基于Fas信号通路探讨荣筋拈痛方改善骨关节炎软骨退变的作用机制

Mechanism of Rongjin Niantong Formula in Improving Cartilage Degeneration in Osteoarthritis Based on Fas Signaling Pathway

摘要

目的 基于Fas信号通路探讨荣筋拈痛方改善骨关节炎（OA）软骨退变的作用机制。 方法 将24只SD雄性大鼠分为对照组8只和造模组16只。造模组采用改良Hulth法建立OA大鼠模型，对照组在右膝关节内侧皮肤切开1 cm，完成切开即缝合。将造模成功的大鼠随机分为模型组和荣筋拈痛方组各8只，荣筋拈痛方组按4.6 g/（kg·d）给予荣筋拈痛方药液灌胃，对照组和模型组按体质量4 mL/（kg·d）给予0.9%生理盐水灌胃。每日灌胃1次，均连续灌胃12周。实验期间观察3组大鼠外观和日常行为，每周在固定时间测量3组大鼠体质量。检测3组血清丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、总胆红素（TBIL）、总蛋白（TP）、球蛋白（GLB）、肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）和尿酸（UA）含量；HE染色观察软骨组织病理形态学变化；Western blot检测软骨组织Fas、Fas相关死亡结构域蛋白（FADD）、p-FADD、p53蛋白表达量。 结果 实验期间大鼠整体生理状态良好，进食及进水正常，行为活动未见异常改变。HE染色观察发现，对照组软骨结构完整；模型组软骨各层结构破坏明显；荣筋拈痛方组软骨层次相对清晰。3组相同干预时间体质量以及干预后血清ALT、AST、TBIL、TP、GLB、Cr、BUN和UA含量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。与对照组比较，模型组软骨组织Fas、p53、FADD蛋白表达量均明显升高（P＜0.05），p-FADD蛋白表达量和p-FADD/FADD均明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，荣筋拈痛方组Fas、p53、FADD蛋白表达量均明显降低（P＜0.05），p-FADD蛋白表达量和p-FADD/FADD均明显升高（P＜0.05）。 结论 荣筋拈痛方可通过调节Fas信号通路抑制软骨细胞凋亡，改善OA大鼠软骨退变。

Abstract

Objective To investigate the mechanism of Rongjin Niantong formula in improving cartilage degeneration in osteoarthritis (OA) based on the Fas signaling pathway. Methods Twenty-four male SD rats were divided into a control group of 8 rats and a modeling group of 16 rats. The OA rat model was established using the modified Hulth method in the modeling group, while a 1 cm incision was made on the skin of the medial side of the right knee joint in the control group, which was sutured immediately after incision. The successfully modeled rats were randomly divided into model group and Rongjin Niantong formula group, with 8 rats in each group. The Rongjin Niantong formula group was administered with Rongjin Niantong formula solution by gavage at a dosage of 4.6 g/(kg·d), while the control and model groups were administered with physiological saline by gavage at a dosage of 4 mL/(kg·d). Gavage was performed once daily, and the treatment was continued for 12 consecutive weeks. The appearance and daily behavior of the three groups of rats were observed, and their body weight was measured at a fixed time each week during the experimental period. The serum levels of alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), total bilirubin (TBIL), total protein (TP), globulin (GLB), creatinine (CR), blood urea nitrogen (BUN), and uric acid (UA) were measured in three groups. HE staining was used to observe the pathological morphological changes of cartilage tissue. Western blot was used to detect the protein expressions of Fas, Fas-associated death domain protein (FADD), p-FADD and p53 in cartilage tissue. Results The overall physiological state of the rats was good, with normal food and water intake, and no abnormal changes in behavioral activities were observed during the experimental period. HE staining revealed that the cartilage structure in the control group was intact; the structure of each layer of cartilage in the model group was significantly damaged, while the layers of cartilage in the Rongjin Niantong formula group were relatively clear. There were no statistically significant differences in body weight and post-intervention serum levels of ALT, AST, TBIL, TP, GLB, CR, BUN, and UA among the three groups with the same intervention duration (P>0.05). Compared with the control group, the protein expressions of Fas, p53, and FADD in the cartilage tissue of the model group significantly increased (P<0.05), while the protein expression of p-FADD and the ratio of p-FADD/FADD significantly decreased (P<0.05). Compared with the model group, the protein expressions of Fas, p53, and FADD in the Rongjin Niantong formula group significantly decreased (P<0.05), while the protein expression of p-FADD and the ratio of p-FADD/FADD significantly increased (P<0.05). Conclusion Rongjin Niantong Formula can inhibit chondrocyte apoptosis and improve cartilage degeneration in OA rats by regulating the Fas signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

