基于鼻-脑轴Fyn/STAT5信号通路探讨醒鼻凝胶滴鼻剂干预变应性鼻炎大鼠的机制研究

摘要

目的 探讨醒鼻凝胶滴鼻剂通过鼻-脑轴Fyn/STAT5信号通路干预变应性鼻炎（AR）大鼠的作用机制。 方法 采用随机数字表法将40只SD大鼠分为正常组、模型组、中药组和西药组，每组10只。除正常组外，其余各组通过卵清蛋白全身致敏联合鼻腔局部激发法建立AR模型大鼠。正常组和模型组于双侧鼻腔滴入50 μL生理盐水，中药组滴入50 μL醒鼻凝胶滴鼻剂，西药组滴入50 μL布地奈德鼻喷雾剂，每日2次，连续干预12 d。评估4组干预前和干预3、7、12 d鼻炎行为学评分；应用新物体识别试验检测新/旧物体探索时间，并计算辨别指数和识别指数；小动物磁共振观察大鼠海马和嗅区呈像；qPCR和Western blot检测海马组织 致密物酪氨酸激酶（Fyn）、信号转导和转录激活因子 5（STAT5）、P物质（SP）、血管活性肠肽（VIP） mRNA相对表达水平和蛋白相对表达量。 结果 与同组治疗前比较，中药组干预7、12 d和西药组干预3、7、12 d鼻炎行为学评分均明显降低（P＜0.05）；与同一时间正常组比较，模型组干预前和干预3、7、12 d鼻炎行为学评分均明显升高（P＜0.05）；与同一时间模型组比较，中药组和西药组干预3、7、12 d鼻炎行为学评分均明显降低（P＜0.05）。4组海马区磁共振成像均未见明显异常。与正常组比较，模型组新物体探索时间明显缩短（P＜0.05），辨别指数和识别指数均明显降低（P＜0.05）；海马组织Fyn、SP、VIP mRNA相对表达水平和蛋白相对表达量均明显升高（P＜0.05），STAT5 mRNA相对表达水平和蛋白相对表达量均明显降低（P＜0.05）。与模型组比较，中药组和西药组新物体探索时间明显增加（P＜0.05），辨别指数和识别指数均明显升高（P＜0.05）；海马组织Fyn、SP、VIP mRNA相对表达水平和蛋白相对表达量均明显降低（P＜0.05），中药组STAT5 mRNA相对表达水平和蛋白相对表达量明显升高（P＜0.05）。与中药组比较，西药组STAT5、VIP蛋白相对表达量均明显降低（P＜0.05）。 结论 醒鼻凝胶滴鼻剂可能通过鼻-脑轴Fyn/STAT5信号通路，改善AR所致的鼻-脑相关症状及神经免疫指标。

Graphical abstract

关键词

变应性鼻炎 / 醒鼻凝胶滴鼻剂 / 鼻-脑轴 / Fyn/STAT5信号通路

变应性鼻炎（allergic rhinitis，AR）发病机制复杂，除经典的免疫平衡机制、遗传与环境机制以外，近年来研究热点关注神经免疫轴在介导AR中的重要作用，研究表明AR神经系统中枢与外围区域存在双向交互调控过程^［1］。随着“肠-脑轴”的发现^［2-3］和“肺-脑轴”的提出^［4-5］，“鼻-脑轴”也成为AR发病机制的重要补充^［6］，即支配鼻黏膜的神经末梢接受外界刺激后将各种信号呈递给中枢神经系统，中枢神经系统将信息整合并传出至外周靶器官，调控免疫系统^［7］。中枢神经系统与免疫系统通过持续的双向信号传递，最终构建起具有自我强化特性的调控环路。如嗅神经等支配鼻腔黏膜的神经末梢接受外界刺激后可释放神经肽，与肥大细胞、嗜酸性粒细胞等核心免疫细胞相互作用，构成AR发病的神经-免疫网络。

