基于NF-κB信号通路探讨银红2号方对气滞血瘀型输卵管阻塞性不孕症大鼠炎症反应的影响

摘要

目的 基于NF-κB信号通路观察银红2号方对气滞血瘀型输卵管阻塞性不孕症大鼠炎症反应的影响。 方法 采用随机数字表法将30只雌性Wistar大鼠分正常组、模型组和低、中、高剂量组，每组6只。模型组和低、中、高剂量组注射金黄色葡萄球菌建立输卵管阻塞性不孕症大鼠模型，应用声、光、电刺激21 d建立气滞血瘀证模型。造模成功后低、中、高剂量组分别按3.715、7.43、14.86 g/（kg·d）给予银红2号方药液灌胃，正常组和模型组按7.43 mL/（kg·d）给予生理盐水灌胃，每日均灌胃1次，连续干预11 d。ELISA检测血清白细胞介素（IL）-1β、IL-2、IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和E-选择素（CD62E）含量；Western blot检测输卵管组织IκB抑制蛋白α（IκBα）、核因子κB p65（NF-κB p65）、NF-κB诱导激酶（NIK）和IκB激酶（IKK）蛋白表达量；qPCR检测输卵管组织IL-8、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）、血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）、细胞间黏附分子-1（ICAM-1） mRNA相对表达水平。 结果 与正常组比较，模型组血清IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α、CD62E含量均明显升高（P＜0.05）；输卵管组织IκBα蛋白表达量明显降低（P＜0.05），NF-κB p65、NIK、IKK蛋白表达量均明显升高（P＜0.05）；输卵管组织IL-8、MCP-1、VCAM-1、ICAM-1 mRNA相对表达水平均明显升高（P＜0.05）。与模型组比较，低、中、高剂量组血清IL-1β含量明显降低（P＜0.05），中剂量组血清IL-2、IL-6、TNF-α、CD62E含量均明显降低（P＜0.05）；低剂量组输卵管组织IκBα蛋白表达量明显升高（P＜0.05），低、中剂量组输卵管组织NF-κB p65、NIK、IKK蛋白表达量均明显降低（P＜0.05）；中剂量组输卵管组织IL-8、MCP-1、VCAM-1、ICAM-1 mRNA相对表达水平均明显降低（P＜0.05）。 结论 银红2号方能够通过调控NF-κB信号通路改善气滞血瘀型输卵管阻塞性不孕症炎症反应。

Graphical abstract

关键词

不孕症 / 输卵管阻塞 / 炎症反应 / NF-κB信号通路 / 气滞血瘀

输卵管阻塞性不孕症是不孕症的常见类型，输卵管阻塞等盆腔因素是我国女性不孕症，特别是继发性不孕症的主要原因，约占全部不孕因素的35%^［1-2］。多种病菌感染均可引起输卵管炎，进而导致输卵管阻塞性不孕症，因而炎症与输卵管阻塞性不孕密切相关。NF-κB信号通路是调节炎症反应的重要通路，其在输卵管阻塞性不孕症中发挥重要作用^［3-4］。相关研究发现不孕患者的颗粒细胞中NF-κB通路被激活，继而产生炎症小体，促进炎症过程的发生^［5］。银红2号方为福州市中医院协定处方，临床上应用于治疗气滞血瘀型输卵管阻塞性不孕症患者，疗效甚佳，但其作用机制尚有待阐明。因此，本研究观察银红2号方对气滞血瘀型输卵管阻塞性不孕症大鼠NF-κB通路及炎症因子的影响，探讨其作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物

SPF级9～11周健康雌性Wistar大鼠30只，体质量（230±20）g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0010；饲养于福建安布瑞生物科技有限公司SPF级实验室，实验动物使用许可证号：SYXK（闽）2022-0002。大鼠饲养环境为温度20～26 ℃，湿度40%～70%，通风、光照等饲养条件良好。饲料使用大小鼠维持料，饲料与饮用水保证定期更换，保证食饮自由。

