基于肠HMGB1/NF-κB/NLRP3通路探讨桃核承气汤改善慢性肾衰竭大鼠微炎症状态的作用机制

摘要

目的 基于肠HMGB1/NF-κB/NLRP3通路探讨桃核承气汤改善慢性肾衰竭（CRF）大鼠微炎症状态的作用机制。 方法 将80只Wistar大鼠按照随机数字表法分为正常组15只、假手术组15只和造模组50只。造模组通过2次手术完成5/6肾切除，假手术组同期进行2次手术，仅剥离双肾被膜及分离肾蒂，不切除肾实质，正常组不做处理。第2次术后第3周，各组大鼠行尾静脉采血，检测血清肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）水平。与正常组和假手术组比较，造模组血清Scr和BUN含量均升高（P＜0.01），提示造模成功。造模组造模成功38只，死亡12只。将造模组大鼠按照随机数字表法分为模型组19只和桃核承气汤组19只。第2次术后4周开始干预，桃核承气汤组按10 mL/（kg·d）予以含生药浓度为0.42 g/mL桃核承气汤灌胃，正常组、假手术组和模型组分别予以等剂量生理盐水灌胃，连续干预8周。采用全自动生化分析仪检测血清Scr和BUN含量；采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测血清相关炎症因子［白细胞介素（IL）-6、IL-12、IL-1β、IL-18和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）］含量；HE染色及光学显微镜观察肾、肠组织形态；Western blot和实时荧光定量（qPCR）法分别检测4组肠组织高迁移率族蛋白B1（HMGB1）、Toll样受体4（TLR4）、髓样分化因子88（MyD88）、核转录因子-κB（NF-κB）和核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）的蛋白表达量及其mRNA相对表达水平。 结果 与正常组和假手术组比较，模型组血清Scr和BUN含量均升高（P＜0.01），血清IL-6、IL-12、IL-1β、IL-18和TNF-α含量均升高（P＜0.01），光学显微镜下可见肾组织纤维化及炎性损伤明显，肠黏膜结构破坏严重，肠组织HMGB1、TLR4、MyD88、NF-κB和NLRP3的蛋白表达量及mRNA相对表达水平均升高（P＜0.01）；与模型组比较，桃核承气汤组血清Scr和BUN含量均下降（P＜0.01），血清IL-6、IL-12、IL-1β、IL-18和TNF-α的含量均下降（P＜0.01），光学显微镜下可见肾、肠组织病理损伤较模型组明显改善，肠组织HMGB1、TLR4、MyD88、NF-κB和NLRP3的蛋白表达量及mRNA相对表达水平均下降（P＜0.01）。 结论 桃核承气汤可修复CRF大鼠肠黏膜屏障，改善微炎症状态，减轻肾损害，其机制与调控肠道HMGB1/NF-κB/NLRP3信号通路密切相关。

Graphical abstract

关键词

慢性肾衰竭 / 桃核承气汤 / 肠-肾轴 / HMGB1/NF-κB/NLRP3 / 微炎症状态

慢性肾衰竭（chronic renal failure，CRF）是各种慢性肾脏疾病（chronic kidney disease，CKD）持续进展至某一特定阶段的最终结果，其临床表现呈现为一系列综合征，主要以体内代谢产物蓄积、水电解质失衡、体液酸碱平衡异常及肾脏内分泌功能严重失调为特征^［1］。目前西医治疗CRF以肾脏替代治疗为主，但受限于其高昂的卫生经济学负担及医疗资源分布不均，导致全球范围内每年超过130万人死亡^［2］。中医药在延缓CRF进展、改善临床症状、提高生存质量等方面具有独特优势。CRF病属下焦，长期正气损耗，脏腑阴阳衰败，浊毒瘀血胶结于络脉，此与桃核承气汤证下焦蓄血之病机相符。近年发现的“肠-肾轴”相关理论有望为CRF的治疗提供新靶点、新思路^［3-4］。课题组前期研究证实，桃核承气汤能显著减轻CRF大鼠肾脏微炎症状态，其机制涉及对肾脏局部相关信号通路的调控^［5-7］；然而，桃核承气汤是否通过干预肠道信号通路进而发挥肾保护作用，目前尚缺乏深入研究。鉴于此，本研究基于“肠-肾轴”理论，探讨桃核承气汤通过调控肠黏膜屏障HMGB1/NF-κB/NLRP3信号通路，改善CRF微炎症状态的具体作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物

