栝楼桂枝汤调控NOX减轻脑缺血再灌注大鼠氧化应激损伤的机制研究

Mechanism of Gualou Guizhi Decoction in Alleviating Oxidative Stress Injury in Rats with Cerebral Ischemia-Reperfusion by Regulating NOX

摘要

目的 探讨栝楼桂枝汤和通过调控烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NOX）改善脑缺血再灌注大鼠氧化应激损伤的作用机制。 方法 将60只SD雄性大鼠按照随机数表法分为假手术组、模型组和栝楼桂枝汤组，每组20只。假手术组仅钝性分离皮下组织和肌肉，暴露颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，不进行线栓插入。模型组和栝楼桂枝汤组大鼠制备大脑左侧中动脉阻塞（MCAO）模型，栝楼桂枝汤组在模型制备成功后，按剂量7.08 mL/（kg·d）连续灌胃给予栝楼桂枝汤水煎液7 d，1次/d。假手术组和模型组则给予等量生理盐水灌胃，1次/d，共7 d。采用MRI观察脑梗死体积，HE染色观察脑组织的病理改变情况，以及分光光度法检测NOX活性水平；同时采用qPCR和Western blot实验检测NOX1、NOX2 mRNA转录水平和蛋白表达量；采用Caspase-3活性试剂盒检测其活性水平。 结果 MRI结果提示，假手术组无缺血梗死区，模型组大鼠缺血侧出现较大片梗死区。栝楼桂枝汤组缺血侧脑组织的梗死体积较模型组明显降低（P＜0.05）。病理形态学观察显示，假手术组脑组织结构完整，神经元形态正常；模型组缺血侧脑组织结构破坏明显，神经元排列紊乱、核固缩，伴大量细胞凋亡与坏死。同时，与假手术组比较，模型组脑组织NOX活性显著升高（P＜0.05），NOX1、NOX2的mRNA转录水平及蛋白表达量均显著上调（P＜0.05），凋亡相关蛋白Caspase-3活性亦显著升高（P＜0.05）。与模型组比较，栝楼桂枝汤组大鼠脑组织病理损伤明显减轻，细胞坏死减少；NOX、Caspase-3活性和NOX1、NOX2 mRNA转录与蛋白表达量均较模型组显著降低（P＜0.05）。 结论 GLGZD可能通过调节脑缺血再灌注后NOX介导的氧化应激反应来抑制神经元凋亡并减轻神经组织损伤。

Abstract

Objective To explore the mechanism by which Gualou Guizhi Decoction (GLGZD) mitigates oxidative stress injury in rats with cerebral ischemia-reperfusion by regulating NADPH oxidase (NOX). Methods Sixty male Sprague-Dawley (SD) rats were randomly assigned to sham operation group, model group, and GLGZD group using a random number table, with 20 rats in each group. In the sham operation group, only the subcutaneous tissue and muscles were bluntly dissected to expose the common carotid artery, external carotid artery, and internal carotid artery, without filament insertion. The model and GLGZD groups underwent middle cerebral artery occlusion (MCAO) modeling. After successful modeling, the GLGZD group received intragastric administration of GLGZD at a dose of 7.08 mL/kg per day for 7 consecutive days, while the sham operation group and model group were received an equal volume of normal saline via intragastric administration once daily for 7 days. Magnetic resonance imaging (MRI) was used to assess cerebral infarction volume; hematoxylin and eosin (HE) staining was employed to examine pathological changes in brain tissue; and spectrophotometry was utilized to measure NOX activity levels. Additionally, quantitative polymerase chain reaction (qPCR) and Western blot analyses were performed to detect the mRNA transcription levels and protein expression of NOX1 and NOX2. The activity level of Caspase-3 was measured using a Caspase-3 activity assay kit. Results MRI results indicated no ischemic infarction area in the sham operation group, while a large infarction area was detected in the ischemic hemisphere of the model group. The infarction volume in the ischemic brain tissue of the GLGZD group was significantly diminished compared to that in the model group (P0.05). Pathomorphological observation revealed intact brain tissue structure and normal neuronal morphology in the sham operation group. In contrast, the ischemic hemisphere of the model group presented significant structural damage, disordered neuronal arrangement, nuclear pyknosis, accompanied by extensive apoptosis and necrosis. Furthermore, compared with the sham operation group, the NOX activity in the brain tissue of the model group increased significantly (P0.05). The mRNA transcription levels and protein expression of NOX1 and NOX2 were significantly up-regulated (P0.05), and the activity of the apoptosis-related protein Caspase-3 was also significantly elevated (P0.05). Compared with the model group, brain tissue in the GLGZD group showed significantly alleviated pathological injury and reduced cellular necrosis. The NOX activity, mRNA transcription and protein expression levels of NOX1 and NOX2, as well as Caspase-3 activity, were all significantly lower in the GLGZD group than in the model group (P0.05). Conclusion GLGZD may inhibit neuronal apoptosis and alleviate nerve tissue injury by modulating the NOX-mediated oxidative stress response subsequent to cerebral ischemia-reperfusion.

