肝宝胶囊含药血清对巨噬细胞代谢重编程和Anx A5/PKM2通路的影响

摘要

目的 观察肝宝胶囊（GBC）含药血清对巨噬细胞代谢重编程和膜联蛋白 A5（Anx A5）/丙酮酸激酶 M2（PKM2）通路的影响。 方法 24只SD雄性大鼠适应性喂养7 d后，随机分为空白对照组、GBC组和双环醇片组各8只，分别予蒸馏水、1.47g/（kg·d）GBC、200 mg/（kg·d）双环醇片灌胃，制备含药血清。RAW264.7细胞随机分为空白对照组，模型组，1.25%、2.5%、5% GBC含药血清组和双环醇片含药血清组。分别加入：10%空白血清培养基；含10 ng/mL LPS和10 ng/mL IFN-γ的10%空白血清培养基；含10 ng/mL LPS和10 ng/mL IFN-γ的1.25%、2.5%、5% GBC含药血清，血清浓度不足10%的用空白血清补齐；含10 ng/mL LPS和10 ng/mL IFN-γ的10%双环醇片含药血清。检测细胞上清液中白细胞介素1β（IL-1β）含量，检测细胞外酸化率（ECAR）、氧消耗率（OCR）、ATP、乳酸脱氢酶（LDH）和乳酸（LD）水平，Western blot检测细胞中Anx A5、PKM2、p-PKM2和缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）蛋白表达水平。 结果 与空白对照组比较，模型组细胞上清液中IL-1β含量升高（P＜0.05），细胞OCR和ATP水平及Anx A5蛋白表达均下降（P＜0.05），细胞ECAR、LDH、LD水平及HIF-1α、p-PKM2蛋白表达均升高（P＜0.05）。与模型组比较，GBC各含药血清组和双环醇片含药血清组细胞上清液中IL-1β含量均下降（P＜0.05），细胞OCR、ATP水平均升高（P＜0.05），细胞ECAR、LDH、LD水平及HIF-1α、p-PKM2蛋白表达均下降（P＜0.05），2.5%、5% GBC含药血清组和双环醇片含药血清组Anx A5蛋白表达均升高（P＜0.05）。与1.25% GBC含药血清组比较，2.5%含药血清组细胞上清液中IL-1β含量较低（P＜0.05），细胞ATP水平较高（P＜0.05），细胞LDH水平较低（P＜0.05）；5% GBC含药血清组细胞上清液中IL-1β含量较低（P＜0.05），细胞OCR和ATP水平均较高（P＜0.05），细胞ECAR和LDH水平均较低（P＜0.05）。 结论 GBC含药血清可能通过调控Anx A5/PKM2通路干预巨噬细胞代谢重编程，抑制巨噬细胞的促炎作用。

Graphical abstract

关键词

脂肪肝 / 肝宝胶囊 / Anx A5/PKM2通路 / 代谢重编程 / 巨噬细胞

脂肪肝是以肝内脂肪过度堆积为特征的疾病，与代谢紊乱和炎症等密切相关，其患病率逐年上升^［1-2］。肝巨噬细胞在脂肪肝疾病进展中起关键作用^［3-4］，其中促炎M1表型巨噬细胞的激活依赖糖酵解快速供能^［5］。研究表明，通过调控膜联蛋白A5（Anx A5）/丙酮酸激酶M2（PKM2）通路可促使巨噬细胞代谢从糖酵解转向氧化磷酸化，实现代谢重编程，从而抑制巨噬细胞引发的炎症反应，为脂肪肝治疗提供了新思路^［6］。

