康欣胶囊关键活性成分木犀草素延缓血管内皮细胞衰老机制研究

摘要

目的 采用网络药理学筛选康欣胶囊延缓血管内皮细胞衰老的关键活性成分，并结合体外实验验证其作用机制。 方法 通过网络药理学筛选康欣胶囊活性成分和衰老相关交集靶点，构建中药-活性成分-交集靶点网络图；利用60 μmol/L过氧化氢（H₂O₂）诱导人脐静脉内皮细胞（HUVECs）构建细胞衰老模型，通过细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法检测细胞活力，从木犀草素、异鼠李素、刺槐素及常春藤皂苷元4种候选成分中筛选出关键活性成分；提取关键活性成分（木犀草素）作用靶点与衰老相关靶点进行映射，获取交集靶点，借助Metascape平台进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，并利用AutoDock Vina软件进行分子对接验证；采用CCK-8法检测木犀草素的安全浓度及有效浓度，以确定后续给药剂量；将HUVECs采用随机数字表法分为空白组、H₂O₂组（60 μmol/L H₂O₂）及木犀草素低、中、高剂量组（2、4、8 μmol/L），采用细胞衰老β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色检测HUVECs形态及染色阳性率，通过Western blot法检测p53、p-ERK1/2、cGAS及STING蛋白表达水平。 结果 网络药理学结合体外评价初筛确定木犀草素为康欣胶囊抗衰老的关键活性成分。木犀草素抗衰老交集靶点174个，KEGG通路富集分析结果显示，木犀草素抗衰老交集靶点主要富集在MAPK信号通路；分子对接证实木犀草素与ERK1/2、cGAS、STING蛋白均具有较强结合能力，结合能均＜-7.0 kcal/mol。木犀草素浓度在10 μmol/L及以下时为安全浓度，在2、4、8、10 μmol/L时为有效浓度，最终确定2、4、8 μmol/L分别作为木犀草素低、中、高剂量组进行后续机制验证。与空白组比较，H₂O₂组细胞变圆，间隙增宽，胞质内可见大量深蓝色颗粒状沉淀，SA-β-gal阳性细胞比率升高（P＜0.05），HUVECs中p53、p-ERK1/2、cGAS和STING的蛋白表达量均上升（P＜0.05）；与H₂O₂组比较，木犀草素低、中、高剂量组（2、4、8 μmol/L）随给药浓度增加，蓝色阳性染色细胞显著减少，染色程度逐渐变浅，细胞形态逐步恢复至接近空白组水平，SA-β-gal阳性细胞比率均降低（P＜0.05），且随给药浓度增加而呈剂量依赖性递减，中、高剂量组HUVECs中p53、p-ERK1/2、cGAS和STING的蛋白表达量均下降（P＜0.05）。 结论 木犀草素是康欣胶囊发挥抗血管内皮细胞衰老作用的关键活性成分，其机制可通过抑制cGAS-STING信号通路激活并下调ERK1/2磷酸化水平，进而改善血管内皮细胞衰老。

Graphical abstract

关键词

衰老 / 康欣胶囊 / 木犀草素 / 血管内皮细胞 / ERK1/2 / cGAS-STING信号通路

细胞衰老是指由多种亚致死性应激诱导的细胞周期永久性停滞状态。研究表明，衰老细胞在血管组织中的蓄积与心血管疾病的发生和发展密切相关^［1-3］。康欣胶囊具有补肾填精、健脾益气、养血活血的功效，临床证实其在治疗老年性疾病方面具有显著抗衰老作用^［4-5］，然其确切的药效物质基础及分子机制尚待明确。鉴于此，本研究通过网络药理学对康欣胶囊的关键活性成分进行筛选，并利用过氧化氢（H₂O₂）诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）构建体外细胞衰老模型^［6］，旨在验证并解析筛选所得关键活性成分延缓内皮细胞衰老的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验细胞