骨关节炎 / 荣筋拈痛方 / 软骨退变 / 细胞凋亡 / Fas信号通路

Key words

osteoarthritis / Rongjin Niantong formula / cartilage degeneration / apoptosis / Fas signaling pathway

骨关节炎（knee osteoarthritis，OA）是老年人群高发的慢性退行性疾病，以关节软骨进行性降解为核心病理特征，伴随滑膜炎症浸润和骨赘形成，其发病率高，病变后期患者关节活动受限，甚者导致残疾，对患者的生理、心理造成了严重的负担，目前亟需有效的治疗药物^［1-4］。OA软骨变性主要因为病理状态下软骨细胞自我修复能力显著下降，主要表现为软骨细胞活力降低、凋亡速度加快，最终导致软骨细胞代谢稳态失衡^［5］。软骨细胞在OA终末期表现为病理性肥大表型，该表型会导致软骨细胞外基质降解，加剧骨关节老化，最终导致软骨细胞凋亡^［6-7］。凋亡的软骨细胞常出现在软骨病变中，该凋亡细胞的特异性聚集被认为是OA进展的信号^［8］。研究表明，Fas信号通路涉及外源性软骨细胞凋亡信号转导^［9］，体外调节关节软骨细胞中的Fas受体，可以减少软骨细胞凋亡^［10］，该通路的激活已被证明介导骨关节炎软骨细胞的凋亡。因此，研究Fas信号通路抑制软骨细胞凋亡是延缓OA软骨退变的潜在治疗手段之一。尽管目前Fas信号通路介导细胞凋亡的机制已有深入的研究，但临床上针对Fas信号通路治疗OA的药物并不多见。

《清宫配方集成》中记载的荣筋拈痛方具有补益肝肾、强健筋骨、祛除风湿、通络止痛之效，以中医“肝肾同源”理论为指导，可有效改善风湿痹阻引起的筋骨疼痛^［11］。课题组前期研究表明，荣筋拈痛方可降低软骨细胞凋亡，延缓软骨细胞退变，有效缓解OA 软骨退变的病理进程^［12］。因此，本研究以OA大鼠模型为研究对象，通过检测软骨组织中Fas信号通路相关蛋白表达，初步研究荣筋拈痛方对Fas信号通路的影响，探讨荣筋拈痛方通过抑制软骨细胞凋亡过程延缓骨关节炎软骨退变的机制。

1 实验材料

1.1 实验动物

SPF级2月龄雄性SD大鼠24只，体质量（280±20）g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2017-0005。饲养于福建中医药大学实验动物中心，实验动物使用许可证号：SYXK（闽）2019-0007。饲养环境适宜，恒温恒湿，饲料为标准化配方饲料，自由采食，自由饮水。本实验由福建中医药大学实验动物伦理委员会审批（批准文号：FJTCM IACUC 2019062）。

1.2 实验药物

荣筋拈痛方由牛膝、当归、羌活、独活、防风、甘草组成，购自福州市闽侯县上街镇致诚医药商店。按药材质量（g）∶水体积（L）＝1∶12比例加水煎煮2 h，随后冷却至室温后过滤，应用控温式水浴锅浓缩滤液浓度制成含生药量1.15 g/mL的荣筋拈痛方药液，室温条件下冷却后转移至-20 ℃冷藏保存，灌胃时提前解冻并放于热水中温热后使用。

1.3 实验试剂

血清丙氨酸转氨酶（ALT，货号：ml076532）、天冬氨酸转氨酶（AST，货号：ml059334）、肌酐（Cr，货号：M12C4L）、尿素氮（BUN，货号：ml076479）、尿酸（UA，货号：ml076336）试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司；总胆红素（TBIL，货号：LM115A）、总蛋白（TP，货号：LT402F）、球蛋白（GLB，货号：LT417）均购自美康生物科技股份有限公司；蛋白酶抑制剂PMSF（货号：ST506-2）、RIPA裂解液（货号：P0013B）均购自上海碧云天生物技术有限公司；苏木素-伊红染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号：G1140）；p53抗体（货号：60283-2-Ig）、Fas相关死亡结构域蛋白（FADD）抗体（货号：14906-1-AP）均购自武汉三鹰生物技术有限公司；Anti-CD95/FAS抗体（武汉博士德生物工程有限公司，货号：BA0484）；p-FADD（Ser194）抗体（美国Affinity Biosciences公司，货号：DF2996）；vinculin 抗体（美国Cell Signaling Technology公司，货号：13901S）；羊抗鼠IgG（货号：M21001S）抗体、羊抗兔IgG（货号：M21002S）抗体均购自艾比玛特医药科技上海有限公司。

1.4 实验仪器

凝胶成像系统、基础电泳仪均购自美国Bio-Rad公司；超薄切片机（型号：UC6）、生物专用显微镜（型号：DM2700P）均购自德国Leica公司；全自动生化分析仪（日本株式会社日立高新技术公司，型号：7180）。