中医学将脂肪肝归为“肝胀”“肝癖”等范畴，其发生、发展与痰、瘀、湿等因素密切相关，初期为湿、热、痰浊阻滞体内；中期为肝郁脾虚，气虚血瘀；后期多久病及肾，致脾肾阳虚或肝肾阴虚，肝脾肾俱损^［7］。肝宝胶囊（GBC）是福建医科大学孟超肝胆医院院内制剂（批准文号：闽药制字Z04107020），具有清热利湿、消食降脂、润肺化痰之功效，用于治疗脂肪肝及急、慢性肝炎之肝热积滞证^［8］。前期研究表明，GBC可通过调节多种代谢途径发挥保肝作用^［9］。本研究通过观察GBC含药血清对巨噬细胞代谢方式和Anx A5/PKM2通路的影响，进一步探讨GBC的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物

5周龄SPF级健康雄性SD大鼠24只，体质量（180±20） g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2022-0004。动物饲养于福建中医药大学医学实验动物中心，实验动物使用许可证号：SYXK（闽）2023-0004，饲养期间自由摄食饮水。本研究获福建医科大学动物伦理委员会审核批准，审批号：IACUCFJMU2023-Y-0866。

1.2 实验药物

GBC组方：鲜青果2 500 g，虎杖2 000 g，麦芽1 600 g，莱菔子1 250 g，谷芽800 g。经福建医科大学孟超肝胆医院制剂中心制备成胶囊1 000粒（福建医科大学孟超肝胆医院，生产批号：20241003，规格0.34 g/粒）^［8］。准确称取GBC粉末5.88 g，加入40 mL超纯水，充分混匀，配制成浓度为0.147 g/mL的GBC混悬液。双环醇片（北京协和药厂有限公司，生产批号：240605，规格25 mg/片）。取双环醇片32片，总量0.8 g，充分研磨成细粉后，加入40 mL超纯水，振荡混匀，配制成浓度为0.02 g/mL的双环醇片混悬液。

1.3 细胞系

小鼠单核巨噬细胞白血病细胞（RAW264.7），购自赛百慷（上海）生物技术股份有限公司，货号：iCell-m047。

1.4 实验试剂

特级胎牛血清（货号：C04001-500）、青链双抗溶液（货号：C3420-0100）均购自上海逍鹏生物科技有限公司；LPS（货号：RPM0001）、IFN-γ（货号：RP01070）均购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；乳酸脱氢酶（LDH）测试盒（货号：A020-2）、乳酸（LD）测试盒（货号：A019-2-1）均购自南京建成生物工程研究所；白细胞介素-1β（IL-1β）ELISA试剂盒（货号：EK0394）、100×广谱磷酸酶抑制剂混合物（货号：AR1183）、蛋白酶抑制剂PMSF（货号：AR1192）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（货号：AR0146）均购自武汉博士德生物工程有限公司；氧消耗率（OCR）荧光法测试盒（货号：E-BC-F068）、细胞外酸化率（ECAR）荧光法测试盒（货号：E-BC-F069）均购自美国Amresco公司；ATP检测试剂盒（货号：S0026）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（货号：P0010）、Western及IP细胞裂解液（货号：P0013）、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（5×）（货号：P0015L）、SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒（货号：P001AC）均购自上海碧云天生物技术有限公司；Anti-Anx A5 Antibody（货号：CPA3515）、Anti-Beta-actin Antibody（货号：CPA9100）、Goat Anti-Rabbit lgG（H&L）-HRP（货号：CSA2115）、Goat Anti-Mouse lgG（H&L）-HRP（货号：CSA2018）均购自苏州康何欣生物科技有限公司；PKM2 Rabbit pAb（货号：321004）、缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）Rabbit pAb（货号：340462）均购自成都正能生物技术有限责任公司；DMEM培养基（武汉普诺赛生命科技有限公司，货号：PM150210）；核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司，货号：KGB5302-100）；Meilunbio^®飞克特超敏ECL发光液（大连美仑生物科技有限公司，货号：MA0186-1）；PKM2（Phospho Tyr105）Rabbit pAb（美国Immunoway公司，货号：YP1444）。

