加减补阳还五汤对慢性间歇性低氧脑损伤的神经保护机制

Neuroprotective Mechanism of Modified Buyang Huanwu Decoction in Chronic Intermittent Hypoxia-Related Brain Injury

摘要

目的 探讨加减补阳还五汤通过蛋白激酶B1（Akt1）/丝裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）/Wnt/β-连环蛋白（CTNNB1）信号通路对慢性间歇性低氧所致脑损伤的保护机制。 方法 将30只雄性SD大鼠按照随机数字表法分为常氧组、模型组和中药组，每组10只。常氧组不予任何干预，模型组和中药组采用间歇低氧干预，8 h/d，中药组于每日低氧暴露前后30 min按照13.86 g/kg灌胃加减补阳还五汤，每日2次，共干预18周。通过Y迷宫检测总进臂次数及自发交替反应率；HE染色观察脑组织形态；透射电镜观察脑细胞线粒体超微结构；TUNEL染色法检测海马组织细胞的凋亡情况；ELISA法检测血清丙二醛（MDA）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、超氧化物歧化酶（SOD）、白细胞介素-6（IL-6）水平；蛋白免疫印迹法（Western blot）检测海马组织中Akt1、MAPK3、CTNNB1、半胱天冬酶-3（Caspase-3）蛋白表达量。 结果 与常氧组比较，模型组自发交替反应率降低（P＜0.05），细胞数减少、排列紊乱，伴有炎症细胞浸润及间质水肿，细胞核固缩，线粒体肿胀，嵴断裂及空泡化，TUNEL阳性细胞数量增加（P＜0.05），并呈现核固缩、染色质凝聚，TNF-α、MDA和IL-6水平升高（P＜0.05）、SOD水平降低（P＜0.05），Akt1、CTNNB1蛋白表达量降低（P＜0.05），Caspase-3蛋白表达量显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，中药组自发交替反应率显著提高（P＜0.05），细胞排列稍乱，但层次增多，未见肿胀及炎症，且线粒体形态规则，空泡化减轻，TUNEL阳性细胞数量减少（P＜0.05），细胞核形态基本正常，TNF-α、MDA及IL-6水平均下调（P＜0.05），而SOD水平上升（P＜0.05），Caspase-3蛋白表达量显著降低（P＜0.05），Akt1、MAPK3、CTNNB1的蛋白表达量则显著上升（P＜0.05）。 结论 加减补阳还五汤能够抑制氧化应激与炎症反应，改善大鼠慢性间歇性缺氧所致脑损伤。其机制可能与海马组织中Akt1、MAPK3、CTNNB1蛋白表达量增加以及Caspase-3的蛋白表达量减少有关。