2 实验方法

2.1 分组、造模及干预

适应性饲养1周后，将24只SD雄性大鼠分为对照组8只和造模组16只。造模组采用改良Hulth法建立OA大鼠模型^［13］，对照组在右膝关节内侧皮肤切开1 cm，完成切开即缝合。造模结束后，连续3 d按20万U/d肌肉注射青霉素预防感染。造模后4周，若大鼠膝关节出现轻微红肿，则表明造模成功^［14］。将造模成功的大鼠随机分为模型组和荣筋拈痛方组，每组8只。动物剂量按照临床成人等效剂量换算，荣筋拈痛方组按4.6 g/（kg·d）给予荣筋拈痛方药液灌胃，对照组和模型组按体质量4 mL/（kg·d）给予0.9%生理盐水灌胃。每日灌胃1次，均连续灌胃12周，每周根据体质量调整灌胃剂量。

2.2 动物取材

干预12周后取材，术前禁食12 h，不禁水。大鼠经1.5%异氟烷吸入麻醉后，仰卧位固定，行腹部正中切口，充分暴露并分离腹主动脉，使用一次性真空采血促凝管取腹主动脉血5 mL，采集血液的离心管置于4 ℃冰箱中冷藏2 h，再转移至4 ℃离心机中，以3 500 r/min的转速离心15 min，分离血清，血清样本冻存于-80 ℃冰箱备用。采血结束后打开膝关节，剥离膝关节周围的肌肉和韧带等非关节组织。每组随机选取3只大鼠，切除右侧膝关节，4%多聚甲醛固定后，用于后续HE染色；收集剩余大鼠右侧膝关节股骨髁及胫骨平台的软骨组织，放至-80 ℃冰箱冷冻保存，用于后续Western blot实验。

2.3 观察指标

2.3.1 一般情况观察和体质量测量

在实验期间，对3组大鼠外观、日常行为进行观察，每周在固定时间测量3组大鼠体质量。实验前将电子秤调零校准，操作时轻柔抓握大鼠，使其保持自然放松状态，连续称量3次并计算均值作为最终体质量数据。在测量结果中排除系统报错的数据，留下正确的数据将其求取均值后进行统计，保证数据采集过程中的可靠性。

2.3.2 血清生化指标检测

按试剂盒说明书进行操作，检测血清ALT、AST、TBIL、TP、GLB、Cr、BUN和UA含量。

2.3.3 HE染色观察软骨组织病理形态学

经固定及脱钙常规处理后的膝关节软骨组织样本，继续进行烘片与烤片，切片样本经不同浓度的二甲苯透明脱蜡处理各1 h，不同浓度无水乙醇梯度脱水处理各5 min，于超纯水中浸泡5 min后，置于苏木精染液中浸泡3 min，分化液快速浸泡2 s，流水缓慢冲洗1 min，1%盐酸乙醇溶液返蓝2 s使细胞核着色后，继续用5%伊红染液染色3 s后终止。最后滴加中性树脂胶封上盖玻片完成封片，在显微镜下观察染色情况。

2.3.4 Western blot检测软骨组织Fas信号通路相关蛋白表达量

在液氮环境中进行软骨组织的破碎、裂解、高速离心，提取各组软骨组织总蛋白，用BCA法定量检测总蛋白浓度。经上样、电泳、转膜、封闭后，置于Fas（1∶1 000）、FADD（1∶2 000）、p-FADD（1∶2 000）、p53（1∶2 000）一抗中过夜，清洗后置于二抗（1∶5 000）孵育1 h后，使用ECL发光液在凝胶成像系统中显色显影，并使用ImageJ分析内参和目的蛋白的灰度值，获取相关蛋白表达量。

2.4 统计学方法

采用SPSS 27.0软件对数据进行分析。计量资料符合正态分布以（\overline{x}±s）表示，组内比较采用单因素方差分析，方差齐时两两比较采用LSD-t检验，方差不齐时采用Games-Howell检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 结　果

3.1 3组不同干预时间体质量比较

实验期间大鼠整体生理状态良好，进食及进水正常，行为活动未见明显异常改变。3组相同干预时间体质量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见图1。

3.2 3组血清相关生化指标比较

3组血清ALT、AST、TBIL、TP、GLB、Cr、BUN和UA含量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

