壮骨健膝方调控SLC7A11/GPX4通路改善膝骨关节炎大鼠滑膜炎症和软骨退变

摘要

目的 探究壮骨健膝方调控SLC7A11/GPX4通路改善膝骨关节炎（KOA）大鼠滑膜炎症和软骨退变的机制。 方法 60只SPF级雄性SD大鼠采用随机数字表法分为空白组10只和造模组50只，造模组采用前交叉韧带横断术（ACLT）联合强迫运动4周建立KOA大鼠模型，MRI进行模型鉴定。将造模成功的大鼠随机分为模型组、美洛昔康组、壮骨健膝方组、Erastin组和Erastin＋壮骨健膝方组，每组10只。空白组和模型组按8.82 mL/（kg·d）给予生理盐水灌胃；美洛昔康组按0.781 mg/（kg·d）给予美洛昔康药液灌胃；壮骨健膝方组按8.82 g/（kg·d）给予壮骨健膝方药液灌胃；Erastin组按1 mg/kg于大鼠右膝关节注射Erastin混悬液，每周注射2次，并按8.82 mL/（kg·d）给予生理盐水灌胃；Erastin＋壮骨健膝方组同时给予Erastin右膝关节注射和壮骨健膝方药液灌胃，关节注射和灌胃的剂量、频次同Erastin组和壮骨健膝方组，均连续干预4周。测量干预前和干预2、4周大鼠右膝关节直径；ELISA检测血清大鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β、IL-6含量；HE染色和番红O-固绿染色分别观察滑膜组织和软骨组织病理变化；Western blot检测滑膜组织和软骨组织溶质载体家族7成员11（SLC7A11）、谷胱甘肽合成酶（GSS）、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）以及软骨组织Ⅱ型胶原α1链（COL2A1）、基质金属蛋白酶-13（MMP-13）蛋白表达量。 结果 ① 病理形态学结果显示：模型组滑膜纤维增生明显，伴中度炎症，同时软骨表面出现着色消失、软骨层不连续、表面不平整及细胞排列不规则等缺损；美洛昔康组和壮骨健膝方组滑膜及软骨病变均较模型组减轻；Erastin组滑膜呈现大量纤维增生和密集的炎性细胞浸润，软骨着色广泛消失、软骨面大面积缺失、表面不平整、各层结构模糊难辨，并有结缔组织增生侵蚀；Erastin＋壮骨健膝方组上述病理改变均显著减轻，关节软骨损伤较Erastin组明显改善。② 与空白组比较，模型组干预前和干预2、4周膝关节直径明显增大（P＜0.05）；与模型组比较，美洛昔康和壮骨健膝方组干预4周膝关节直径明显缩小（P＜0.05），Erastin组明显增大（P＜0.05）；与Erastin组比较，Erastin＋壮骨健膝方组干预4周膝关节直径明显缩小（P＜0.05）。③ 与空白组比较，模型组血清TNF-α、IL-1β和IL-6含量明显升高（P＜0.05）；滑膜组织SLC7A11、GSS和GPX4蛋白表达量均明显降低（P＜0.05）；软骨组织COL2A1、SLC7A11、GSS和GPX4蛋白表达量均明显降低（P＜0.05），MMP-13蛋白表达量明显升高（P＜0.05）。与模型组比较，美洛昔康组血清IL-1β含量明显降低（P＜0.05）；壮骨健膝方组血清TNF-α、IL-1β和IL-6含量均明显降低（P＜0.05）；美洛昔康组和壮骨健膝方组滑膜组织SLC7A11、GSS和GPX4蛋白表达量均明显升高（P＜0.05），软骨组织COL2A1、SLC7A11、GSS和GPX4蛋白表达量均明显升高（P＜0.05），MMP-13蛋白表达量明显降低（P＜0.05）；Erastin组血清IL-1β和IL-6含量均明显升高（P＜0.05），滑膜组织SLC7A11蛋白表达量明显降低（P＜0.05），软骨组织COL2A1、SLC7A11和GSS蛋白表达量均明显降低（P＜0.05）。与Erastin组比较，Erastin＋壮骨健膝方组血清TNF-α、IL-1β和IL-6含量均明显降低（P＜0.05）；滑膜组织SLC7A11、GSS和GPX4蛋白表达量均明显升高（P＜0.05）；软骨组织COL2A1、SLC7A11、GSS和GPX4蛋白表达量均明显升高（P＜0.05），MMP-13蛋白表达量明显降低（P＜0.05）。 结论 壮骨健膝方可减轻KOA大鼠滑膜炎症及软骨退变，其机制可能与激活SLC7A11/GPX4信号通路、抑制铁死亡密切相关。