SPF级7周龄健康雄性Wistar大鼠80只，初始体质量（200±20）g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2022-0004，实验动物使用许可证号：SYXK（闽）2020-0002，饲养于福建中医药大学实验动物中心。大鼠按每日常规标准供给饮用水和饲料，饲养环境温度（24±2）℃，相对湿度40%～70%，昼夜周期12 h/12 h。本研究已通过福建中医药大学实验动物伦理委员会审批（审批号：FJTCM IACUC 2023075）。

1.2 实验药物

桃核承气汤组成：桃仁12 g，桂枝6 g，炙甘草6 g，生大黄12 g，芒硝（冲服）6 g。中药饮片从福建中医药大学附属第三人民医院购入，用密封袋密封后，保存于4 ℃冰箱中。注射用青霉素钠（重庆新吉亨药业股份有限公司，产品批号：01603823，规格：160 万U/支）。

1.3 实验试剂

白细胞介素（IL）-6酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（货号：JL20896）、IL-12 ELISA试剂盒（货号：JL20874）、IL-1β ELISA试剂盒（货号：JL20884）、IL-18 ELISA试剂盒（货号：JL20882）、肿瘤坏死因子-α（TNF-a） ELISA试剂盒（货号：JL10484）均购自上海将来实业股份有限公司；高迁移率族蛋白B1（HMGB1）抗体（货号：10829-1-AP）、β-肌动蛋白（β-actin）抗体（货号：66009-1-Ig）、鼠二抗（货号：PR30009）均购自武汉三鹰生物技术有限公司；核转录因子-κB（NF-κB）抗体（货号：YM8209）、Toll样受体4（TLR4）抗体（货号：YN5450）、髓样分化因子88（MyD88）抗体（货号：YT2928）、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）抗体（货号：YM8024）均购自美国Immunoway苏州分公司；极超敏化学发光试剂盒（货号：ED0015-A）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（货号：EC0001-A）、RIPA裂解液（货号：EA0002）、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（货号：EC0003）、PVDF膜（货号：ED0004）、预染蛋白marker（货号：AJ0101）均购自山东思科捷生物技术有限公司；通用型彩色示踪染料法SYBR Green qPCR预混液（2×）（货号：G3326-01）、耐高温全预混第一链cDNA合成试剂盒（一步法去除gDNA）（货号：G3337-100）、组织RNA稳定保存液（货号：G3019-1.2 mL）、10% PAGE彩色（红色）凝胶超快速配制试剂盒（货号：G2043-50T）均购自武汉赛维尔生物科技有限公司。

1.4 实验设备

高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司，型号：5417R）；石蜡切片机（德国Leica公司，型号：RM2235）；正置荧光显微镜［日本尼康映像仪器销售（中国）有限公司，型号：Nikon Eclipse C1］；电泳仪（美国Bio-Rad公司，型号：PowerPac Basic）；凝胶成像分析系统（美国Bio-Rad公司，型号：721BR04812）；实时荧光定量PCR仪（美国Applied Biosystems公司，型号：ABI7500）；RNA逆转录仪（中国亚光医用公司，型号：S1000 Thermal Cycler）。

2 实验方法

2.1 药物制备

2.1.1 桃核承气汤药液制备

将桃核承气汤中桃仁、桂枝、炙甘草、生大黄放入陶瓷煎药锅中，加入8倍量纯水（288 mL），室温浸泡30 min，浸泡后加热至沸腾，保持微沸30 min，纱布过滤，保存药液；于药渣中再加入6倍量纯水（216 mL），煮沸后微沸20 min，同法过滤；合并2次药液，再次过滤，将滤液转移至旋转蒸发仪浓缩至约85 mL，取芒硝6 g加入总药液溶解混匀，再次过滤后，补加纯水至总药液100 mL，搅拌均匀，制备成含生药浓度为0.42 g/mL的桃核承气汤水煎液，4 ℃冷藏保存备用。