Graphical abstract

关键词

脑缺血再灌注 / 栝楼桂枝汤 / 氧化应激 / NOX

Key words

cerebral ischemia-reperfusion / Gualou Guizhi Decoction / oxidative stress / NOX

脑动脉闭塞后的缺血性脑卒中是全球慢性残疾的主要原因之一，目前仍然缺乏有效的方法来促进卒中后的功能恢复^［1］。缺血性脑卒中发生后，大脑血液供应严重不足，导致脑部氧气供应不足，进而引发神经元死亡。缺血性脑卒中发生后，血管阻塞将产生过度活性氧（reactive oxygen species，ROS），氧化应激加剧了神经元损伤并导致严重的运动功能和认知功能缺陷^［2］。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH oxidase，NOX）的激活可促进ROS生成及其介导的神经细胞死亡。其中，NOX1、NOX2在中枢神经系统多种细胞中均有表达^［3］，且在缺血性脑卒中的进展中发挥重要作用^［4］。因此，调控NOX表达以减轻氧化应激损伤、减少神经元死亡，有望成为改善卒中后神经功能缺损的重要途径。

卒中后肢体痉挛多因阴血亏虚、筋脉失养所致，治宜祛风散邪、扶正养筋。经典复方栝楼桂枝汤功擅解肌祛邪、舒缓筋脉^［5］，与本病病机治法高度契合。课题组前期研究证实了其具有神经保护作用，可减轻脑缺血后神经元损伤并抑制活性氧（ROS）过量生成^［6-7］。脑缺血再灌注损伤是卒中后痉挛的关键病理环节，而NOX家族（尤其是NOX1、NOX2）是调控ROS生成、介导氧化应激损伤的核心分子。基于前期研究基础，本研究进一步探讨栝楼桂枝汤是否通过调控NOX、抑制ROS过量生成以减轻氧化应激损伤，为其临床治疗卒中后肢体痉挛提供实验依据。

1 实验材料

1.1 实验动物及试剂

SPF级健康雄性SD大鼠60只，购自上海斯莱克实验动物责任有限公司，动物生产许可证号：SCXK（泸）2017-0005，实验动物饲养于福建中医药大学科技创新与转化中心实验动物平台。动物使用许可证号：SYXK（闽）2019-0007。本研究严格遵循动物伦理相关规定，并通过福建中医药大学动物伦理委员会审核（实验动物伦理编号：FJTCM IACUL 2020086）。

栝楼桂枝汤组方购自福建中医药大学第三附属医院国医堂；苏木素伊红染色试剂盒（批号：G1140）和NADPH氧化酶（NOX）活性检测试剂盒（批号：BC0630）均购自北京索莱宝科技有限公司；RIPA蛋白裂解液（武汉博士德生物公司，批号：AR1017）；GAPDH抗体（北京博奥森公司，批号：bsm-0978M）；NOX1抗体（批号：ab131088）和NOX2抗体（批号：ab129068）均购自美国abcam公司；Caspase-3活性检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号：C1116）。

1.2 实验仪器

小动物核磁共振成像仪（德国BRUKER公司，型号：Bio Spec 70/20 USR）；生物组织自动脱水机（湖北孝感宏业医用仪器有限公司，型号：TS-12D）；石蜡切片机（美国Thermo-Fisher公司，型号：HM325）；倒置荧光显微镜（德国Leica公司，型号：DMi8）；酶标仪（美国Biotek公司，型号：ELX 800）；凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司，型号：Gel Doc XR+）。

2 实验方法

2.1 动物模型构建

制备大鼠左侧大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型^［8］：用2%的戊巴比妥钠麻醉大鼠，暴露大鼠颈总动脉、颈内动脉以及颈外动脉，取线栓插入颈外动脉，并将其向前穿入颈内动脉，直至线栓尖端到达大脑中动脉的起始处，导致大脑中动脉供血区域的血流中断，插线时间设置为1.5 h，之后退出线栓，恢复供应血液，构建脑缺血再灌注模型。