HUVECs（货号：SCSP-5535）来源于中国科学院细胞库。

1.2 实验药物与试剂

木犀草素（货号：111520-202107）、异鼠李素（货号：110860-202012）均购自中国食品药品检定研究院；刺槐素（成都格利普生物科技有限公司，货号：480-44-4）；常春藤皂苷元（上海陶术生物科技有限公司，货号：T3039）；30% H₂O₂（西陇化工股份有限公司，货号：001532）；1640培养基（货号：C11875500BT）、胎牛血清（货号：C04001-500）、青霉素-链霉素（货号：sv30010）、干扰素基因刺激蛋白（STING）多克隆抗体（货号：PA5-116052）均购自美国Thermo Fisher Scientific公司；磷酸盐缓冲液（PBS，北京索莱宝生物科技有限公司，货号：C3580-0500）；细胞衰老β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，货号：C0602）；细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测试剂（货号：CK001）、羊抗小鼠IgG-HRP（货号：S0100）、羊抗兔IgG-HRP（货号：S0100）、甘油醛- 3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体（货号：G0100）均购自北京兰博利德科技有限公司；无蛋白快速封闭液1×（上海雅酶生物医药科技有限公司，货号：PS108P）；环鸟苷酸-腺苷酸合成酶（cGAS）抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，货号：29958-1-AP）；肿瘤抑制蛋白p53（p53）抗体（美国Abcam PLC公司，货号：GR3213177-1）；磷酸化细胞外信号调节激酶1/2（p-ERK1/2）抗体（成都正能生物技术有限责任公司，货号：301245）；细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）抗体（美国Cell Signaling Technology公司，货号：11257-1-AP）。

1.3 实验仪器

CO₂培养箱（美国Thermo Fisher Scientific公司，型号：HERAcell vios 160i）；超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司，型号：SW-CJ）；光学显微镜（德国Leica公司，型号：DM40000B）；酶标仪（瑞士Tecamn公司，型号：InfiniteM200Pro）；凝胶成像分析仪（型号：ChemiDoc XRS+）、电泳仪（型号：Powerpac Basic）均购自美国Bio-Rad公司；十万分之一天平（上海奥豪斯仪器有限公司，型号：AR223CN）；倒置荧光显微镜（美国Leica公司，型号：DFC300FX）。

2 方　法

2.1 康欣胶囊关键活性成分初筛

2.1.1 康欣胶囊活性成分及作用靶点筛选

检索中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），设定口服生物利用度（OB）≥30%及类药性（DL）≥0.18为筛选阈值，初步获取康欣胶囊（枸杞子、淫羊藿、女贞子、菟丝子、黄芪、黄精、丹参、地骨皮、菊花、当归、酸枣仁、山楂和何首乌）13味药的活性成分。针对TCMSP数据库未收录或缺失的关键成分，依据参考文献［7］进行补充收集，建立康欣胶囊活性成分数据库。从PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）、SwissTargetPrediction数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch）和PharmMapper（https：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）数据库中收集“Probability”＞0的靶点信息，获得康欣胶囊活性成分作用靶点。

2.1.2 衰老相关靶点数据库的构建

参考文献［8］，在GeneCards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//omim.org/）2个数据库中分别输入“aging”与“senescence”进行检索，整合不同数据库的检索结果，取并集并剔除重复数据，构建衰老相关靶点数据库。

2.1.3 康欣胶囊活性成分和衰老相关交集靶点筛选及中药-活性成分-交集靶点网络图构建

借助通用蛋白质资源数据库UniProt（https：//www.uniprot.org/）对活性成分靶点及衰老相关靶点的基因名称进行规范化处理，并利用Venny 2.1.0在线工具（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）确定康欣胶囊活性成分作用靶点与衰老相关靶点间的交集靶点，并绘制韦恩图。将交集靶点导入Cytoscape 3.10.1软件，构建中药-活性成分-交集靶点网络。最后，根据该网络筛选出网络中度值较高的关键成分，作为后续体外细胞实验进行关键活性成分筛选的候选物质。