2.1.2 注射用青霉素钠制备

在造模期间，根据实际需要量现场制备青霉素钠注射液。使用生理盐水进行调配，使其最终浓度达到1.6×10⁴ U/mL。

2.2 分组、造模与鉴定

经1周标准化环境适应后，80只雄性Wistar大鼠按照随机数字表法分为正常组15只、假手术组15只和造模组50只。正常组常规饲养，不做任何手术干预。造模组遵循《医药实验动物模型：制作与应用》^［8］制备方法，采用分阶段5/6肾实质切除法。大鼠经腹腔注射1%戊巴比妥钠4 mL/kg完成麻醉，密切监测呼吸状态，取俯卧位固定，切除2/3左肾实质；术后按照5 mL/kg剂量，连续3天腹腔注射青霉素钠预防感染；术后第7天，同法麻醉后切除全右肾，术后抗感染处理同前。假手术组同期进行2次手术操作，仅剥离双肾被膜及分离肾蒂，不切除肾实质。第2次术后第3周，各组大鼠行尾静脉采血，检测血清肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）水平，判断造模情况。见表1。与正常组和假手术组比较，造模组血清Scr和BUN含量均升高（P＜0.01），提示造模成功。造模过程中，造模组共剔除死亡大鼠12只（麻醉过量2只，大出血1只，术后感染1只，严重创伤未愈8只）。第2次术后第4周，将造模组大鼠38只再次按照随机数字表法分为模型组19只和桃核承气汤组19只。

2.3 给药干预

第2次术后第4周开始给药干预，桃核承气汤组按10 mL/（kg·d）予以含生药浓度为0.42 g/mL桃核承气汤灌胃，正常组、假手术组和模型组均予以等剂量生理盐水灌胃，每日9：00单次给药，持续干预8周。每周对大鼠进行称重1次，根据最新的体质量调整灌胃体积。干预过程中共有6只大鼠死亡。其中，灌胃不当导致死亡2只（正常组、假手术组各1只），因肾衰竭死亡4只（模型组1只、桃核承气汤组3只）。

2.4 取材

灌胃8周后，按大鼠体质量给予腹腔注射1%戊巴比妥钠4 mL/kg麻醉，麻醉后采集腹主动脉血液，取3 mL全血样本置于普通血清试管，在20 ℃恒温环境静置，在4 ℃、3 000 r/min下离心10 min，吸取上层血清，于-80 ℃冰箱保存，分别用于肾功能及ELISA检测。采血后立即采集大鼠左肾组织（模型组和桃核承气汤组为左残肾，正常组和假手术组取左肾对应部位），沿肾脏长轴纵切，取约1 cm×1 cm×0.5 cm大小肾组织1份，于4%多聚甲醛溶液固定，用于光镜观察。肾组织采集结束，立即收集大鼠回肠末端和结肠近端组织各3份，每份长度1 cm，用生理盐水冲洗肠腔至冲洗液无杂质，其中2份标本分装于2个冻存管中，并于-80 ℃冰箱保存，分别用于Western blot和qPCR检测；另1份于4%多聚甲醛固定，用于光镜观察。

2.5 观察指标

2.5.1 一般情况

从给药第1天开始，每日观察记录大鼠神经行为学指征、排泄功能、被毛情况及摄食量变化，每周进行1次体质量检测。

2.5.2 肾功能检测

采用全自动生化分析仪检测血清Scr和BUN含量。

2.5.3 ELISA检测血清相关炎症因子含量

严格按照试剂盒说明书，采用ELISA法检测大鼠血清中IL-6、IL-12、IL-1β、IL-18和TNF-α含量。

2.5.4 肠、肾组织HE染色及光学显微镜观察

将固定于4%多聚甲醛的肠、肾组织修整后，分别置于自动脱水系统，按梯度依次乙醇溶液脱水、二甲苯透明与石蜡包埋。用石蜡切片机，切成每片厚度2 μm的薄片，贴附于载玻片上，放于60 ℃恒温烘箱中烘干4 h，进行HE染色，中性树胶封片，采用光学显微镜观察组织形态病理学变化（肠组织×200，肾组织×400），并采集典型视野图像。