1.2 实验药物

银红2号方药物组成：红藤15 g，白花蛇舌草6 g，丹参10 g，桃仁8 g，橘核15 g，莪术6 g，金银花6 g，三棱6 g，䗪虫3 g，败酱草10 g，路路通6 g。饮片由福州市中医院中药房提供，并委托福建省人民医院药剂科制作，将药液浓缩至含生药量1 g/mL的银红2号方药液^［6］，无菌包装备用。金黄色葡萄球菌（浓度：1×10⁸/mL）由北京北纳创联生物技术研究院提供，批号：BNCC310011。

1.3 实验试剂

E-选择素（CD62E）（货号：MM-0402R2）、白细胞介素（IL）-1β（货号：MM-0047R2）、IL-6（货号：MM-0190R2）、IL-2（货号：MM-0192R2）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）（货号：MM-0180R2） ELISA试剂盒均购自江苏酶免实业有限公司；IκB激酶（IKK）抗体（武汉博士德生物工程有限公司，货号：BM4572）；NF-κB诱导激酶（NIK）抗体（爱博泰克生物科技有限公司，货号：A11585）；IκB抑制蛋白α（IκBα）抗体（货号：10268-1-AP）、核因子κB p65（NF-κB p65）抗体（货号：10745-1-AP）均购自武汉三鹰生物技术有限公司；RIPA强裂解液（货号：MA0151）、DEPC处理水（货号：MA0018）均购自大连美仑生物技术有限公司；RNAiso Plus［宝日医生物技术（北京）有限公司，货号：9109］；NovoScript^® Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix（货号：E047-01A）、NovoStart^® SYBR qPCR SuperMix Plus（货号：E096-01B）均购自苏州近岸蛋白质科技股份有限公司。

1.4 实验仪器

显影仪［易孛特生命科学（上海）有限公司，型号：TOUCH IMAGER xli］；酶标仪（广东丹利科技有限公司，型号：K3）；电子分析天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司，型号：BS224S）；组织研磨机（上海净信实业发展有限公司，型号：TISS-24）；超低温冷冻储存箱（中科美菱低温科技股份有限公司，型号：DW-HL340）；低速迷你离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，型号：WTL-4K）；微量冷冻离心机［贝克曼库尔特国际贸易（上海）有限公司，型号：Microfuge-22R］；荧光定量PCR仪（美国ABI公司，型号：7300）；小动物麻醉机（上海玉研科学仪器有限公司，型号：ABF）。

2 实验方法

2.1 造模方法

参照文献［7］建立输卵管阻塞性不孕症大鼠模型：术前禁食、禁饮12 h，2%～3%异氟烷气体吸入性麻醉大鼠后，仰卧位放置于手术台上，常规备皮、消毒，铺无菌巾，找到子宫和输卵管后，避开子宫角和卵巢连接处，左、右输卵管分别穿刺进针，缓慢注射0.05 mL金黄色葡萄球菌悬液，用止血钳夹闭针孔，防止菌液流出污染腹腔。术后逐层关腹，缝合切口。继续常规饲养1周后，参照文献［7］复制气滞血瘀型模型：声刺激应用定时打铃器以70 dB噪声刺激，每次10 min，每日刺激3次；光刺激采用不同颜色不同强度的闪烁光刺激大鼠，每次10 min，每日随机颜色和强度刺激3次；电刺激将大鼠固定于木板上，双足底给予频率2 Hz电针刺激，每次10 min，每日3次，连续应用声、光、电刺激21 d。

2.2 分组和干预

根据体质量按顺序1，2，3……编号，采用随机数字表法分为正常组、模型组和低、中、高剂量组，每组6只。模型组和低、中、高剂量组按“2.1”项下方法建立气滞血瘀型输卵管阻塞性不孕症大鼠模型；正常组正常饲养。造模成功后低、中、高剂量组分别按3.715、7.43、14.86 g/（kg·d）给予银红2号方药液灌胃，正常组和模型组按7.43 mL/（kg·d）给予生理盐水灌胃，每日均灌胃1次，每日灌胃时间10：00～12：00，连续干预11 d。

2.3 取材

实验鼠末次灌胃后取材。异氟烷吸入麻醉大鼠后取腹主动脉血，1 000 r/min离心10 min，血清装入EP管内，放入-20 ℃冰箱保存；分别取适量双侧输卵管组织放入EP管内，-80 ℃冰箱保存，用于后续ELISA、Western blot、qPCR实验。分别用于检测。