2.2 实验药物制备

称取栝楼根30 g，桂枝9 g，生姜9 g，白芍9 g，大枣9 g，甘草6 g，清水冲洗药材后，加入适量的水浸泡药材1 h，小火煎煮并过滤药液2次，二次滤液合并浓缩成栝楼桂枝汤水提液，浓度为1.06 g/mL。

2.3 大鼠分组及药物干预方法

将60只SD雄性大鼠按照随机数表法分为假手术组、模型组和栝楼桂枝汤组，每组20只。假手术组仅钝性分离皮下组织和肌肉，暴露颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，不进行线栓插入。模型组和栝楼桂枝汤组大鼠按照“2.1”项下方法制备MCAO模型，栝楼桂枝汤组在模型制备成功并完成手术当天评分后，随即按7.08 mL/（kg·d）灌胃给予栝楼桂枝汤水煎液，连续灌胃给药7 d，假手术组和模型组则给予等量生理盐水灌胃。1次/d，共7 d。

2.4 核磁共振成像检测脑梗死体积

大鼠干预结束后进行麻醉，应用MRI对大鼠脑部进行T2加权成像（T2-WI），具体设置参数为TR 4 000 ms，TE 40 ms，层厚 2 mm，层数21层，扫描时间为4 min 28 s 800 ms。ImageJ图像分析软件对扫描得到的MRI图像进行观察和分析，计算梗死灶的体积。

2.5 HE染色观察大脑缺血侧皮层组织的病理变化

取脑组织进行石蜡包埋切片，脱蜡复水后，浸入苏木素中5～8 min染核，超纯水清洗后，分化液分化1 min，超纯水清洗后进行伊红染色并冲洗，待切片干燥后，采用中性树脂封片，使用光学显微镜于200倍镜下观察并拍摄大脑缺血侧皮层组织的病理变化。

2.6 分光光度法检测NOX活性

称取0.1 g脑组织，提取并分离胞浆和线粒体蛋白，进行蛋白浓度测定，设置对照管和测定管，按说明书在比色皿中加入试剂和样本，37 ℃准确反应80 s，分光光度计检测吸光度值，并计算NOX活性。

2.7 qPCR法检测NOX mNA转录水平

提取脑组织RNA，用TRIzol充分研磨组织，冰上裂解并收集裂解液提取总RNA，检测其浓度，进行cDNA逆转录，设计并合成引物，引物序列见表1。构建qPCR反应体系后，GAPDH为内参基因，于荧光定量PCR仪进行扩增反应，用2^-ΔΔCt计算目的基因转录水平。

2.8 Western blot检测NOX1和NOX1蛋白表达量

取脑组织加入蛋白裂解液研磨，收集裂解液离心，取上清液行BCA蛋白定量，蛋白变性后调整上样浓度，进行蛋白质凝胶电泳。电泳结束后将蛋白转至PVDF膜上。转膜结束将膜浸泡于封闭液中封闭30 min，然后孵育一抗NOX1（1∶5 000）、NOX2（1∶5 000）和GAPDH（1∶5 000），4 ℃过夜，接着二抗室温孵育1 h，应用显影液避光显色，采用凝胶成像系统进行半定量分析。

2.9 比色法检测缺血脑组织中Caspase-3活性

取脑组织加入裂解液，在冰浴上匀浆后再裂解5 min，4 ℃ 20 000 g离心10 min，取蛋白上清。配制0、10、20、50、100和200 μmol/L标准品，待测样品和标准品均加入10 μL Ac-DEVD-pNA（2 mmol/L）底物适当混匀，用酶标仪于405 nm处检测吸光度值。

2.10 统计学方法

采用SPSS 22.0软件分析，采用Shapiro-Wilk检验进行正态性检验及Levene检验进行方差齐性检验，服从正态分布的数据以（\overline{x}±s）表示，若方差齐则采用LSD-t法进行两两比较，方差不齐则采用Games-Howell法进行两两比较，不服从正态分布的数据以［M（P₂₅，P₇₅）］表示，采用Boxferroni校正的Mann-Whitney U检验。P＜0.05认为差异具有统计学意义。