2.5.5 Western blot检测肠道组织通路相关蛋白表达量

提取各组肠组织总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，经蛋白变性、SDS-PAGE电泳，转移至PVDF膜上后TBST溶液清洗，室温下用快速封闭液封闭1 h。弃去封闭液后立即加入一抗，HMGB1（1∶1 000）、TLR4（1∶1 000）、MyD88（1∶1 000）、NF-κB（1∶1 000）、NLRP3（1∶1 000）和β-actin（1∶10 000），于4 ℃水平摇床孵育12 h。TBST溶液清洗，加入二抗（TBST 1∶5 000稀释），室温振荡孵育（25 ℃，30 min，40 r/min）。TBST溶液清洗，暗室中滴加ECL发光剂于膜上，经曝光、显影与定影，采用Quantity One图像分析系统检测各目的蛋白光密度值，以β-actin为内参，对比分析各目的蛋白表达量。

2.5.6 qPCR检测肠组织通路相关因子的mRNA相对表达水平

提取肠组织总RNA，分光光度计法检测RNA浓度与纯度，选取OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.8～2.0之间的样本。配制逆转录反应液，进行逆转录合成cDNA。采用SYBR Green法进行HMGB1、TLR4、MyD88、NF-κB、NLRP3 mRNA扩增，反应体系20 μL（其中SYBR qPCR预混液10 μL，前引物0.5 μL，后引物0.5 μL，cDNA 1 μL，超纯水8 μL），扩增反应条件如下：① 95 ℃预变性30 s；② 95 ℃变性5 min，60 ℃退火10 s，循环40次；③ 60 ℃延伸30 s。相关基因引物序列由福州尚亚生物技术有限公司设计。见表2。以β-actin为内参，采用2^-ΔΔCT法计算目的基因的相对表达量。

2.6 统计学方法

采用SPSS 26.0软件进行数据分析。计量资料符合正态分布以（\overline{x}±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较方差齐采用LSD-t法，方差不齐采用Games-Howell法。P＜0.01为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 4组一般情况比较

正常组及假手术组大鼠精神状态正常，肢体活动灵敏，反应迅速，被毛茂密润泽，爪甲外周颜色淡红，饮食及饮水量稳定，排便规律且粪质成形，体质量稳定增长；模型组大鼠精神萎靡，四肢倦怠乏力，活动减少，弓背姿势，反应迟缓，被毛稀疏易脱、枯槁少泽，爪甲外周颜色暗淡，饮食较少，饮水量增加，尿量增多，部分大鼠出现尿血，大便稀溏，甚至体质量下降，伤口恢复较慢；桃核承气汤组大鼠精神欠佳，反应一般，活动自如，少部分呈弓背姿势，被毛蓬松，爪甲色淡，饮食尚可，部分大鼠尿量增多，大便偏稀，体质量略增加，伤口恢复较快。

3.2 4组血清Scr和BUN含量比较

见表3。

3.3 4组血清相关炎症因子含量比较

见表4。

3.4 4组肾、肠组织形态比较

3.4.1 4组肾组织形态比较

正常组和假手术组肾小球结构完整，毛细血管丛结构清晰，内皮细胞、系膜细胞与足细胞分布均匀，无明显系膜基质增生，肾小管上皮细胞排列整齐，管腔形态规则，未见扩张、萎缩或蛋白管型，肾间质未见水肿、纤维化及炎性细胞浸润；模型组出现显著的肾小球固缩特征，表现为系膜基质沉积增加，基底膜增厚，毛细血管丛结构不清，肾小管扩张明显，肾间质纤维增生和密集的炎性细胞浸润；与模型组比较，桃核承气汤组肾小球轻度固缩，肾小球系膜基质增生和基底膜增厚幅度均明显降低，肾小管轻微扩张，偶见肾间质纤维增生，少量炎症细胞浸润。见图1。