Graphical abstract

关键词

膝骨关节炎 / 壮骨健膝方 / 滑膜炎症 / 软骨退变 / 铁死亡 / SLC7A11/GPX4信号通路

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是一种慢性、进展性关节疾病，滑膜炎症与软骨退变是其进展的核心病理^［1］。现代医学治疗KOA多采用非甾体抗炎药、关节腔注射及手术等方法，但长期用药存在胃肠道损伤、心血管风险等不良反应，手术治疗存在一定风险，故KOA的治疗仍是亟待突破的临床难题^［2］。KOA虽然属于中医“膝痹”范畴，但兼具“痹”与“痿”的临床表现。细言之滑膜炎症引起的关节肿胀、疼痛、关节腔积液及明显的关节屈伸障碍，与“痹”的特征相吻合；而软骨退变引发的废用性肌萎缩，表现为膝关节屈伸无力、打软腿，则与“痿”的特征符合^［3］。由此可见，滑膜炎症与软骨退变共同体现了KOA“痹痿同病”的特点。本课题组针对这一特征拟定的壮骨健膝方，具有“痹痿同治”的作用，可有效改善KOA患者临床症状^［4］。铁死亡已被证实在KOA滑膜炎症与软骨退化过程中扮演重要角色^［5］。该细胞死亡方式以脂质过氧化物异常累积为核心特征，由铁代谢紊乱、活性氧生成及脂质过氧化反应共同驱动^［6］。在KOA病理状态下，软骨细胞代谢异常可导致铁离子与活性氧蓄积，加剧软骨细胞损伤与死亡，成为软骨退变的关键机制之一^［7］。此外，铁死亡还可激活滑膜成纤维细胞与巨噬细胞，促进炎症因子的分泌，形成正反馈环路，进一步加重滑膜炎症；同时，其可诱导内质网应激及线粒体功能障碍，加剧滑膜细胞的氧化应激状态^［8］。SLC7A11/GPX4信号通路是调控铁死亡的经典信号通路^［9］，因此本研究旨在探讨壮骨健膝方对SLC7A11/GPX4信号通路的调控作用，从而进一步明确其防治KOA的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠60只，体质量（200±20）g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2024-0003。饲养于福建中医药大学实验动物中心，实验动物使用许可证号：SYXK（闽）2023-0004，以超纯水和标准饲料喂养，室温（25±2）℃，相对湿度40%～70%，明暗周期12 h/12 h。本实验方案经福建中医药大学实验动物福利伦理委员会审批通过（审批号：FJTCM-IACUC-2025071）。

1.2 实验药物

壮骨健膝方中骨碎补、杜仲、川牛膝、生地黄、独活、鸡血藤、秦艽、徐长卿、䗪虫的组成比例为5∶3∶4∶5∶2∶5∶3.3∶3.3∶2，均购于闽侯县上街致诚医药商店。壮骨健膝方饮片采用二次煎煮法提取：首煎加600 mL蒸馏水浸泡30 min，煮沸后煎15 min；加400 mL水二煎30 min。合并2次煎液浓缩至生药当量1 g/mL。分装、封口并标记，4 ℃冷藏保存，临用前恢复室温并混匀。美洛昔康药液制备：使用精密电子天平称取10 mg美洛昔康粉末（上海源叶生物科技有限公司），使用生理盐水定容至100 mL，配置为0.1 mg/mL美洛昔康药液，放置于无菌50 mL离心管内，封口、标记，冷藏备用，使用前恢复至室温并充分摇匀。

1.3 实验试剂

铁死亡诱导剂Erastin（美国Selleck公司，货号：S7242）；基质金属蛋白酶-13（MMP-13）抗体（货号：18165-1-AP）、Ⅱ型胶原α1链（COL2A1）抗体（货号：28459-1-AP）、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）抗体（货号：30388-1-AP）、GAPDH抗体（货号：60004-1-Ig）、谷胱甘肽合成酶（GSS）抗体（货号：15712-1-AP）均购自武汉三鹰生物技术有限公司；溶质载体家族7成员11（SLC7A11）抗体（上海碧云天生物技术股份有限公司，货号：AF7992）；大鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α，货号：JL13202）、白细胞介素（IL）-1β（货号：JL20884）、IL-6（货号：JL20896）ELISA试剂盒均购自上海将来实业股份有限公司。