2.2 康欣胶囊关键活性成分的体外评价

结合“2.1.3”项下结果与参考文献［9-12］，选取对数生长期的HUVECs，以1×10⁴个/孔的密度接种至96孔板中。实验采用随机分组设计，共设空白组、H₂O₂组和候选活性成分给药组。其中，候选活性成分给药组针对初筛得到的木犀草素、异鼠李素、刺槐素及常春藤皂苷元4种成分，分别设置低、中、高3个浓度梯度（1、3、10 μmol/L）。待细胞贴壁后，各给药组先加入对应浓度的含药培养基预处理2 h，随后加入含60 μmol/L H₂O₂培养基共孵育24 h。H₂O₂组同法加入等体积含60 μmol/L H₂O₂的无药培养基。空白组仅加入等量完全培养基。孵育结束后，严格按照CCK-8试剂盒说明书操作检测各孔光密度值，计算细胞活力以优选关键活性成分。经筛选，确定木犀草素为康欣胶囊关键活性成分。

2.3 木犀草素抗衰老的作用机制预测

2.3.1 木犀草素抗衰老交集靶点筛选

参照“2.1.1”和“2.1.2”项下所述方法，从已构建的数据库中提取木犀草素作用靶点与衰老相关靶点，分别建立靶点数据库。利用Venny 2.1.0在线工具将木犀草素作用靶点与衰老相关靶点取交集，绘制韦恩图，获得木犀草素抗衰老靶点。

2.3.2 京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析

将木犀草素抗衰老靶点导入Metascape数据库（https：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1）进行KEGG通路富集分析，设置P＜0.01为显著性阈值，筛选显著富集的信号通路。选取富集程度最高的前20条通路信息，采用微生信在线平台（https：//www.bioinformatics.com.cn/）构建气泡图进行可视化呈现。

2.3.3 分子对接

采用分子对接技术评估木犀草素与抗衰老靶点的结合亲和力。通过PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获得木犀草素的标准化3D化学结构；同时从PDB数据库（https：//www.rcsb.org/）检索并下载STING（PDB ID：4emu）、cGAS（PDB ID：8img）和ERK1/2（PDB ID：5ji9）的高分辨率3D晶体结构。利用Autodock Vina 1.5.7软件和MGLTools 1.5.7软件进行蛋白质预处理，包括去除水分子、计算Gasteiger电荷、添加极性氢原子以及合并非极性氢原子，并输出为PDBQT格式文件以构建对接体系。利用AutoDock Vina 1.5.7软件进行分子对接研究，以结合能为评价指标，筛选每种对接模式下的最低结合能构象，并利用PyMOL 2.5.5软件对木犀草素与抗衰老靶点的结合模式进行可视化分析。

2.4 木犀草素抗衰老机制的体外评价

2.4.1 木犀草素的安全浓度与有效浓度筛选

选取对数生长期的HUVECs，以1×10⁴个/孔的密度接种至96孔板中，采用随机数字表法分为空白组和不同浓度木犀草素组。其中，给药组分别加入含2.5、5、10、20、40 μmol/L木犀草素的完全培养基；空白组给予等量完全培养基。每组设5个复孔，常规培养24 h。采用CCK-8试剂盒检测各组细胞活力，以筛选药物安全浓度。

根据以上安全浓度，选取对数生长期HUVECs，以1×10⁴个/孔的密度接种至96孔板中，采用随机数字表法分为空白组、H₂O₂组及不同浓度木犀草素组。其中，给药组分别加入含0.25、0.5、1、2、4、8、10、20 μmol/L木犀草素的完全培养基预处理2 h，随后加入含60 μmol/L H₂O₂的完全培养基共同孵育24 h；H₂O₂组与空白组处理同“2.2”项。每组设5个复孔，孵育结束后采用CCK-8试剂盒检测各组细胞活力，以确定木犀草素发挥抗衰老作用的最佳有效浓度。