1.5 主要仪器

迷你掌中离心机（型号：LX-500）、摇床（型号：ZD9550）、干式恒温器（型号：GL-1800）均购自海门其林贝尔仪器制造有限公司；化学发光成像系统（型号：ChemiDoc XRS+）、基础电泳仪电源（型号：PowerPAC Basic）、垂直电泳槽（型号：Mini-PROTEAT Tetra）均购自美国BioRad公司；低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司，型号：KDC-12）；电热恒温培养箱（上海一恒科技有限公司，型号：DHP-9052）；体视显微镜（重庆奥特光学仪器有限公司，型号：SZ760）；多功能酶标仪（瑞士TECAN公司，型号：Infinite 200 PRO）；高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司，型号：Centrifuge 5418）；旋转混匀器（美国OUAUS公司，型号：VXMPAL）；MiliQ超纯水系统（德国MERCK公司，型号：ZR0O01600）；CO₂培养箱（美国Thermo-Scientific公司，型号：Forma371）；倒置荧光显微镜（德国Leica公司，型号：DMi8）；Zeiss倒置显微镜（德国Carl Zeiss Microscopy GmbH公司，型号：Axiocam 208 color）；全自动细胞计数仪（深圳博大博聚科技有限公司，型号：JSY-SC-021H）。

2 实验方法

2.1 含药血清的制备

24只SD雄性大鼠适应性喂养7 d后，随机分为空白对照组、GBC组和双环醇片组，每组8只。GBC组给药剂量按人（体质量70 kg）与大鼠体表面积折算的等效剂量换算，并参照前期研究^［9-10］，给药量为1.47 g/（kg·d），即灌胃浓度为0.147 g/mL的GBC混悬液10 mL/（kg·d）。双环醇片组给药量为200 mg/（kg·d）^［11］，即灌胃浓度为0.02 g/mL的双环醇片混悬液10 mL/（kg·d）。空白组灌胃等体积蒸馏水。1次/d，连续灌胃7 d。末次给药2 h后，予以戊巴比妥钠（60 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，腹主动脉采血，并在冰上静置3 h后，3 500 r/min离心15 min，取上清，0.22 μm过滤，60 ℃水浴灭活15 min，于-20 ℃冰箱中保存备用。

2.2 LPS和IFN-γ配制

2.2.1 LPS母液配制

将规格为10 mg的LPS粉末溶于1 mL含10%空白血清的DMEM完全培养基中，得到浓度为10 mg/mL的原液。取上述原液1 μL，加入1 mL含10%空白血清的DMEM完全培养基，制备成浓度为10 μg/mL的LPS母液。混匀后无菌过滤并分装，于-80 ℃长期保存。使用前室温解冻，以完全培养基稀释至所需浓度。

2.2.2 IFN-γ母液配制

将规格为100 μg的IFN-γ冻干粉溶解于10 mL含10%空白血清的DMEM完全培养基中，制备成浓度为10 μg/mL的IFN-γ母液。混匀后无菌过滤并分装，于-80 ℃长期保存。使用前室温解冻，以完全培养基稀释至所需浓度。

2.3 分组、模型制备与给药

取生长状态良好的RAW264.7细胞分别以5 000个/孔接种于96孔细胞培养板或1×10⁵个/孔接种6孔细胞培养板。随机分为空白对照组，模型组，1.25%、2.5%、5% GBC含药血清组和双环醇片含药血清组。空白对照组：加入10%空白血清培养基；模型组：加入含10 ng/mL LPS和10 ng/mL IFN-γ的10%空白血清培养基；1.25%、2.5%、5% GBC含药血清组：分别加入含10 ng/mL LPS和10 ng/mL IFN-γ的1.25%、2.5%、5% GBC含药血清，血清浓度不足10%的用空白血清补齐；双环醇片含药血清组：加入含10 ng/mL LPS和10 ng/mL IFN-γ的10%双环醇片含药血清。每组设3个复孔，置于CO₂培养箱中，以37 ℃、5% CO₂、pH 7.2~7.4为条件培养24 h。