Abstract

Objective To investigate the protective mechanism of Modified Buyang Huanwu Decoction against brain injury induced by chronic intermittent hypoxia (CIH) through the protein kinase B1 (Akt1), mitogen-activated protein kinase 3 (MAPK3), and Wnt/β-catenin (CTNNB1) signaling pathways. Methods Thirty male Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into three groups: a normoxic control group, a model group, and a traditional Chinese medicine (TCM) group, with 10 rats in each group. The normoxic control group received no intervention. The model group and TCM group were exposed to chronic intermittent hypoxia for 8 hours daily. The TCM group was administered Modified Buyang Huanwu Decoction (13.86 g/kg) by gavage twice daily, 30 minutes before and after daily hypoxia exposure, for 18 consecutive weeks.The total number of arm entries and spontaneous alternation rate were evaluated using the Y-maze test. Brain tissue morphology was observed by hematoxylin-eosin (HE) staining. The ultrastructure of mitochondria in brain cells was examined by transmission electron microscopy (TEM). Hippocampal cell apoptosis was detected by TUNEL staining. Serum levels of malondialdehyde (MDA), tumor necrosis factor-α (TNF-α), superoxide dismutase (SOD), and interleukin-6 (IL-6) were determined using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Protein expression levels of Akt1, MAPK3, CTNNB1, and caspase-3 were detected by Western blot analysis. Results Compared with the normoxic control group, rats in the model group exhibited a decreased spontaneous alternation rate (P0.05). Histologically, these rats had disordered cellular arrangement in brain tissue, accompanied by obvious inflammatory cell infiltration and nuclear pyknosis. Ultrastructurally, the brain mitochondria of these rats exhibited swelling, disrupted cristae, and vacuolar degeneration. Additionally, the number of TUNEL-positive cells in the brain tissue of these rats increased significantly, and the serum levels of TNF-α, MDA, and IL-6 were significantly elevated (P0.05), while the SOD activity significantly reduced (P0.05). In addition, the protein expression levels of Akt1 and CTNNB1 were significantly downregulated (P0.05), and the caspase-3 protein expression was significantly upregulated (P0.05). Compared with the model group, rats in the TCM intervention group showed a significant increase in the spontaneous alternation rate (P0.05). Their brain tissue had significantly improved cellular arrangement, with no obvious inflammatory cell infiltration. The brain mitochondria of these rats presented normal morphology, with clear and intact cristae and no obvious vacuolar degeneration. Meanwhile, the number of TUNEL-positive cells in the brain tissue was significantly reduced, the serum levels of TNF-α, MDA, and IL-6 were significantly decreased (P0.05), and the SOD activity significantly increased (P0.05).The protein expression of caspase-3 was significantly downregulated (P0.05), whereas the expression of Akt1, MAPK3, and CTNNB1 was significantly upregulated (P0.05). Conclusion Modified Buyang Huanwu Decoction can inhibit oxidative stress and inflammatory responses, thereby ameliorating CIH-induced brain injury in rats. The underlying mechanism may be associated with increased protein expression of Akt1, MAPK3, and CTNNB1, along with decreased protein expression of caspase-3, in the hippocampal tissue.

Graphical abstract

关键词

慢性间歇性低氧 / 脑损伤 / 补阳还五汤 / Akt1/MAPK3/Wnt/CTNNB1信号通路

Key words

Chronic intermittent hypoxia / Brain injury / Buyang Huanwu Decoction / Akt1/MAPK3/Wnt signaling pathway

阻塞型睡眠呼吸暂停低通气综合征（obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS）是一种常见的睡眠呼吸障碍性疾病，其发病率在我国成年人中高达3%~7%^［1］。该病特征性的病理生理过程包括上气道反复塌陷、睡眠片段化以及由此引发的慢性间歇性低氧（chronic intermittent hypoxi，CIH）等多种变化，其中CIH被认为是导致多系统损害的关键因素之一。中枢神经系统对缺氧极为敏感，CIH可引起海马等脑区损伤，临床表现为认知功能障碍、情绪障碍等症状^［2］。现代研究表明，OSAHS相关脑损伤的病理机制复杂，涉及由CIH诱导的氧化应激、神经炎症、线粒体功能障碍及细胞凋亡等多个环节的相互作用^［3］。

补阳还五汤出自《医林改错》，具有益气活血、化瘀通络之功效^［4］。临床研究发现，该方加减治疗认知障碍具有确定疗效^［5］。本课题组前期网络药理学分析提示，加减补阳还五汤可能通过调控Akt1、MAPK3等靶点发挥神经保护作用^［6］。然而，目前尚缺乏系统的实验研究验证其作用机制。故本研究采用慢性间歇低氧大鼠模型，模拟OSAHS中的核心缺氧损伤环节，从行为学、病理学及分子生物学等多角度，探讨加减补阳还五汤对CIH所致脑损伤的保护作用及其潜在机制。