1.4 实验仪器

全能型成像系统（美国Bio-Rad公司，型号：ChemiDoc MP）；酶标仪［帝肯（上海）贸易有限公司，型号：TECAN SPARK］；石蜡包埋机（孝感市亚光医用电子技术有限公司，型号：YB-7LF）；迷你涡旋混匀仪（北京兰杰柯科技有限公司，型号：L-VM-MINI）；高速冷冻离心机（上海力申科学仪器有限公司，型号：Neo15R）。

2 实验方法

2.1 分组与造模

适应性喂养1周后，采用随机数字表法将60只SD大鼠分为空白组10只和造模组50只。造模组采用前交叉韧带横断术（ACLT）联合强迫运动4周建立KOA大鼠模型，按30 mg/kg腹腔注射2%戊巴比妥钠进行麻醉，右膝备皮消毒后切开皮肤，经髌腱内侧打开关节腔，显露并切断前交叉韧带，行抽屉试验确认阳性后缝合；空白组仅暴露右膝关节关节束，不进行前交叉韧带横断，不进行强迫活动。手术伤口愈合后，连续4周每日强迫造模组大鼠活动30 min。造模结束后分别从造模组和空白组随机选取3只大鼠进行MRI检查，若显示软骨局灶性缺损、关节腔积液、滑膜增生则表明KOA造模成功。将造模成功的大鼠随机均分为模型组、美洛昔康组、壮骨健膝方组、Erastin组和Erastin+壮骨健膝方组，每组10只。

2.2 药物干预

根据人体与动物药物等效剂量换算方法^［10］，空白组和模型组按8.82 mL/（kg·d）给予生理盐水灌胃；美洛昔康组按0.781 mg/（kg·d）给予美洛昔康药液灌胃；壮骨健膝方组按8.82 g/（kg·d）给予壮骨健膝方药液灌胃；Erastin组按1 mg/kg于大鼠右膝关节注射Erastin混悬液^［11］，每周注射2次，并按8.82 mL/（kg·d）给予生理盐水灌胃；Erastin＋壮骨健膝方组同时给予Erastin右膝关节注射和壮骨健膝方药液灌胃，关节注射和灌胃的剂量、频次同Erastin组和壮骨健膝方组，均连续干预4周。

2.3 取材

末次干预结束后禁食不禁水12 h，以30 mg/kg腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉后腹主动脉取血，离心后分装血清；每组取3只右膝关节滑膜组织和3只右膝关节整膝，均放入4％多聚甲醛中固定；其余右膝关节放入-80 ℃冰箱储存。

2.4 观察指标

2.4.1 大鼠右膝关节直径检测

分别于干预前和干预2、4周使用游标卡尺测量大鼠右膝关节直径。

2.4.2 血清TNF-α、IL-1β和IL-6含量检测

按照试剂盒说明书，采用ELISA法检测大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6含量。

2.4.3 HE染色法观察滑膜组织形态

滑膜组织固定48 h后，经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，再以4 μm厚度连续切片，常规脱蜡。应用苏木素染液浸染3～5 min，经分化液处理实现分化，待切片返蓝后以流动清水冲洗10 min，再用95%乙醇脱水1 min，随后放入伊红染液中染色15 s，接着进行二甲苯透明操作，最后中性树胶封片，在光学显微镜下开展观察。

2.4.4 番红O-固绿染色观察软骨组织形态

膝关节固定48 h后，进行脱钙液脱钙、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，再以4 μm厚度连续切片，常规脱蜡。脱蜡操作完成后，取固绿染色液对切片开展染色1～5 min，冲洗切片，直至软骨区域呈现透明状，随即采用1%盐酸溶液进行10～15 s的快速处理，再以蒸馏水清洗。切片以番红染液染色1～5 s。再依次将切片浸入无水乙醇进行快速脱水4次，持续时间依次为5、2、10、5 s，二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜观察。

2.4.5 Western blot检测滑膜和软骨组织SLC7A11、GSS、GPX4以及软骨组织COL2A1、MMP-13蛋白表达量

提取滑膜及软骨组织总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，经蛋白变性、电泳和转膜后，快速封闭液封闭10 min，置于SLC7A11（1∶1 000）、GSS（1∶1 000）、GPX4（1∶500）、MMP-13（1∶1 000）、COL2A1（1∶500）和GAPDH（1∶50 000）一抗中4 ℃摇床孵育16 h，TBST洗涤后置于二抗（1∶10 000）中室温孵育10 min，TBST洗涤，加入ECL发光液显影，ImageJ分析条带灰度值。