醒鼻凝胶滴鼻剂是福建中医药大学附属人民医院院内制剂，临床应用于儿童AR的治疗，疗效显著。既往研究已证实，醒鼻凝胶滴鼻剂可通过介导鼻黏膜Fyn/STAT5信号通路来减少组胺和炎性细胞因子的释放，抑制嗜酸性粒细胞，拮抗免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）合成，从而调节AR^［8-9］。而致密物酪氨酸激酶（Fyn）同时也是重要的突触后致密物质之一，对诱导海马、嗅区突触可塑性和学习记忆功能具有重要的调节作用。因此本研究采用醒鼻凝胶滴鼻剂治疗AR大鼠，通过对比大鼠行为学、脑部影像学、相关神经肽以及Fyn/STAT5信号通路的变化，验证醒鼻凝胶滴鼻剂通过鼻-脑轴Fyn/STAT5信号通路干预AR的作用机制，为其临床应用提供实验依据。

1 实验材料

1.1 实验动物

SPF级21日龄SD大鼠40只，体质量200～250 g，雌雄各半，购自厦门福德鑫生物科技有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（闽）2025-0001。实验大鼠饲养于福建中医药大学SPF级实验动物中心，实验动物使用许可证号：SYXK（闽）2023-0004。饲养条件：温度22 ℃，湿度50%～70%，12 h光照/12 h黑夜模拟标准昼夜系统，自由饮食和饮水。本实验已通过福建中医药大学实验动物伦理委员会审批（审批号：2024266）。

1.2 实验药物

醒鼻凝胶滴鼻剂（闽药准字：Z20110006），主要由徐长卿、蝉蜕、人工牛黄、冰片等组成，由福建中医药大学附属人民医院制剂室提供。布地奈德鼻喷雾剂（雷诺考特）由阿斯利康制药有限公司分包装（批号：J20140048），主要活性成分为布地奈德。

1.3 实验试剂

卵清蛋白（OVA，批号：A5503）、氢氧化铝粉末（批号：239186-25G）、戊巴比妥钠（批号：061222）均购自美国Sigma公司；TriZol（美国Thermo公司，批号：15596026）；mRNA逆转录试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司，批号：CW2569）；信号转导和转录激活因子5（signal transducers and activators of transcription 5，STAT5）抗体（北京博奥森生物技术有限公司，批号：bs-1142R）；Fyn抗体（批号：AF6102）、P物质（substance P，SP）抗体（批号：DF7522）、血管活性肠肽（vasoactive intestinal peptide，VIP）抗体（批号：DF6627）均购自美国Affinity Biosciences公司；Goat anti-Mouse IgG（H＋L）Secon-dary Antibody（批号：AWS0001）、Goat anti-Rabbit IgG（H＋L）Secondary Antibody（批号：AWS 0002）均购自长沙艾碧维生物科技有限公司。

1.4 实验仪器

小动物核磁共振成像仪（德国Bruker公司，型号：BioSpec 70/20 USR）；酶标仪（美国Thermo公司，型号：Multiskan FC）；实时荧光定量PCR仪（型号：CFX96）、电泳仪（型号：PowerPac Basic）、化学发光成像分析系统（型号：ChemiDoc XRS+）均购自美国Bio-Rad公司。

2 实验方法

2.1 动物分组及造模

采用随机数字表法将40只SD大鼠分为正常组、模型组、中药组和西药组，每组10只。除正常组外，其余各组大鼠参照文献［10］建立AR模型大鼠。① 致敏：以0.5 mg OVA作为抗原，30 mg氢氧化铝粉末作为佐剂，加入1 mL生理盐水形成混悬液，无菌条件下进行腹腔注射，隔日1次，共7次；正常组大鼠以等体积生理盐水腹腔注射。② 激发：腹腔注射致敏完成后第4天，大鼠取头低位，应用微量加样器于每侧鼻腔滴入50 µL 2%OVA溶液，隔日1次，共5次，激发时间为当日第1次滴鼻给药1 h后；正常组以等体积生理盐水替代OVA溶液鼻腔滴入。