3 结　果

3.1 3组缺血侧脑梗死体积比较

MRI结果提示，假手术组无缺血梗死区，模型组大鼠缺血侧出现较大片梗死区。与模型组比较，栝楼桂枝汤组缺血侧脑组织的梗死体积明显降低（P＜0.05）。见图1。

3.2 3组缺血脑组织区病理变化

与假手术组比较，模型组大鼠缺血侧脑组织出现大量结构被破坏，神经元结构不清晰，细胞排列混乱、细胞核固缩等细胞凋亡和坏死现象；与模型组比较，栝楼桂枝汤组病理损伤程度和组织紊乱程度减轻，坏死细胞减少。见图2。

3.3 3组脑组织中NOX活性水平比较

见图3。

3.4 3组缺血侧脑组织中NOX1和NOX2 mRNA转录水平和蛋白相对表达量比较

与假手术组比较，模型组脑组织NOX1、NOX2的mRNA转录水平及蛋白表达量均显著上调（P＜0.05）；与模型组比较，栝楼桂枝汤组上述指标则显著降低（P＜0.05）。见图4和图5。

3.5 3组缺血侧脑组织Caspase-3活性比较

见图6。

4 讨　论

在缺血性脑卒中的众多病理机制中，氧化应激被认为是一个重要的潜在因素^［9］，它是由ROS的产生与抗氧化防御系统之间的失衡所导致的。ROS是氧化应激的核心，其增加会改变神经细胞结构和酶的活性^［10-11］，使梗死部位的细胞快速死亡，进一步加剧血液成分外渗及炎症反应，造成不可逆的脑组织损伤^［12］，调节ROS水平可能是治疗缺血性脑卒中的一种有效方法。ROS是NOX家族的主要功能产物^［13］。NOX是一种多亚基复合物，由2个膜相关亚基和4个胞质亚基组成。当胞质亚基转移到细胞膜上时，NOX就会被激活，从而将电子传递给氧气，进而产生超氧化物^［14］。超氧化物的过量产生则具有破坏性，在缺血性脑损伤的发展进程中起着重要作用。目前已鉴定出7个NOX家族成员，其中NOX1和NOX2在中枢神经系统的神经元及小胶质细胞中表达最为丰富^［15］。在缺血性脑损伤中抑制NOX具有神经保护作用，NOX抑制剂在动物实验和临床试验中均展现出作为缺血性脑卒中新药的潜力^［16］。

栝楼桂枝汤记载于张仲景《金匮要略》，组方为栝楼根、桂枝、白芍、甘草、生姜、大枣。栝楼根和白芍合用可濡养筋脉；大枣、生姜合用，调和营卫之气；甘草则调和诸药，全方可发挥养营生津、柔润筋脉的功效，临床应用可明显缓解卒中后痉挛。有研究显示，由于脑组织处于低灌注状态，导致神经组织不可逆的损伤，进而诱发肢体痉挛^［17］。本研究结果证实栝楼桂枝汤能显著降低实验性缺血再灌注脑卒中的梗死体积，具有明确的神经细胞保护作用^［18］，其作用机制与栝楼桂枝汤抑制神经细胞凋亡、抑制过度神经炎性损伤及活性氧的过量生成相关^［19］。此外，本研究结果还提示，栝楼桂枝汤不仅可以降低大鼠患侧脑梗死体积，还可部分逆转缺血区脑组织的神经细胞病理损伤，发挥神经保护作用。前期研究已证实栝楼桂枝汤可降低MCAO大鼠的ROS的含量^［19］，本研究结果进一步提示栝楼桂枝汤还可降低NOX的活性水平，同时下调NOX1和NOX2基因及蛋白的表达水平，即栝楼桂枝汤可能通过抑制NOX的激活进而减少ROS的生成，降低缺血再灌注后的氧化应激水平。Caspase-3又称凋亡素，是细胞凋亡过程中的关键执行者，Caspase-3激活是凋亡启动的重要标志，其活化后能剪切多种底物蛋白，最终导致细胞凋亡。本实验结果提示，栝楼桂枝汤能够显著激活Caspase-3表达，进而抑制缺血侧脑神经细胞凋亡。以上实验结果揭示了栝楼桂枝汤可能通过NOX调控卒中后的氧化应激水平来抑制神经损伤，从而保护神经细胞和改善神经功能。后续研究将从神经炎症、兴奋性毒性、钙超载等重要病理机制进一步探讨栝楼桂枝汤保护神经元的多重作用机制，为临床用药提供更为详实的实验依据。

参考文献

[1] FEIGIN V L， BRAININ M， NORRVING B，et al. World stroke organization：global stroke fact sheet 2025 ［J］. Int J Stroke，2025，20（2）：132-144.