2.4 指标检测

2.4.1 细胞上清液中IL-1β含量

RAW264.7细胞接种于6孔细胞培养板，按“2.3”项下分组干预24 h后，收集上清，4 ℃下5 000 r/min离心20 min，将上清转移至新的离心管中，严格按照ELISA试剂盒说明书操作，检测细胞上清液中IL-1β的含量。

2.4.2 细胞ECAR水平

RAW264.7细胞接种于黑色透底96孔板细胞培养板，按“2.3”项下分组干预24 h后，吸出培养基，严格按ECAR荧光法测试盒说明书操作，每孔加入100 μL试剂一，37 ℃孵育30 min后，每孔加入100 μL工作液，荧光酶标仪于激发波长490 nm，发射波长535 nm检测各孔荧光值，每隔2~3 min检测1次，持续120 min，按照荧光值（F）与时间（min）绘制曲线，选择线性段进行计算。T₁时检测各孔的荧光值为F₁，T₂时检测各孔的荧光值为F₂。ΔF_测定：测定孔变化荧光值，即F₁-F₂；ΔF_空白：空白孔变化荧光值，F₁-F₂；ΔT：荧光值变化时间T₂-T₁。计算公式为：

ECAR值＝（ΔF_测定－ΔF_空白）/ΔT。

2.4.3 细胞OCR水平

RAW264.7细胞接种于黑色透底96孔板细胞培养板，按“2.3”项下分组干预24 h后，吸出培养基，严格按照OCR荧光法测试盒说明书操作，每孔加入100 μL工作液，37 ℃孵育30 min后，使用酶标仪动力学模式，设置激发波长405 nm，发射波长675 nm检测各孔荧光值，每隔2 min检测1次，持续检测90 min，按照荧光值（F）与时间（min）绘制曲线，选择线性段进行计算。计算方法同ECAR值。

2.4.4 细胞ATP水平

RAW264.7细胞接种于6孔细胞培养板，按“2.3”项下分组干预24 h后，吸出培养基，每孔加入200 μL细胞裂解液，反复吹打，充分裂解后，4 ℃ 12 000 r/min离心5 min，取上清，严格按照ATP检测试剂盒说明书操作，检测细胞中ATP水平。

2.4.5 细胞LDH水平

RAW264.7细胞接种于6孔细胞培养板，按“2.3”项下分组干预24 h后，收集细胞，加入0.3 mL PBS冰水浴超声破碎后，4 ℃下4 000 r/min离心10 min，取上清液，严格按照LDH试剂盒说明书操作，检测细胞中LDH水平。

2.4.6 细胞LD水平

RAW264.7细胞接种于6孔细胞培养板，按“2.3”项下分组干预24 h后，收集细胞，用PBS清洗1~2次，4 ℃下1 000 r/min离心5 min，收集沉淀细胞，加入0.5 mL PBS重悬细胞，手动研磨破碎后，4 ℃下4 000 r/min离心10 min，取上清液，严格按照LD试剂盒说明书操作，检测细胞中LD水平。

2.4.7 Western blot检测细胞中Anx A5、PKM2、p-PKM2和HIF-1α蛋白表达水平

RAW264.7细胞接种于6孔细胞培养板，按“2.3”项下分组干预24 h后，收集细胞并加入细胞裂解液，置于冰上裂解30 min，4 ℃下12 000 r/min离心15 min，收集上清液，测定蛋白浓度，蛋白变性后10% SDS-PAGE胶电泳，转膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入一抗Anx A5（1∶500）、PKM2（1∶500）、p-PKM2（1∶500）、HIF-1α（1∶500），4 ℃孵育过夜。次日除去一抗后，室温加入二抗（1∶3 000）孵育70 min。滴加ECL化学发光显影液显影并采集图像，用Image Lab 6.0软件分析条带灰度值。以β-actin作为内参，计算目的蛋白的相对表达量。

2.5 统计学方法

使用SPSS 24.0软件进行统计分析。计量资料符合正态分布以（\overline{x}±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析。方差齐时，两两比较采用LSD-t法；方差不齐时，两两比较采用Games-Howell。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 结　果