2.2 干预

腹腔注射致敏完成后第1天开始给药，大鼠取头低位，应用微量加样器将药液滴入大鼠双侧鼻孔，正常组和模型组滴入50 μL生理盐水，中药组滴入50 μL醒鼻凝胶滴鼻剂，西药组滴入50 μL布地奈德鼻喷雾剂，每日2次，连续干预12 d。

2.3 观察指标

2.3.1 鼻炎行为学评分

每次OVA溶液双侧鼻腔滴鼻激发后，观察并记录30 min内大鼠喷嚏次数、流涕量、抓挠情况，根据症状的轻、中、重度分别计1、2、3分，采用叠加法计算干预前和干预3、7、12 d鼻炎行为学评分^［11］，总分≥5分表示造模成功。

2.3.2 新物体识别试验

应用新物体识别试验评估大鼠海马依赖性工作记忆功能^［12］。① 适应性训练：于连续给药第12天，将大鼠置于1 m×1 m正方形行为箱中自由探索5 min；② 熟悉期训练：末次给药24 h后，在行为箱对角线位置放置2个相同物体，允许大鼠自由探索5 min；③ 测试期：熟悉期训练24 h后，将其中1个熟悉物体更换为形状和表面纹理不同但高度与体积相近的新物体，记录大鼠5 min内的探索行为。当动物鼻部与物体的距离≤2 cm且指向目标物体时，视为有效探索行为。通过分析新/旧物体探索时间，计算辨别指数和识别指数，以此评估4组大鼠的记忆能力差异。

\mathrm{辨别}\mathrm{指数}=\frac{\mathrm{新物}\mathrm{体探}\mathrm{索时}\mathrm{间}-\mathrm{旧物}\mathrm{体探}\mathrm{索时}\mathrm{间}}{\mathrm{新物}\mathrm{体探}\mathrm{索时}\mathrm{间}+\mathrm{旧物}\mathrm{体探}\mathrm{索时}\mathrm{间}}

\mathrm{识别}\mathrm{指数}=\frac{\mathrm{新物}\mathrm{体探}\mathrm{索时}\mathrm{间}}{\mathrm{新物}\mathrm{体探}\mathrm{索时}\mathrm{间}+\mathrm{旧物}\mathrm{体探}\mathrm{索时}\mathrm{间}}

2.3.3 小动物磁共振弥散张量呈像

扫描前采用含3%异氟烷的混合气体（氧气与空气体积比1∶4）对大鼠进行诱导麻醉，随后按0.5 mL/kg给予100 μg/mL盐酸美托嘧啶进行后肢肌肉注射。扫描时将大鼠俯卧位固定于小动物专用磁共振扫描床，采用专用头部固定装置（含牙钩及双侧耳杆）配合表面线圈系统（线圈内径38 mm）实现精准定位，扫描架内径为16 cm。扫描过程中采用2%异氟烷复合气体，通过PE材质鼻导管持续输注维持麻醉，同步通过环境温控系统保持扫描室温度稳定。整个扫描过程中持续监测麻醉深度，确保动物生命体征平稳。具体扫描参数如下：回波时间＝32.25 ms，重复时间＝12 000 ms，视野＝32 mm×32 mm，节段＝4，平均值＝1，图像尺寸＝128×128，切片＝48，b0＝1 000 s/mm²，切片厚度＝0.56 mm，无切片间隙，时间＝28 min。

2.3.4 qPCR检测相关基因mRNA相对表达水平

取各组大鼠海马组织后，使用TriZol试剂提取总RNA，采用紫外分光光度法测定总RNA含量，以组织总mRNA为模板，逆转录cDNA，反应条件：50 ℃、50 min，85 ℃、5 min。以各样品cDNA为模板，采用SYBR green real-time PCR方法对目标基因进行real-time PCR扩增检测分析，反应条件：95 ℃预变性10 min，1个循环；95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，40个循环。采用2^-ΔΔCt方法计算目标基因mRNA相对表达量。引物序列见表1。