2.5 统计学方法

采用SPSS 27.0软件进行数据分析。计量资料符合正态分布以（\overline{x}±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，若方差齐，两两比较采用LSD-t检验；若方差不齐则采用Games-Howell检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结　果

3.1 6组右膝关节直径比较

与空白组比较，模型组干预前和干预2、4周膝关节直径明显增大（P＜0.05）；与模型组比较，美洛昔康和壮骨健膝方组干预4周膝关节直径明显缩小（P＜0.05），Erastin组明显增大（P＜0.05）；与Erastin组比较，Erastin＋壮骨健膝方组干预4周膝关节直径明显缩小（P＜0.05）。见表1。

3.2 6组血清TNF-α、IL-1β和IL-6含量比较

与空白组比较，模型组血清TNF-α、IL-1β和IL-6含量明显升高（P＜0.05）。与模型组比较，美洛昔康组血清IL-1β含量明显降低（P＜0.05）；壮骨健膝方组血清TNF-α、IL-1β和IL-6含量均明显降低（P＜0.05）；Erastin组血清IL-1β和IL-6含量均明显升高（P＜0.05）。与Erastin组比较，Erastin＋壮骨健膝方组血清TNF-α、IL-1β和IL-6含量均明显降低（P＜0.05）。见表2。

3.3 6组滑膜组织形态学比较

空白组滑膜细胞在表面无明显分布，深层为疏松结缔组织，血管及纤维组织增生不显著，且未见明显炎性细胞浸润。模型组纤维组织明显增生，伴中量炎细胞浸润及少量新生血管。美洛昔康组和壮骨健膝方组病理改变较模型组减轻，纤维结缔组织增生、淋巴细胞浸润、新生血管均减少。Erastin组滑膜组织表面可见滑膜细胞增生，大量纤维结缔组织增生，大量淋巴细胞和粒细胞浸润，中量新生血管。Erastin＋壮骨健膝方组病理改变较Erastin组减轻，纤维结缔组织增生、淋巴细胞和粒细胞浸润及新生血管情况均改善。见图1。

3.4 6组软骨组织形态学比较

空白组软骨组织染色呈鲜红色，视野内关节软骨着色均匀，软骨表面完整，光滑、平整，软骨细胞数量丰富，分布均匀，排列整齐；模型组可见小范围关节软骨着色消失，软骨层不连续，表面不平整，周围软骨细胞排列不规则；美洛昔康和壮骨健膝方组病理改变程度较模型组有所改善，关节软骨着色消失，表面不平整减少；Erastin组软骨组织染色呈鲜红色，关节软骨着色消失，软骨面广泛消失，表面不平整，结构不清晰，各层结构难以区分，可见结缔组织增生侵蚀；Erastin＋壮骨健膝方组关节软骨病理损伤较Erastin组减轻。见图2。

3.5 6组滑膜组织SLC7A11、GSS和GPX4蛋白表达量比较

与空白组比较，模型组滑膜组织SLC7A11、GSS和GPX4蛋白表达量均明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，美洛昔康组和壮骨健膝方组滑膜组织SLC7A11、GSS和GPX4蛋白表达量均明显升高（P＜0.05），Erastin组滑膜组织SLC7A11蛋白表达量明显降低（P＜0.05）；与Erastin组比较，Erastin＋壮骨健膝方组滑膜组织SLC7A11、GSS和GPX4蛋白表达量均明显升高（P＜0.05）。见图3和表3。

3.6 6组软骨组织COL2A1、MMP-13、SLC7A11、GSS和GPX4蛋白表达量比较

与空白组比较，模型组软骨组织COL2A1、SLC7A11、GSS和GPX4蛋白表达量均明显降低（P＜0.05），MMP-13蛋白表达量明显升高（P＜0.05）。与模型组比较，美洛昔康组和壮骨健膝方组软骨组织COL2A1、SLC7A11、GSS和GPX4蛋白表达量均明显升高（P＜0.05），MMP-13蛋白表达量明显降低（P＜0.05）；Erastin组软骨组织COL2A1、SLC7A11和GSS蛋白表达量均明显降低（P＜0.05）。与Erastin组比较，Erastin＋壮骨健膝方组软骨组织COL2A1、SLC7A11、GSS和GPX4蛋白表达量均明显升高（P＜0.05），MMP-13蛋白表达量明显降低（P＜0.05）。见图4和表4。