1 实验材料

1.1 实验动物

30只SPF级雄性SD大鼠，2月龄，体质量（210±10）g，由杭州医学院提供，实验动物生产许可证号：SCXK（浙）2019-0002。实验动物饲养于福建中医药大学SPF级实验动物中心，实验动物使用许可证号：SYXK（闽）2019-0007，环境条件控制为：温度（20±2）℃、恒定湿度、12 h/12 h明暗循环，并保证通风良好，所有大鼠均自由摄食及饮水。本研究方案经福建中医药大学实验动物伦理委员会审查批准（审批号：FJTCMIACUC-2021162），所有实验操作均严格遵守动物福利伦理准则。

1.2 实验药物

加减补阳还五汤组成：黄芪30 g，党参30 g，当归9 g，川芎12 g，法半夏12 g，茯苓12 g，桃仁6 g，红花6 g，石菖蒲15 g，胆南星6 g，地龙6 g，药材均购自福建中医药大学附属第三人民医院。将药材置于容器中，首次加入药材重量10倍量的水浸泡1 h；水沸后文火煎煮30 min，过滤取初煎液；药渣加8倍量水复煎30 min，合并2次滤液。将合并后的药液经旋转蒸发仪减压浓缩，定容至生药浓度为 3.22 g/mL，4 ℃冷藏备用。

1.3 主要试剂

4%多聚甲醛（批号：G1101-500ML）、电镜专用固定液（批号：R20510）、丙二醛（MDA，批号：MPC2504020）、超氧化物歧化酶（SOD，批号：MPC2503069）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α，批号：RRDC2504012）、白细胞介素-6（IL-6，批号：RRDC 2501010）、TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（批号：MPC2503025）、蛋白激酶B（Akt1，批号：GB111114）、β-连环蛋白（CTNNB1，批号：GB112238）、丝裂原活化蛋白激酶3（MAPK3，批号：GB12105）、半胱天冬酶-3（Caspase-3，批号：GB11767C）以及Western blot试剂盒试剂均购自武汉赛维尔生物科技有限公司。磷酸化蛋白提取试剂盒（批号：PK10023）、山羊抗兔HRP标记二抗（批号：SA00001-2）均购自武汉三鹰生物技术有限公司。

1.4 主要仪器

移动式三气培养箱（华仪宁创智能科技有限公司，型号：Smartor 118 Pro）；间歇低氧舱（上海塔望智能科技有限公司，型号：ProOx-100）；尼康倒置显微镜（日本Nikon公司，型号：TS-100F）；包埋机（武汉俊杰电子有限公司，型号：JB-P5）；病理切片机（上海徕卡仪器有限公司，型号：RM2235）；酶标仪（美国BioTek公司，型号：BioTek EL×800）；透射电镜（日本Hitachi公司，型号：HT7700）；电泳仪（型号：Power Pac Basic）与化学发光成像系统（型号：ChemiDoc XPS）均购自美国Bio-Rad公司。

2 实验方法

2.1 给药浓度筛选

根据成人临床剂量参照《药理实验方法学》^［7］等效剂量换算方法确定低、中、高3种剂量，分别为6.3、13.86、20.8 g/（kg·d），进行Y迷宫实验，结果自发交替反应率在13.86 g/（kg·d）时最高，见图1。故选用该剂量进行后续实验。

2.2 动物造模分组及干预

将30只SD大鼠于标准环境下适应性喂养7 d后，采用随机数字表法分为常氧组、模型组和中药组，每组10只。模型组和中药组大鼠置于低氧舱（总容积100 L）内接受慢性间歇低氧（CIH）暴露：舱温（20±2） ℃、相对湿度40%～60%；在气体流速恒定为5 L/min的条件下，实施周期性间歇低氧方案。每个循环包括20 s的低氧期（氧气浓度为5%）和50 s的常氧期（氧气浓度恢复至21%）。选取08：00—16：00的固定时段进行干预，可避免夜间昼夜节律对大鼠生理状态的干扰，并便于实验室统一操作与监测。中药组于每日低氧暴露前、后30 min灌胃加减补阳还五汤，每日2次，每日总剂量13.86 g/kg。模型组予等体积生理盐水灌胃（时间点同中药组）；常氧组不予任何干预。3组在同样温度及饲养条件下喂养18周。