2.3.5 Western blot法检测相关蛋白相对表达量

剪取海马组织，用预冷PBS溶液清洗组织，加入适量RIPA裂解液冰上提取蛋白质，采用BCA法测定蛋白浓度。取30 μg蛋白上样，经SDS-PAGE电泳分离，电转至固相支持体PVDF膜上，分别置于Fyn（1∶1 000）、STAT5（1∶1 000）、SP（1∶2 000）、VIP（1∶1 000）一抗中孵育过夜，清洗后加入二抗（1∶5 000）孵育，TBST溶液洗膜，曝光条带后显影，以β-actin为内参进行归一化处理计算目的蛋白相对表达量。

2.4 统计学方法

采用SPSS 26.0软件进行数据分析。计量资料符合正态分布以（\overline{x}±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，若方差齐，两两比较采用LSD-t检验；若方差不齐则采用Games-Howell检验。不符合正态分布以M（P₂₅，P₇₅）表示，采用Kruskal-Wallis检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结　果

3.1 4组鼻炎行为学评分比较

与同组治疗前比较，中药组干预7、12 d和西药组干预3、7、12 d鼻炎行为学评分均明显降低（P＜0.05）；与同一时间正常组比较，模型组干预前和干预3、7、12 d鼻炎行为学评分均明显升高（P＜0.05）；与同一时间模型组比较，中药组和西药组干预3、7、12 d鼻炎行为学评分均明显降低（P＜0.05）。见表2。

3.2 4组新物体识别能力比较

与正常组比较，模型组新物体探索时间明显缩短（P＜0.05），辨别指数和识别指数均明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，中药组和西药组新物体探索时间明显增加（P＜0.05），辨别指数和识别指数均明显升高（P＜0.05）。见图1。

3.3 4组海马区磁共振成像情况比较

大鼠海马及嗅区磁共振定位见图2。4组海马区磁共振成像均未见明显异常，见图3。

3.4 4组海马组织Fyn、STAT5、SP、VIP mRNA相对表达水平比较

与正常组比较，模型组海马组织Fyn、SP、VIP mRNA相对表达水平均明显升高（P＜0.05），STAT5 mRNA相对表达水平明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，中药组和西药组海马组织Fyn、SP、VIP mRNA相对表达水平均明显降低（P＜0.05），中药组STAT5 mRNA相对表达水平明显升高（P＜0.05）。见图4。

3.5 4组海马组织Fyn、STAT5、SP、VIP蛋白相对表达量比较

与正常组比较，模型组海马组织Fyn、SP、VIP蛋白相对表达量均明显升高（P＜0.05），STAT5蛋白相对表达量明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，中药组与西药组海马组织Fyn、SP、VIP蛋白相对表达量均明显降低（P＜0.05），中药组STAT5蛋白相对表达量明显升高（P＜0.05）；与中药组比较，西药组STAT5、VIP蛋白相对表达量均明显降低（P＜0.05）。见图5。

4 讨　论

《疮疡全书》云：“鼻在面中，为一身之血运，而鼻孔为肺之窍，其气上通于脑，下行于肺。”王清任《医林改错·脑髓说》云：“看小儿初生时，脑未全……鼻不知闻，舌不言。至周岁，脑渐生……鼻微知香臭，舌能言一二字。至三四岁，脑髓渐满……鼻知香臭，言语成句”，清晰指出鼻的生理功能有赖于脑的调控。《素问·气厥论》记载：“胆移热于脑，则辛頞鼻渊，鼻渊者，浊涕下不止也”，明确指出鼻炎的病理与脑有关。醒鼻凝胶滴鼻剂君药徐长卿祛风止痒、化湿止痛；臣药蝉蜕疏散风热、透疹止痒；佐药牛黄醒脑开窍，豁痰熄风；使药冰片通窍醒神，清热止痛，且能引药上行，全方共奏疏风止痒、清热、通鼻脑二窍之效。