4 讨　论

壮骨健膝方由独活秦艽汤及壮筋续骨丹加减化裁而成，可祛风除湿、散寒止痛、补益肝肾、强筋壮骨，具有“痹痿同治”的功效特点^［12］。前期实验表明该方可有效改善滑膜炎症与软骨退变^［13-14］。软骨是一种无血管、无淋巴和无神经的组织，由细胞外物质（ECM）和软骨细胞组成，其中Ⅱ型胶原是其主要胶原成分，由COL2A1基因编码。研究证实COL2A1软骨钙蛋白编码结构域的突变会影响临床条件下的软骨发育^［15］。而MMP-13作为分解ECM的关键酶，在正常关节中呈低表达，异常条件下表达增加^［16］。本研究结果显示，模型组大鼠膝关节软骨组织COL2A1蛋白表达下降，MMP-13蛋白表达增加；经壮骨健膝方治疗后COL2A1蛋白表达上调，MMP-13蛋白表达下调，提示壮骨健膝方可能通过下调MMP-13的表达来抑制软骨基质的过度降解，从而减轻关节软骨损伤。

滑膜组织在病理状态下可分泌大量促炎性细胞因子，其中IL-1β不仅可以诱导产生导致炎症状态的细胞因子和趋化因子，还可以诱导软骨细胞产生MMPs，并抑制Ⅱ型胶原的合成^［17］。TNF-α可刺激滑膜组织中一氧化氮（NO）分泌增加，促进前列腺素E2（PGE2）合成与IL-1β分泌增加，加重滑膜炎症^［18］。IL-6在KOA的病理进展中起着促炎作用，还在调控蛋白水解酶合成方面发挥着关键作用。以上细胞因子通过复杂的信号通路，影响蛋白水解酶的表达与活性，进而加剧软骨基质的降解^［19］。最终，持续炎症因子增加，滑膜炎症加重，引起组织充血、水肿与增生，表现为膝关节肿胀。本研究结果表明，模型组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量及膝关节直径增加，经壮骨健膝方治疗后血清TNF-α、IL-1β和IL-6含量降低，膝关节直径减小，表明滑膜炎症的减轻。

SLC7A11/GPX4信号通路在KOA疾病进展中发挥重要作用，SLC7A11是system xc⁻的催化亚基，介导细胞外胱氨酸摄取与谷氨酸外排，进入细胞的胱氨酸会被还原为半胱氨酸，半胱氨酸进一步合成谷胱甘肽（GSH）^［20］。GSH是维持细胞内氧化还原平衡的关键抗氧化剂，其耗竭会降低细胞抗氧化能力，增加对铁死亡的敏感性^［21］。在GSH合成中，GSS催化γ-谷氨酰半胱氨酸与甘氨酸结合生成GSH^［22］。GPX4则利用GSH将脂质过氧化物还原为无害的脂醇，其活性下降将导致脂质过氧化物积累，最终诱发铁死亡^［23］。铁死亡发生后会释放大量炎症因子如IL-1β，进一步加重滑膜炎症，还会加速软骨细胞ECM的降解，削弱软骨组织的修复能力，推动软骨退变的不可逆进展^［24］。Erastin作为一种特异性铁死亡诱导剂，其作用机制主要在于直接抑制SLC7A11的转运功能，阻断胱氨酸摄取，导致GSH耗竭与GPX4失活，进而引发脂质过氧化物积聚及铁死亡^［25］。本研究结果显示，模型组大鼠滑膜及软骨组织SLC7A11、GSS、GPX4蛋白表达降低，提示铁死亡的发生，经壮骨健膝方治疗后SLC7A11、GSS、GPX4表达升高。Erastin诱导铁死亡发生后，Erastin组血清TNF-α、IL-1β含量及膝关节直径较模型组增加，滑膜及软骨组织病理改变加重，滑膜组织SLC7A11及软骨组织SLC7A11、GSS蛋白表达降低，表明铁死亡的发生会进一步加重KOA的病理进程，而经壮骨健膝方治疗后炎症水平、形态学改变及蛋白表达水平均有改善，提示壮骨健膝方可能通过上调SLC7A11表达，维持GSH合成，增强GPX4活性，从而抑制铁死亡，减轻滑膜炎症和软骨退变。

综上所述，壮骨健膝方可以调节KOA大鼠血清炎症水平，改善膝关节肿胀程度、滑膜炎症及软骨组织损伤，其作用机制可能与滑膜及软骨组织SLC7A11/GPX4信号通路的调控有关。

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基金资助

国家自然科学基金项目(82274349)

国家中医药管理局2021年岐黄学者支持项目(国中医药人教函〔2022〕6号)

福建中医药大学苏友新岐黄学者传承工作室建设项目(闽中医〔2023〕56号)