2.3 总进臂次数和自发交替反应率检测

干预18周后，对常氧组、模型组和中药组大鼠进行Y迷宫实验，评估其工作记忆能力。实验在安静、低光环境下，于上午9：00-12：00进行，以减少昼夜节律和环境干扰。Y迷宫由3个相同臂（长50 cm，宽10 cm，高40 cm）呈120°夹角组成。将大鼠背向任一臂从中央区放入，允许自由探索3 min，记录进臂顺序和总次数（四爪全入视为有效）。按照下列公式计算自发交替率计算公式。每只大鼠测试一次，结束后立即清除排泄物，并用75%乙醇擦拭迷宫内壁后擦干，消除气味残留。每组间隔30 min，测试在3 d内完成。操作者对分组信息设盲，确保结果客观。

自发交替反应率＝［连续进入3个不同臂的次数/（总进臂次数－2）］×100%

2.4 取材

干预18周后，对常氧组、模型组和中药组大鼠分别进行取材。所有大鼠禁食不禁水12 h后，按照50 mg/kg剂量腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉，经腹主动脉采集全血约10 mL，3 000 r/min离心15 min，取上清分装，于-80 ℃保存用于ELISA检测。每组随机选取3只大鼠，经左心室灌注预冷PBS冲洗后，再灌注4%多聚甲醛进行体内固定，取脑组织并置于4%多聚甲醛中4 ℃继续固定24 h，用于苏木精-伊红（HE）和TUNEL染色；每组另取3只大鼠，快速开颅分离海马组织，切成约1 mm×1 mm×1 mm组织块，5%戊二醛固定后4 ℃保存，用于透射电镜观察；再每组取4只大鼠，迅速分离海马组织，液氮速冻后转入-80 ℃保存，用于Western blot检测。所有操作均快速完成，避免组织降解。

2.5 HE染色观察海马组织形态

取“2.4”项下经4%多聚甲醛固定的脑组织，常规脱水、透明后，进行石蜡包埋，冠状切片厚度为5 μm。切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，HE染色，脱水透明后采用中性树胶封片。在光学显微镜下（×100）观察各组大鼠海马CA1区组织形态学改变，采集图像并进行分析。

2.6 透射电子显微镜观察海马组织超微结构

取“2.4”项下经5%戊二醛固定的海马组织，经1%锇酸后固定、梯度丙酮脱水，环氧树脂包埋，超薄切片机切片（厚度50 nm），醋酸铀和柠檬酸铅重金属染色后，在透射电子显微镜下观察海马神经元线粒体、核膜及突触等超微结构的改变。

2.7 TUNEL染色法检测海马组织细胞凋亡情况

取3组海马组织石蜡块进行切片，经脱蜡、水化后，使用蛋白酶K于37 ℃条件下处理30 min，PBS清洗后，参照试剂盒说明书进行TUNEL染色。DAB显色，苏木精复染，封片后在光学显微镜下观察海马CA1区，每张切片随机选取5个视野，使用ImageJ软件计算TUNEL阳性细胞率，计算公式如下：

阳性细胞率＝阳性细胞数/总细胞数×100%

2.8 ELISA法检测大鼠血清MDA、SOD、TNF-α和IL-6水平

取“2.4”项下-80 ℃保存的血清样本，按照ELISA试剂盒说明书操作，将解离后的标准品、样本及空白对照加入预包被板中，每个样本/标准品设双复孔，室温孵育2 h。洗涤后，加入HRP标记的检测抗体，室温孵育1 h，再次洗涤。加入TMB底物液避光显色20 min，随后加入终止液。用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度值，根据标准曲线计算血清中MDA、SOD、TNF-α和IL-6水平。