2.4 观察指标

2.4.1 ELISA法检测血清IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α和CD62E含量

将ELISA试剂盒于室温中平衡20 min，从箔袋中取出所需板条。设置标准品孔、空白孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50 μL，空白孔不加，样本孔中加入待测样本50 μL。除空白孔外，每孔加入100 μL辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体，用封板膜封住反应孔，放入37 ℃恒温箱温育1 h；配置洗涤液。弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350 μL），静置1 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次。每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃光孵育15 min。每孔加入终止液50 μL，15 min内，于450 nm波长处测定各孔的OD值，并计算IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α和CD62E含量。

2.4.2 Western blot检测输卵管组织IκBα、NF-κB p65、NIK、IKK蛋白表达量

把少量输卵管组织放入裂解液中充分裂解，采用布拉德福德法测定蛋白浓度。蛋白样品经变性、电泳、转膜、封闭后，置于IκBα（1∶8 000）、NF-κB p65（1∶12 000）、NIK（1∶12 000）、IKK（1∶6 000）一抗中，在4 ℃下摇床孵育过夜孵育；清洗后置于二抗（1∶15 000）室温摇床避光孵育1 h。显影检测，将目的蛋白灰度值/内参灰度值得到比值。

2.4.3 qPCR检测输卵管组织IL-8、MCP-1、VCAM-1、ICAM-1 mRNA相对表达水平

采用TriZol试剂提取输卵管组织中总RNA，去基因组DNA反应，反应物RNA，总RNA（0.1 ng·1 μg）μL，gDNA Purge（1 μL），gNase Free Water（至10 μL）。42 ℃孵育5 min，反应结束后冰上放置。逆转录反应：反应物得出第一步反应液10 µL、2×NovoScript^® Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix 10 μL，50 ℃孵育15 min，75 ℃孵育5 min，终止反应，逆转录产物贮存于-20 ℃。引物由福州尚亚生物技术有限公司合成，见表1。反应体系：上游引物0.4 μL、下游引物0.4 μL，2×NovoStart^® SYBR qPCR SuperMix Plus 10 μL、ddH₂O 7.2 μL。反应条件：95 ℃预变性1 min，循环1次；95 ℃变性20 s，56 ℃ 20 s，共循环40次；72 ℃ 38 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95℃ 15 s。采用2^-ΔΔCt法量化数据。

2.5 统计学方法

采用SPSS 26.0软件进行数据分析。计量资料符合正态分布以（\overline{x}±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，若方差齐，两两比较采用LSD-t检验；若方差不齐则采用Tamehane' T2检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结　果

3.1 5组血清IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α和CD62E含量比较

与正常组比较，模型组血清IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α和CD62E含量均明显升高（P＜0.05）。与模型组比较，低、中、高剂量组血清IL-1β含量明显降低（P＜0.05）；中剂量组血清IL-2、IL-6、TNF-α和CD62E含量均明显降低（P＜0.05）。见表2。

3.2 5组输卵管组织IκBα、NF-κB p65、NIK和IKK蛋白表达量比较

与正常组比较，模型组输卵管组织IκBα蛋白表达量明显降低（P＜0.05），NF-κB p65、NIK和IKK蛋白表达量均明显升高（P＜0.05）。与模型组比较，低剂量组输卵管组织IκBα蛋白表达量明显升高（P＜0.05）；低、中剂量组输卵管组织NF-κB p65、NIK和IKK蛋白表达量均明显降低（P＜0.05）。见图1、表3。

3.3 5组输卵管组织IL-8、MCP-1、VCAM-1和ICAM-1 mRNA相对表达水平比较

与正常组比较，模型组输卵管组织IL-8、MCP-1、VCAM-1和ICAM-1 mRNA相对表达水平均明显升高（P＜0.05）。与模型组比较，中剂量组输卵管组织IL-8、MCP-1、VCAM-1和ICAM-1 mRNA相对表达水平均明显降低（P＜0.05）。见表4。