[2] ZHOU M Q， XIN J Y， CHEN J Y，et al. Scientific landscape of oxidative stress in stroke：from a bibliometric analysis to an in-depth review ［J］. Neurochem Res，2023，48（11）：3327-3348.

[3] HARRIGAN T J， ABDULLAEV I F， JOURD'HEUIL D，et al. Activation of microglia with zymosan promotes excitatory amino acid release via volume-regulated anion channels：the role of NADPH oxidases ［J］. J Neurochem，2008，106（6）：2449-2462.

[4] RADERMACHER K A， WINGLER K， LANGHAUSER F，et al. Neuroprotection after stroke by targeting NOX4 as a source of oxidative stress ［J］. Antioxid Redox Signal，2013，18（12）：1418-1427.

[5] 钟兴华，杨劲博，胡海霞. 栝楼桂枝汤调节小胶质细胞活化后的表型转化缓解脑缺血再灌注大鼠模型的神经损伤［J］. 福建中医药，2023，54（11）：30-34.

[6] ZHU X Q， HU H X， LI Z F，et al. Gua Lou Gui Zhi decoction attenuates post-stroke spasticity via the modulation of GABAB receptors ［J］. Mol Med Rep，2015，12（4）：5957-5962.

[7] 胡海霞，杨劲博，林心君，等. 栝楼桂枝汤调控沉默信息调节因子1通路介导的氧化应激对神经细胞损伤的保护作用［J］. 中国临床药理学杂志，2023，39（12）：1738-1742.

[8] LONGA E Z， WEINSTEIN P R， CARLSON S，et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats ［J］. Stroke，1989，20（1）：84-91.

[9] HUANG D D， SIAW-DEBRAH F， WANG H，et al. Transplanting Rac1-silenced bone marrow mesenchymal stem cells promote neurological function recovery in TBI mice ［J］. Aging，2020，13（2）：2822-2850.

[10] LI G L， YE C S， ZHU Y，et al. Oxidative injury in ischemic stroke：a focus on NADPH oxidase 4 ［J］. Oxid Med Cell Longev，2022，2022：1148874.

[11] TZIVELEKA L A， TAMMAM M A， TZAKOU O，et al. Metabolites with antioxidant activity from marine macroalgae ［J］. Antioxidants，2021，10（9）：1431.

[12] HE R Y， JIANG Y B， SHI Y J，et al. Curcumin-laden exosomes target ischemic brain tissue and alleviate cerebral ischemia-reperfusion injury by inhibiting ROS-mediated mitochondrial apoptosis ［J］. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl，2020，117：111314.

[13] BEDARD K， KRAUSE K H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases：physiology and pathophysiology ［J］. Physiol Rev，2007，87（1）：245-313.

[14] KIM J Y， PARK J， LEE J E，et al. NOX inhibitors—a promising avenue for ischemic stroke ［J］. Exp Neurobiol，2017，26（4）：195-205.

[15] INFANGER D W， SHARMA R V， DAVISSON R L. NADPH oxidases of the brain：distribution，regulation，and function ［J］. Antioxid Redox Signal，2006，8（9/10）：1583-1596.

[16] YANG Q W， HUANG Q Y， HU Z P，et al. Potential neuroprotective treatment of stroke：targeting excitotoxicity，oxidative stress，and inflammation ［J］. Front Neurosci，2019，13：1036.

[17] 丁千. 栝楼桂枝汤辅治脑卒中后下肢痉挛患者的临床效果及对提高日常生活与活动能力的作用［J］. 临床合理用药杂志，2021，14（32）：45-47.

[18] 谢风帆，张玉琴，赖文芳，等. 栝楼桂枝汤通过抑制小胶质细胞活化改善大鼠脑缺血/再灌注损伤［J］. 中国药理学通报，2020，36（5）：703-709.

[19] 杨劲博，钟兴华，林心君，等. 基于Sirt1通路探讨栝楼桂枝汤对缺血性卒中后神经元损伤的保护作用［J］. 中国现代药物应用，2022，16（23）：180-184.

基金资助

国家自然科学基金项目(82574823)

福建中医药大学校管课题(X2024013)