2.9 Western blot检测海马组织中Akt1、MAPK3、CTNNB1和Caspase-3蛋白表达量

取“2.4”项下-80 ℃保存的海马组织，按1∶9（m/v）加入RIPA裂解液，冰上匀浆裂解30 min，置于冷冻高心机中以4 ℃、12 000 r/min离心15 min，取上清，并采用BCA法测定蛋白浓度。3组分别取30 μg蛋白进行上样，随后进行SDS-PAGE电泳，并以400 mA的恒流模式于4 ℃中进行转膜，再用5%脱脂奶粉室温封闭2 h。TBST洗膜后分别加入一抗Akt1、MAPK3、CTNNB1、Caspase-3及内参β-actin，4 ℃缓慢摇动孵育过夜。洗膜后，加HRP标记山羊抗兔二抗（1∶5 000），室温缓慢摇动孵育1 h。TBST洗膜3次，每次10 min。ECL显影液进行显影，Image Lab成像系统采集图像，ImageJ软件分析条带灰度值，以目标蛋白/β-actin比值进行半定量计算目标蛋白表达量。

3 统计学方法

采用SPSS 22.0和GraphPad 9.0软件进行数据统计分析。计量数据符合正态分布以（\overline{x}±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD-t法或Tamhane's T₂法；不符合正态分布的数据以M（P₂₅，P₇₅）表示，采用Kruskal-Wallis H秩和检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

4 结　果

4.1 3组总进臂次数及自反应交替率比较

见图2。

4.2 3组海马组织形态比较

常氧组神经元排列整齐，胞质染色均匀；模型组可见神经元数量减少、排列紊乱、细胞间隙增大及少量炎症细胞浸润；中药组神经元排列稍紊乱但层次增多，未见明显水肿或炎症。见图3。

4.3 3组脑组织超微结构比较

常氧组海马神经元结构完整，细胞核圆形，核膜完整清晰，染色质分布均匀；线粒体形态规则，嵴完整，无水肿或空泡化表现。模型组海马神经元出现明显病理改变，细胞核呈“核固缩”形态，核膜出现皱缩或破裂，染色质边缘化；线粒体肿胀（呈气球样），内膜嵴大量断裂或消失，伴有明显的基质空泡化。中药组海马神经元结构相对完整，核膜破坏程度明显减轻，核固缩现象减少；线粒体虽仍有轻度肿胀，但嵴断裂和空泡化程度较模型组显著降低，整体形态较为规则。见图4。

4.4 3组海马组织细胞凋亡情况比较

模型组大鼠脑组织中TUNEL阳性细胞数量较常氧组显著增加（P＜0.05）；而中药组TUNEL阳性细胞数量较模型组显著减少（P＜0.05）。见图5。

4.5 3组血清MDA、SOD、TNF-α、IL-6水平比较

见表1。

4.6 3组海马组织中CTNNB1、Akt1、MAPK3及Caspase-3蛋白表达量比较

与常氧组比较，模型组Akt1、CTNNB1蛋白表达量均降低（P＜0.05），Caspase-3蛋白表达量均升高（P＜0.05），MAPK3蛋白表达量无显著变化；与模型组比较，中药组Akt1、CTNNB1、MAPK3蛋白表达量升高（P＜0.05），Caspase-3蛋白表达量降低（P＜0.05）。见图6。

5 讨　论

中医理论认为OSAHS脑损伤属“气虚血瘀、脾虚生痰”之证，治宜益气活血治本、化痰通络治标。加减补阳还五汤以黄芪、党参为君补益宗气，当归、川芎为臣活血通络，桃仁、红花为佐助臣药增强祛瘀之力，法半夏、石菖蒲、胆南星化痰开窍，茯苓健脾渗湿，地龙通络醒神，共奏涤痰化湿、活血祛瘀、开窍醒神之效，构建“益气活血治本，化痰通络治标”的干预策略^［8］。