2.4.2 HUVECs的SA-β-gal染色

选取HUVECs对数生长期的细胞4×10⁴个/孔铺板至24孔板中，待细胞贴壁并生长至约80%时，采用随机数字表法分为空白组、H₂O₂组和低、中、高剂量组。给药组给予木犀草素低、中、高剂量（2、4、8 μmol/L）预处理2 h，随后加入含60 μmol/L H₂O₂的完全培养基共同孵育24 h；H₂O₂组与空白组处理同“2.2”项。孵育结束后，采用PBS清洗细胞2次，加入固定液室温固定15 min；PBS再次清洗后，加入含X-gal的SA-β- gal染色工作液染色调节pH至5.9～6.1，在37 ℃无CO₂的孵育箱中孵育过夜。孵育结束后去除染色液，加入PBS 2 mL，在显微镜下随机选取4个视野进行图像采集，并计算SA-β-gal阳性细胞比率，判断内皮细胞衰老情况。

2.4.3 Western blot检测HUVECs中p53、p-ERK1/2、cGAS和STING蛋白表达量

选取对数生长期的HUVECs，以3×10⁵个/孔铺板至6孔板中，按照“2.4.2”项下方法进行分组处理。干预结束后，收集各组细胞，加入RIPA裂解液冰上裂解15 min。于4 ℃、12 000 r/min条件下离心8 min，提取总蛋白上清。利用BCA试剂盒检测蛋白上清浓度，根据蛋白浓度制备上样蛋白。

取蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳分离，随后转移至PVDF膜。转膜完成后，利用快速封闭液室温封闭20 min。分别加入一抗p53（1∶1 000）、STING（1∶1 000）、cGAS（1∶1 000）、p-ERK1/2（1∶1 000）、ERK1/2（1∶1 000）和GAPDH（1∶5 000），置于4 ℃冷藏环境孵育过夜。次日用1×TBST洗膜3次，每次5 min，随后加入对应二抗室温孵育1 h，再次经1×TBST洗膜3次，每次10 min。滴加ECL显影液进行显色，采用Image lab软件分析结果。以GAPDH作为内参，通过分析目的条带与内参条带的灰度值比值，计算各蛋白相对表达水平。

2.5 统计学方法

采用SPSS 27.0软件进行数据分析，并通过GraphPad Prism 8软件进行可视化呈现。计量资料符合正态分布以（\overline{x}±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，若方差齐采用LSD-t法进行组间两两比较，若方差不齐则选用Games-Howell检验进行分析比较。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 结　果

3.1 康欣胶囊活性成分和衰老相关交集靶点筛选结果

本研究共获取康欣胶囊活性成分169个，活性成分作用靶点565个；同时，检索获得衰老相关靶点2 221个。通过将康欣胶囊活性成分作用靶点与衰老相关靶点映射分析，最终获得康欣胶囊与衰老相关交集靶点共293个。见图1。

3.2 康欣胶囊中药-活性成分-交集靶点网络图构建结果

通过Cytoscape 3.10.1构建康欣胶囊中药-活性成分-交集靶点网络图，由432个节点、4 385条边组成。见图2。根据度值筛选出该网络中贡献度最高的前10位活性成分。见表1。

3.3 康欣胶囊关键活性成分的体外评价结果

综合考虑成药性和抗衰老潜质等因素^［9-12］，选取木犀草素、异鼠李素、刺槐素及常春藤皂苷元进行体外评价。与空白组比较，H₂O₂组细胞活力显著下降（P＜0.05）；与H₂O₂组比较，木犀草素组在3 μmol/L及10 μmol/L浓度下细胞活力显著上升（P＜0.05），常春藤皂苷元组在10 μmol/L浓度下细胞活力显著上升（P＜0.05），其余候选活性成分组在实验浓度下未见统计学差异（P＞0.05），表明木犀草素对H₂O₂诱导的HUVECs损伤展现保护作用。因此，确定木犀草素为康欣胶囊发挥抗衰老作用的关键活性成分。见图3。