3.4.2 4组回肠组织形态比较

正常组与假手术组回肠黏膜绒毛致密紧凑，无脱落、倒伏，黏膜结构完整，层次清晰；模型组可见绒毛脱落倒伏，黏膜上皮细胞破坏，杯状细胞减少，腺体排列紊乱，黏膜及黏膜下层有大量炎症细胞浸润；与模型组比较，桃核承气汤组绒毛脱落倒伏均有改善，黏膜层次结构基本清晰，炎症细胞浸润减少，杯状细胞与腺体基本正常。见图2。

3.4.3 4组结肠组织形态比较

正常组与假手术组结肠黏膜完整，层次分明，上皮层、固有层、黏膜肌层分布均匀、结构清晰，无水肿，炎症细胞浸润少，杯状细胞排列整齐，腺体数目正常；模型组可见黏膜及黏膜下层水肿，大量炎症细胞浸润，上皮细胞脱落，杯状细胞和腺体数目减少，黏膜隐窝变形，潘氏细胞化生；与模型组比较，桃核承气汤组上皮细胞、杯状细胞、腺体排列均较规整，炎症细胞浸润减少，上皮细胞偶见脱落，黏膜隐窝偶有变形，偶见潘氏细胞化生。见图3。

3.5 4组肠组织通路相关蛋白表达量比较

见图4和图5。

3.6 4组肠组织通路相关因子mRNA相对表达水平比较

见表5。

4 讨　论

CRF的进展机制复杂，近年“肠-肾轴”理论的提出为理解CRF并发症及系统性炎症提供了新视角。BHARGAVA等^［9］研究证实，肠道微生态失衡与肾功能恶化之间存在双向恶性循环。本研究基于这一前沿发现，结合中医“从肠治肾”理论，深入探讨了桃核承气汤通过调控肠道HMGB1/NF-κB/NLRP3信号通路干预CRF微炎症状态的作用机制。

4.1 “肠-肾轴”与中医“从肠治肾”理论契合

中医理论认为，津液的生成与输布需要肾与肠腑共同参与。生理状态下，肾阴濡润肠道以助传导，肾阳温煦脏腑以促运化，二者共司水液代谢。CRF病机关键在于肾元亏虚致气化失司，湿浊毒邪不得下行而滞留体内。若肠腑通降失常，则浊毒内伏，进一步耗伤肾气，这与现代医学的“肠屏障受损致肠源性毒素入血”高度一致^［10］。有临床研究发现，从肠治肾能降低CKD患者肠源性毒素，改善微炎症状态，修复肠道黏膜免疫损伤，进而延缓肾功能进展^［11-12］。因此，“从肠治肾”不仅符合“六腑以通为用”的传统治则，更契合临床实际。

课题组前期研究发现：桃核承气汤能减轻CRF大鼠肾微炎症状态，改善肾纤维化，延缓CRF发展进程^［13］，其机制可能与调控肾TGF-β1/Smad、Wnt/β-catenin及NLRP3/Caspase-1通路有关^［5-7］。本研究将治疗靶点聚焦于肠腑，基于肠-肾轴理论，探索桃核承气汤干预CRF的肠道途径。前期大量研究均证实桃核承气汤有明确的治疗CRF作用。因此，本研究未设置阳性对照组，主要进行该方的疗效机制探讨。另外，本研究在药物干预阶段，桃核承气汤组因肾衰竭死亡3只，这是在以往实验中未出现过的，考虑主要与动物的个体差异相关^{［5-7，13］}。

4.2 HMGB1/NF-κB/NLRP3通路影响CRF微炎症状态

微炎症状态在CRF患者中普遍存在，以循环系统中炎症因子水平升高为主要表现，可导致CRF病情加速进展。HMGB1/NF-κB/NLRP3通路作为炎症反应调控途径中的重要一环，维持了CRF微炎症的持续状态^［14-16］。