CIH作为OSAHS的核心病理特征之一，可诱导ROS过量生成、神经炎症激活，进而导致脑损伤及认知功能障碍^［9］。本研究结果表明，CIH可显著诱发大鼠认知功能障碍及海马区神经元损伤^［10］。在行为学检测中，与常氧组比较，模型组大鼠自发交替反应率显著降低，提示其空间学习记忆能力受到明显抑制。病理形态学观察进一步证实了这一损伤：HE染色结果显示，模型组海马CA1区神经元排列紊乱、数量减少，伴有炎症细胞浸润及间质水肿；透射电镜下可见神经元核固缩，线粒体肿胀、嵴断裂及明显的空泡化现象，提示线粒体能量代谢功能严重受损；TUNEL染色结果显示，模型组海马组织中TUNEL阳性细胞数量显著增加，且呈现典型的核固缩、染色质凝聚特征，证实了CIH诱导了显著的神经元凋亡过程。这与他人研究结果一致^［11］。上述表型变化为探讨加减补阳还五汤的神经保护机制提供了明确的病理基础。经加减补阳还五汤干预后，CIH引起的上述病理改变显著逆转，大鼠认知功能恢复，氧化应激标志物MDA及炎症因子TNF-α、IL-6水平显著降低，印证其抗损伤效应^［12］。

本研究进一步证实了加减补阳还五汤对CIH诱导的脑损伤具有显著的神经保护作用。Western blot分析显示，干预后大鼠海马组织中Akt1、MAPK3、CTNNB1蛋白表达水平显著升高，而促凋亡执行酶Caspase-3表达明显下降。Caspase-3是凋亡执行分子的关键酶，其下调是抑制细胞死亡、保护神经元存活的核心机制^［13］。本实验中补阳还五汤显著抑制了Caspase-3的表达，直接证实了该方剂对CIH诱导的海马神经元凋亡过程具有显著抑制作用。Akt1是PI3K/Akt信号通路的核心成分之一，广泛参与细胞存活及抗凋亡过程。Akt1的上调通常伴随着细胞抗凋亡能力的增强及神经保护作用^［14］。MAPK3是MAPK信号通路的重要成员，主要参与细胞增殖、分化及炎症反应的调控。其表达水平的上调通常预示着抗炎反应的增强^［15］。CTNNB1是Wnt/β-catenin信号通路的关键分子，主要通过调节基因转录促进细胞增殖与分化。其蛋白水平的升高通常提示该信号通路的激活，进而促进海马神经元的存活与突触可塑性^［16］。本研究实验结果显示，补阳还五汤显著上调Akt1、MAPK3及CTNNB1水平，提示其可能通过协同激活PI3K/Akt、MAPK及Wnt信号通路，抑制CIH诱导的炎症与凋亡，发挥神经保护作用。然而，需要指出的是，PI3K/Akt与Wnt/β-Catenin通路之间可能存在一定程度的串扰^［17］，这意味着它们的调控可能不是完全独立的。因此，补阳还五汤对Akt1和CTNNB1的上调可能涉及到这2条通路之间的相互作用，而非单一通路的独立调节。

综上所述，加减补阳还五汤通过上调Akt1、MAPK3、CTNNB1等关键蛋白的表达，并显著下调Caspase-3，发挥协同的抗凋亡及神经保护作用。然而，本研究目前仅限于总蛋白水平的检测，尚未验证PI3K/Akt通路的关键活化事件（如p-Akt1）及Wnt通路的关键靶标（如β-catenin的核转位）。因此，Akt1与CTNNB1的上调仅提示相关通路可能受影响；Caspase-3与MAPK3的变化也仅能间接反映凋亡与炎症进程的缓解，其上游具体的协同调控机制仍需通过功能实验与通路活性检测进一步阐明。

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基金资助

福建省自然科学基金项目(2020J07164)