SP、VIP的阳性纤维大部分分布于鼻黏膜上皮细胞间以及血管和腺体周围，这一结构特点便于其参与鼻黏膜血管和腺体分泌的调节。参与鼻腔变态反应的肥大细胞、B淋巴细胞等免疫活性细胞均有神经肽受体的表达^［13］。肥大细胞浸润的增多与神经肽类物质在鼻黏膜的表达呈平行关系。研究发现SP刺激肥大细胞颗粒的神经调控机制，由高亲和力的IgE受体复合物（FcεRIa）介导的免疫性通路^［14］。而肥大细胞分泌的类胰蛋白酶可以激活神经表面的蛋白酶激活受体-2（PAR2），促进SP、VIP等肽类物质的释放^［15］。以上研究说明，神经肽类物质与免疫介质相互协作，拮抗或调节血管的收缩和舒张以及腺体的分泌，共同参与AR的发病。

Fyn/STAT5被认为是IgE介导过敏反应的前沿信号通路，Fyn/STAT5信号通路在肥大细胞内被激活后，会将信息转导至细胞核内，激活核内信号传导的发生，最终导致肥大细胞脱颗粒^［16］。前期研究已证实，醒鼻凝胶滴鼻剂可降低鼻黏膜Fyn表达，阻碍FcεRI受体交联，抑制肥大细胞增殖和脱颗粒，减少组胺和炎性细胞因子的释放，同时通过上调STAT5以及STATs家族成员磷酸化形成二聚体移入细胞核内，在核内与特异的DNA序列结合参与基因转录，抑制嗜酸性粒细胞，拮抗IgE合成，从而抑制鼻黏膜Fyn/STAT5信号传导通路，减轻AR免疫反应^{［9，17-18］}。

而在儿童神经系统发育过程中，Fyn促进中枢神经系统的髓鞘形成。出生以后，施万细胞形成髓鞘包裹神经元轴突，Fyn作为Tyro3受体酪氨酸激酶细胞内结合域，参与施万细胞的髓鞘形成^［19］。Fyn属于非受体型酪氨酸激酶，是Src家族的成员之一，在与学习、记忆密切相关的海马和小脑中含量均很高，主要集中在海马CA3区，其蛋白表达量的增减与动物学习记忆能力相关^［20］。在海马内，Fyn是重要的突触后致密物质之一，已证明其参与了突触可塑性和学习记忆功能的分子机制^［21］。本研究结果显示，模型组海马、嗅区影像并未发现明显异常，考虑本实验为AR急性模型，即儿童AR早期，鼻-脑轴的异常更可能表现为功能性，Fyn/STAT5分子表达和行为学发生改变，但尚未引起器质性改变而发生组织形态结构异常。

本研究结果发现，模型组新物体识别能力较正常组明显下降，提示AR可能合并工作记忆异常。同时，模型组海马组织Fyn、SP、VIP蛋白和mRNA表达增加，STAT5蛋白和mRNA表达降低，说明AR可能合并神经肽类物质表达异常，同时通过Fyn/STAT5通路参与AR。经醒鼻凝胶滴鼻剂治疗后，AR大鼠新物体识别能力提高，提示工作记忆功能有所改善；同时海马组织Fyn、SP、VIP蛋白和mRNA表达减少，STAT5蛋白和mRNA表达增加，推测AR与鼻-脑轴神经免疫机制密切相关，且醒鼻凝胶滴鼻剂可能通过下调海马突触后致密物质Fyn，上调核内STAT5，在核内与特异的DNA序列结合参与基因转录，抑制SP、VIP等神经肽释放，但其具体机制仍需进一步研究。

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基金资助

国家自然科学基金项目(82405481)

福建省卫健委中青年骨干项目(2025QNGGB006)

福建省自然科学基金项目(2023J01835)

福建省自然科学基金项目(2023J05172)