3.4 木犀草素抗衰老交集靶点筛选结果

本研究共获取木犀草素作用靶点350个，衰老相关靶点2 221个。通过将木犀草素作用靶点与衰老相关靶点映射分析，最终获得木犀草素抗衰老交集靶点共174个。见图4。

3.5 KEGG通路富集分析结果

木犀草素抗衰老交集靶点主要富集在PI3K-Akt、MAPK、Ras等信号通路。见图5。MAPK信号通路在富集显著性（P＝1.035×10^-21）及基因覆盖率上均表现突出。且MAPK家族包含ERK、JNK及p38等多条关键支路，在调控细胞增殖、分化及衰老过程中发挥核心作用。因此，需要进一步聚焦于通路中的关键分子。

ERK1/2作为MAPK信号通路的关键蛋白激酶，负责将胞外信号转导至核内，其功能的行使需经磷酸化转化为p-ERK1/2形式。尽管有研究显示，激活ERK1/2磷酸化可促进多发性骨髓瘤细胞衰老^［13］，但ERK1/2在介导木犀草素延缓内皮细胞衰老中的具体调控方向及作用机制尚不明确。因此，本研究选取ERK1/2作为核心靶点，探讨木犀草素通过该通路延缓内皮细胞衰老的具体作用机制。

3.6 分子对接结果

木犀草素抗衰老作用高度富集于MAPK信号通路。然而，信号通路激活受上游cGAS-STING调控。有研究显示，cGAS-STING信号通路作为细胞衰老的关键因素，已被证实能有效激活下游的MAPK/ERK级联反应^［14］。鉴于网络药理学预测结果与文献报道结果，本研究推测木犀草素可通过作用于cGAS-STING-ERK1/2发挥抗衰老作用。为此，本研究采用分子对接技术，验证木犀草素与cGAS、STING及ERK1/2的结合亲和力。对接结果显示，木犀草素与ERK1/2、cGAS及STING蛋白均能形成稳定复合物，其结合能均＜-7.0 kcal/mol，分别为-7.4、-8.6、-7.8 kcal/mol，表明木犀草素与3个靶点间具有较强结合能力。如图6。

3.7 木犀草素的安全浓度与有效浓度筛选结果

木犀草素对HUVECs的安全浓度筛选结果显示，与空白组比较，当木犀草素浓度达到20 μmol/L和40 μmol/L时，细胞活力均下降（P＜0.05）；而在10 μmol/L及以下浓度时，细胞活力未见明显改变（P＞0.05），提示木犀草素在10 μmol/L及以下时HUVECs无显著细胞毒性。木犀草素对HUVECs的有效浓度筛选结果显示，与空白组比较，H₂O₂组细胞活力下降（P＜0.05）；与H₂O₂组比较，木犀草素组在2、4、8、10 μmol/L浓度下细胞活力均上升（P＜0.05），且20 μmol/L组细胞活力呈回落趋势。综合考量药物的安全浓度与有效浓度，本研究最终选取2、4、8 μmol/L分别作为木犀草素低、中、高剂量组进行后续机制验证。见图7。

3.8 5组HUVECs的SA-β-gal染色结果比较

在HUVECs的SA-β-gal染色中，胞质呈现蓝色的细胞判定为SA-β-gal染色阳性，其染色深度与面积对HUVECs的衰老程度呈正相关。染色结果显示，空白组内皮细胞贴壁呈单层生长，形态为规则的铺路石样，细胞边界清晰，胞质充盈，视野内仅见极少量淡蓝色染色。与空白组比较，H₂O₂组细胞生长减慢，细胞变圆，间隙增宽，胞质内可见大量深蓝色颗粒状沉淀，H₂O₂组的SA-β-gal阳性细胞比率升高（P＜0.05）；与H₂O₂组比较，木犀草素低、中、高剂量组随给药浓度增加，蓝色阳性染色细胞显著减少，染色程度逐渐变浅，细胞形态逐步恢复至接近空白组水平，细胞死亡和脱落现象得到有效抑制，木犀草素低、中、高剂量组SA-β-gal阳性细胞比率均降低（P＜0.05），且随给药浓度增加而呈剂量依赖性递减。见图8。