3.3 3组膝关节软骨组织病理形态变化

对照组软骨组织各层结构清晰可辨，切向层完整且连续，基质与细胞质染色后呈均匀淡红，移行层、径向层与钙化层各层细胞纵向排列规整且界线明确；模型组软骨组织切向层断裂、厚度缩减，纤维排列无序，软骨细胞外露并成簇聚集，移行层与放射层细胞分布失序，局部异常钙化，钙化层与软骨下骨交界的粘连线呈波浪状，且连续性受损；荣筋拈痛方组软骨组织切向层与关节面保持平行且结构完备，组织层次较模型组显著改善，整体结构基本恢复，但结构层次不及对照组清晰。见图2。

3.4 3组软骨组织Fas信号通路相关蛋白表达量比较

与对照组比较，模型组软骨组织Fas、FADD、p53蛋白表达量均明显升高（P＜0.05），p-FADD蛋白表达量和p-FADD/FADD均明显降低（P＜0.05）。与模型组比较，荣筋拈痛方组Fas、FADD、p53蛋白表达量均明显降低（P＜0.05），p-FADD蛋白表达量和p-FADD/FADD均明显升高（P＜0.05）。见表2、图3。

4 讨　论

OA归属于中医学“骨痹”范畴，中医病机为本虚标实，肝、脾、肾多脏亏虚致机体亏虚，加之风、寒、湿等外邪阻滞经络，或日久因虚致瘀、痰瘀互结而痹阻经络，治疗当以扶正祛邪之法^［15-16］。荣筋拈痛方中牛膝、当归为补，益肝、养血、荣筋以固本；羌活、独活、防风为攻，祛风、散寒、除湿以治标；甘草调和诸药，达到“攻邪不伤正，扶正不留邪”的组方精髓。课题组前期研究结果显示，荣筋拈痛方干预IL-1β诱导的退变软骨细胞，可调控软骨细胞周期，增强软骨细胞活力，预防软骨细胞受损，且可调节炎症相关信号通路抑制软骨细胞炎性凋亡^［17-18］。

本研究结果显示，干预期间3组大鼠的体质量差异均无统计学意义，表明荣筋拈痛方并未影响大鼠的生长状态；3组大鼠血清肝功能和肾功能指标差异均无统计学意义，表明荣筋拈痛方并未表现出明显的毒副作用。HE病理染色结果显示：模型组大鼠软骨组织变薄，软骨表面粗糙，软骨结构紊乱，表明造模成功；与模型组比较，荣筋拈痛方组软骨缺损状态得到修复，软骨结构各层次清晰完整，细胞形态更加完整均匀，这表明荣筋拈痛方可改善软骨损伤^［19］。

Fas是一种死亡结构域受体，属于肿瘤坏死因子受体家族成员，它作为软骨细胞凋亡的关键标志物，能与Fas配体（FasL）结合，启动细胞凋亡信号，介导多种细胞凋亡过程^［20］。Fas信号通路作为经典的膜受体介导的细胞凋亡调控途径，在类风湿关节炎滑膜组织中呈现高表达特征^［21］。Fas/FasL信号轴异常激活与骨关节炎等软骨细胞过度凋亡密切相关。在OA软骨中，Fas死亡受体呈现显著的表层-中层软骨细胞特异性富集。当Fas处于激活状态时，它与FasL相结合后会招募FADD，形成死亡诱导信号复合体DISC，继而激活含半胱氨酸的天冬氨酸特异性蛋白酶（Caspase）-8和Caspase-3，最终形成细胞凋亡现象^［22］。研究证实，该通路异常活化与关节软骨退行性变化密切相关^［23］。当关节软骨发生退行性变化时，软骨细胞p53表达增高，通过上调Fas增强其对FasL的敏感性，进而激活Fas介导的下游信号级联，最终促进软骨细胞凋亡^［24］。且现有研究表明，FADD磷酸化状态可通过影响细胞周期来抑制细胞凋亡过程^［25］。本研究结果显示，与模型组相比较，荣筋拈痛方组大鼠关节软骨的退变程度明显变轻，Fas、FADD和p53蛋白表达大幅下降，p-FADD蛋白表达及p-FADD与FADD两者比值显著上调，这表明荣筋拈痛方通过Fas信号通路抑制细胞凋亡作用与延缓OA大鼠软骨退变存在关联。究其根本，荣筋拈痛方干预后，会通过下调软骨组织中p53的表达，抑制Fas信号通路及促进FADD磷酸化，从而减少软骨细胞凋亡，延缓OA软骨退变。

综上所述，荣筋拈痛方可通过调节Fas信号通路抑制软骨细胞凋亡，改善OA大鼠软骨退变，为荣筋拈痛方治疗OA提供实验支撑。此外，本研究仍存在一些不足，如荣筋拈痛方是否通过Fas调节其核心蛋白FADD磷酸化与去磷酸化修饰抑制细胞凋亡的分子机制尚不明确，需在后续实验中进一步验证。

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基金资助

国家自然科学基金青年科学基金项目(82305267)

福建省自然科学基金项目(2022J01371)