3.1 6组细胞上清液中IL-1β含量比较

见表1。

3.2 6组细胞OCR和ATP水平比较

见表2。

3.3 6组细胞Anx A5/PKM2通路相关蛋白表达水平比较

见表3和图1。

3.4 6组细胞ECAR、LDH和LD水平比较

见表4。

4 讨　论

作为肝病发展的初期阶段，脂肪肝的进展与促炎的M1型巨噬细胞密切相关^［12］，该过程伴随代谢重编程的发生，即细胞通过改变代谢模式以适应能量需求。M1型巨噬细胞可表现为糖酵解增强和氧化磷酸化减弱，糖酵解快速生成的ATP可促进巨噬细胞极化，从而增强炎症反应^［13］。LDH是糖酵解途径的关键酶之一，其催化丙酮酸转化为LD，LD被细胞膜泵排到细胞外环境中，会导致细胞外环境的酸化，通过检测ECAR、LDH、LD可以评估细胞糖酵解代谢水平^［14］。氧化磷酸化过程需消耗氧气来产生ATP，与糖酵解相比，其生成ATP的过程具有低速高效的特点，其消耗1分子葡萄糖可产生30~32个ATP，通过检测OCR和ATP可以评估细胞氧化磷酸化水平^［15］。本研究结果显示，模型组巨噬细胞ECAR、LDH、LD水平均升高，OCR和ATP水平均降低，细胞上清液中IL-1β含量升高，表明经LPS和IFN-γ干预后，巨噬细胞以糖酵解为主要代谢方式，炎症反应增强。各含药血清干预组细胞ECAR、LDH、LD水平均降低，OCR、ATP水平均提高，细胞上清液中IL-1β含量降低，提示经GBC和双环醇片含药血清干预后，细胞不再以糖酵解进行主要产能，而是代谢重编程为氧化磷酸化来产生ATP进行供能，炎症反应减轻。且2.5%、5%GBC含药血清组与1.25%GBC含药血清组的多项指标存在显著性差异，表明GBC对巨噬细胞代谢的影响存在一定的剂量依赖性。与常用的保肝药物双环醇片含药血清组比较，5%GBC含药血清组对LDH活性的抑制作用更强，其余各指标差异无统计学意义，两者对巨噬细胞代谢的影响相当。

Anx A5是一种广泛分布的内源性膜联蛋白，可调节炎症反应^［5，16］。PKM2是丙酮酸激酶的一种亚型，其二聚体形式可促进糖酵解^［17-18］。Anx A5通过ASP101、LEU104和ARG106位点直接与PKM2结合，抑制其Y105磷酸化，促进PKM2四聚体形成，从而减少PKM2二聚体形式。而二聚体形式的PKM2能够与HIF-1α结合，促进LDH、葡萄糖转运体等糖酵解关键基因的转录，增强糖酵解^［19］。因此，抑制PKM2和HIF-1α相互作用可减弱糖酵解，降低LPS诱导的IL-1β等促炎因子产生，对推动巨噬细胞由糖酵解向氧化磷酸化重编程、缓解炎症具有重要作用^［20］。本研究结果显示，模型组巨噬细胞Anx A5蛋白表达水平下降，HIF-1α和p-PKM2蛋白表达水平均升高；各含药血清干预组上述蛋白变化趋势与模型组相反。表明巨噬细胞代谢方式变化与Anx A5/PKM2信号通路改变有关，GBC和双环醇片对巨噬细胞代谢重编程的影响与对Anx A5/PKM2信号通路的调控有关。

综上所述，GBC含药血清可将巨噬细胞糖酵解代谢重编程为氧化磷酸化，从而抑制巨噬细胞的促炎作用，减轻脂肪肝进程中的炎症级联反应，其内在机制可能与对Anx A5/PKM2信号通路的调控有关。

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基金资助

福建省自然科学基金项目(2023J011468)

福州市卫生健康科技计划项目(2022-S-wq6)

福州市2025年中医专项市级补助资金(003065016)