本研究发现，模型组回肠组织绒毛脱落倒伏，黏膜上皮细胞破坏，杯状细胞减少，腺体排列紊乱，黏膜及黏膜下层有大量炎症细胞浸润；结肠组织黏膜及黏膜下层水肿，大量炎症细胞浸润，上皮细胞脱落，杯状细胞和腺体数目减少，黏膜隐窝变形，潘氏细胞化生，说明CRF导致了肠道黏膜屏障损伤。与正常组和假手术组比较，模型组肠组织HMGB1、TLR4、MyD88、NF-κB和NLRP3的蛋白表达量及其mRNA相对表达水平均升高，说明肠组织的损伤，可能引起坏死细胞释放HMGB1，与TLR4相结合，激活MyD88，从而触发下游的NF-κB通路，导致NLRP3炎症小体活化。模型组血清IL-6、IL-12、IL-1β、IL-18和TNF-α等炎症因子的含量，相较正常组和假手术组均升高，说明肠道HMGB1/NF-κB/NLRP3通路的激活，引起了促炎细胞的成熟，导致大量炎症因子分泌。这些炎症因子释放入血，加重了肾的微炎症状态，是导致肾功能损伤和肾组织形态结构改变的重要原因。模型组血清Scr和BUN含量较正常组和假手术组升高，模型组肾组织出现肾小球固缩、基底膜增厚、肾小管扩张明显、间质纤维增生和密集的炎性细胞浸润等病理改变，均说明“肠-肾轴”存在双向关联作用。一方面，CRF造成肠道黏膜损伤，激活肠HMGB1/NF-κB/NLRP3通路，释放大量炎症因子；另一方面，这些炎症因子又可加重肾微炎症状态，促进肾损害，从而加速CRF进程。

4.3 桃核承气汤对CRF大鼠肠道HMGB1/NF-κB/NLRP3通路的影响

桃核承气汤出自《伤寒论》，由桃仁、桂枝、炙甘草、生大黄、芒硝组成。方中大黄、桃仁可抗炎、抗纤维化^［17-18］；大黄、芒硝合用可修复肠黏膜屏障，改善肠道微循环^［19］；桂枝、甘草亦可抗炎杀菌^［20-22］。本研究旨在通过桃核承气汤通腑泄浊、逐瘀通经的功能，使浊毒、瘀血之邪有出路，以到达保护肠道、改善肾纤维化的作用。

本研究发现，与模型组相比，桃核承气汤组血清Scr与BUN含量及相关炎症因子含量均下降，说明桃核承气汤能改善CRF大鼠肾功能，其机制与降低血清炎症因子水平、减轻机体微炎症状态有关。光学显微镜观察发现，与模型组相比，桃核承气汤组肾小球结构及肠组织黏膜屏障的损伤均减轻，说明桃核承气汤的疗效机制可能与肠肾双靶点相关。此外，与模型组比较，桃核承气汤组肠组织HMGB1、TLR4、MyD88、NF-κB和NLRP3的蛋白表达量及其mRNA相对表达水平均降低，提示桃核承气汤可能通过修复肠黏膜屏障，减少坏死细胞释放HMGB1，从而抑制肠道HMGB1/NF-κB/NLRP3通路，使得该通路相关因子的激活和释放均减少，在一定程度上阻滞促炎细胞成熟，从而减少IL-6、IL-12、IL-1β、IL-18和TNF-α等炎症因子释放入血，进而减轻肾微炎症状态，改善肾功能，减轻肾纤维化，延缓CRF进程。

综上，桃核承气汤可修复CRF大鼠肠黏膜屏障，改善微炎症状态，降低血清Scr和BUN水平，有效减少循环中的炎症介质，减轻肾损害，延缓CRF病程，其机制与调控肠道HMGB1/NF-κB/NLRP3信号通路密切相关。未来研究可采用通路抑制剂或者干预验证，进一步揭示该通路的内在机制。

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基金资助

福建省自然科学基金面上项目(2023J01867)

福建省直属单位教育科研专项资金资助项目（X2023009-财政专项,X2024001-财政专项）

福建中医药大学基础类学科科研提升计划项目(XJC2022002)