4 讨　论

感染引起的炎症反应是导致输卵管阻塞的主要原因，各种常见致病菌如衣原体、支原体、细菌、病毒等侵犯生殖道黏膜，引起阴道炎、宫颈炎、子宫内膜炎等疾病，若治疗不及时、不彻底，均可上行感染导致输卵管黏膜粘连，进而阻塞输卵管通道^［8-9］。宫腔、盆腔手术所致生殖道黏膜损伤，若术后调护不当、劳累、体虚等因素均可导致生殖器官炎症，进一步引起输卵管阻塞不通。其他如阑尾炎、腹膜炎等周围邻近器官或组织发炎也可蔓延至盆腔引起输卵管阻塞不通。临床常规治疗多采用输卵管通液、介入治疗，或宫腹腔镜微创手术分离粘连、疏通宫腔^［10-11］，均属于有创疗法，花费较高。

输卵管阻塞性不孕症根据其临床表现可归属于中医学“不孕”“全不产”“断绪”等范畴。《格致余论·受胎论》中提到的“两歧”首次明确描述输卵管的形态。经行产后摄生不慎，邪入胞宫留瘀。在《神农本草经》中记载：“无子者多系冲任瘀血”，以及《诸病源候论·妇人杂病诸侯》中记载的“内生积聚，令绝子”均体现瘀阻冲、任、胞宫是引起不孕病的基本病机。全国名中医尤昭玲教授认为气滞、血瘀是输卵管障碍性不孕症的重要病机^［12］。我院名老中医孙坦村教授带领下的孙氏妇科是福建省中医药重点专科，多年来致力于不孕症的临床研究，孙老认为输卵管阻塞性不孕症以“气滞血瘀”为特点，治疗上宜采用理气、活血、化瘀的方法，具有理气活血化瘀功效的“银红2号方”在临床治疗输卵管阻塞性不孕症方面有着良好的疗效。方中橘核、红藤理气活血，为君药；桃仁、丹参活血祛瘀、通经止痛；莪术、三棱破血行气；䗪虫破血逐瘀，败酱草消痈排脓、祛瘀止痛，共为臣药；金银花、白花蛇舌草凉血消痈散结，为佐药；路路通疏肝理气、通经止痛为使药；全方共奏理气活血化瘀之效。

输卵管阻塞性不孕症存在炎症反应，在IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α等炎症因子作用下，由细胞外向细胞内传递信息，激活IKK和/或NIK，并导致IκB的丝氨酸残基磷酸化，IκBα在蛋白酶小体作用下发生降解，进而从NF-κB上脱落，NF-κB核定位信号暴露，NF-κB活化^［13］。然后，黏附分子ICAM-1、VCAM-1和CD62E表达增加，并与白细胞表面配体结合介导白细胞贴壁黏附，导致白细胞聚集、浸润。NF-κB通过调控IL-8、MCP-1等趋化因子的表达，进而募集中性粒细胞、单核巨噬细胞，引发输卵管炎症损伤和浸润，同时促进炎症因子的产生和释放增多，引起炎症反应加重，使输卵管损伤亦加重^［14-15］。本研究结果发现，与正常组比较，模型组血清炎症因子水平均升高；输卵管组织IκBα蛋白表达降低，NF-κB p65、NIK和IKK蛋白表达量升高，IL-8、MCP-1、VCAM-1和ICAM-1 mRNA相对表达水平均升高，提示气滞血瘀型输卵管阻塞性不孕症存在明显的炎症反应，NF-κB信号通路激活。银红2号方能够显著降低输卵管阻塞性不孕症大鼠血清炎症因子水平，下调输卵管组织NF-κB p65、NIK、IKK蛋白表达及IL-8、MCP-1、VCAM-1、ICAM-1的mRNA表达，上调IκBα蛋白表达，提示银红2号方能够通过调控NF-κB信号通路改善炎症反应，从而治疗气滞血瘀型输卵管阻塞性不孕症。

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基金资助

福建省自然科学基金项目(2022J011330)

福建省临床重点专科建设项目(闽卫医政函〔2022〕884 号)

福州市中医药传承创新平台(2021-S-WP3)