤体积和质量以及HPV16 E7 mRNA转录水平，与本课题组前期临床研究结果^［4］一致。有报道证实湿热证患者体内细胞焦亡因子IL-18与湿热程度存在正相关^［14］，同时本实验也发现：与对照组比较，模型组裸鼠移植瘤中AIM2、GSDMD-N、Caspase-1蛋白及IL-18、IL-1β水平升高，易黄汤主治脾虚湿热证之带下病，故考虑易黄汤的作用机制可能与细胞焦亡通路有关。

细胞焦亡是一种由Gasdermin家族蛋白（GSDMs）介导的促炎性程序性细胞死亡方式，可分为经典与非经典途径^［15］。其中经典途径由炎性小体激活启动^［16］。炎性小体作为一种多蛋白复合物，主要包括模式识别受体（PRR）、Caspase-1前体及衔接蛋白ASC。常见的PRR如黑色素瘤缺乏因子2（AIM2），可识别病毒双链DNA（例如HPV）并触发炎性小体组装，进而激活Caspase-1，诱导细胞焦亡^［17］。GSDMs是执行细胞焦亡的关键成孔蛋白，包括GSDMA-E及DFNB59六个成员^［18-19］，其中GSDMD作为重要底物参与调控过程^［20］。活化的Caspase-1可切割GSDMD，释放其N端结构域（GSDMD-NT），并在细胞膜上形成10～14 nm孔隙，导致细胞渗透压失衡、水肿破裂，最终死亡^［21］。同时，IL-1β和IL-18等炎性因子释放至胞外，加剧局部炎症反应^［19］。研究表明，细胞焦亡在肿瘤发展中具有双重作用：一方面可通过炎性小体激活促使肿瘤细胞死亡，例如AIM2介导的焦亡有助于抑制HPV阳性宫颈癌进展^［22］；另一方面，焦亡引发的炎症微环境也可能促进肿瘤生长与转移^［23］。

本实验结果显示，模型组裸鼠移植瘤中AIM2、GSDMD-N、Caspase-1蛋白及IL-18和IL-1β水平均较对照组升高，提示脾虚湿热状态可轻度激活细胞焦亡，可能与湿热环境及高脂高糖饮食导致的持续低度炎症有关，这种微环境可能促进肿瘤生长，故模型组裸鼠移植瘤质量和体积、HPV E7 mRNA水平均高于正常组。经易黄汤干预后，裸鼠脾虚湿热程度得到改善，瘤组织中焦亡通路蛋白（AIM2、GSDMD-N、Caspase-1）及IL-18和IL-1β水平进一步升高，而血清中IL-18和IL-1β水平却较模型组下降，呈现组织与系统水平的不同趋势，同时移植瘤质量和体积及HPV E7 mRNA水平显著下降。因此，推测易黄汤在肿瘤组织内可能通过增强AIM2/GSDMD-N/Caspase-1通路促进癌细胞焦亡，释放IL-18和IL-1β，激活抗肿瘤免疫；而在全身层面，则通过调节免疫稳态、减轻脾虚湿热相关的系统性低度炎症，从而降低血清炎症因子水平。这种“局部强化、系统平衡”的双向作用，可能是易黄汤抑制肿瘤生长，降低HPV载量，同时改善整体状态的重要机制。

《傅青主女科》之易黄汤，充分体现了其“清补兼施”的特色，方中祛邪部分有清热燥湿之黄柏，利湿通淋之车前子，二者构成“通利三焦”之药对，促使湿热邪毒外透，故易黄汤可使移植瘤焦亡因子IL-18、IL-1β水平升高，促进癌细胞程序性死亡；车前子之滑利、黄柏之苦降共同构建“邪有出路”的代谢途径。实验结果还显示裸鼠血清焦亡因子IL-18、IL-1β水平随着易黄汤干预浓度的升高逐渐降低。考虑易黄汤具有“扶正固本”的双向调控作用，其可能是通过抑制全身过激免疫反应，以恢复机体的动态平衡。方中白果之收敛、山药之升清与车前子通利降浊形成药势循环，“升降相因”，形成动态平衡，阴阳自和，维持了机体的免疫稳态。血清因子的正常化标志着机体恢复“阴平阳秘”状态，体现了“以平为期”的治疗思路。

本研究发现，脾虚湿热状态可诱导裸鼠宫颈癌移植瘤中细胞焦亡信号通路出现有限激活，表现为炎症小体少量聚集及IL-18、IL-1β等焦亡因子轻度升高，进而形成有利于肿瘤生长的微环境，促进移植瘤质量和体积增加，并上调HPV E7表达。而易黄汤通过清热祛湿、健脾扶正作用，强烈激活AIM2/GSDMD-N/Caspase-1介导的细胞焦亡，直接杀伤宫颈癌细胞，抑制移植瘤生长，并降低HPV E7水平。然而，如何合理调控易黄汤诱导的焦亡水平以促进肿瘤消退而非促瘤微环境形成，以及易黄汤是否通过其他信号通路使血清IL-18、IL-1β水平恢复正常，仍有待进一步研究。

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基金资助

福建省卫生健康中青年骨干人才培养项目(2023GGA074)