3.9 5组HUVECs中p53、p-ERK1/2、cGAS和STING蛋白表达量比较

见图9和表2。

4 讨　论

细胞衰老与内皮功能障碍密切相关。当内皮细胞衰老，促炎因子及促血栓形成因子的表达显著上调，进而诱导单核-巨噬细胞的活化与黏附，最终驱动动脉粥样硬化的发生与发展^［15］。而康欣胶囊具有补肾填精、健脾益气、养血活血之功效，临床常用于治疗肾虚血瘀型痴呆^［16］。本研究基于网络药理学方法预测了康欣胶囊中潜在的抗衰老活性成分，筛选出4种候选成分；通过建立H₂O₂诱导的内皮细胞损伤模型，以细胞存活率为指标进行体外评价，最终确定木犀草素为发挥抗衰老作用的关键活性成分^［17-20］。

KEGG通路富集分析结果显示，MAPK信号通路富集结果较好。ERK1/2是MAPK家族蛋白之一，具有典型的级联信号转导特征^［21］，是连接细胞外刺激与细胞内转录响应的关键信使，在细胞衰老调控中扮演重要角色。分子对接模拟显示，木犀草素与ERK1/2蛋白结构具有良好结合亲和力。同时，有研究表明，H₂O₂可诱导线粒体DNA（mtDNA）损伤及逃逸，进而激活cGAS-STING信号通路，该通路已被证实是衰老过程中慢性炎症和功能下降的关键驱动因素^［22］。分子对接结果亦证实，木犀草素与cGAS-STING存在较强结合能。机制上，受损mtDNA逃逸至胞质后激活cGAS-STING，影响下游ERK1/2磷酸化水平，诱导干扰素调节因子3（IRF3）活化^［13］，最终促进干扰素α1及下游干扰素刺激基因的转录表达，加速细胞衰老进程^［23］。综上，KEGG分析与分子对接结果提示，木犀草素可能通过cGAS-STING信号通路和ERK1/2以发挥抗衰老作用。

木犀草素作为一种广泛分布于植物界的天然类黄酮化合物，已被证实具备抗炎、抗氧化及抗衰老等多种生物学活性^［24］。研究表明，木犀草素可显著抑制紫外线B波段（UVB）诱导的人永生化角质形成细胞的基质金属蛋白酶-1表达及激活蛋白-1活化，提示其在防治皮肤老化方面具有潜在应用价值^［25］。然而，关于其在抗内皮细胞衰老的药效及机制研究尚显匮乏，亟待深入探讨。本研究选取衰老关键生物标志物SA-β-gal活性及衰老相关蛋白p53表达作为评价指标^［26］。研究结果显示，H₂O₂组SA-β-gal阳性率显著升高，同时伴随p53蛋白表达上调；而木犀草素干预能有效下调p53蛋白表达并降低SA-β-gal阳性细胞比率，从而改善HUVECs衰老表型。进一步Western blot分析提示，H₂O₂组中cGAS、STING及p-ERK1/2蛋白水平均升高，而木犀草素干预显著抑制了上述蛋白的表达，提示其通过调节相关信号通路可延缓内皮细胞衰老。

综上，本研究结合网络药理学预测与体外实验验证，确定木犀草素为康欣胶囊发挥抗衰老作用的关键活性成分。其作用机制可能与木犀草素抑制cGAS-STING信号及下调ERK1/2磷酸化水平，进而减轻H₂O₂诱导的HUVECs细胞衰老有关。

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基金资助

国家中医药管理局临床中药学高水平中医药重点学科建设项目(国中医药人教函〔2023〕85号)