汉黄芩苷通过调控MAPK与PI3K/Akt信号通路抑制氧糖剥夺诱导的心肌细胞凋亡机制研究

摘要

目的 通过网络药理学及实验验证探索汉黄芩苷（WO）对氧糖剥夺诱导心肌细胞凋亡的影响以及相关信号通路的调控作用。 方法 CCK-8法筛选出25、50、100 μmol/L WO作为低、中、高剂量的最佳干预浓度。采用低氧细胞培养系统构建氧糖剥夺细胞模型，将H9c2细胞分为对照组、模型组和低、中、高剂量组，对照组给予常规常氧培养；模型组和低、中、高剂量组更换无血清培养基，分别加入DMSO溶液和25、50、100 μmol/L WO干预，并置于37 ℃、5%CO₂、1%O₂和94%N₂低氧环境中，均培养24 h。流式细胞术检测细胞凋亡率；JC-1染色法观察细胞线粒体膜电位变化；Western blot检测Bcl-2相关X蛋白（Bax）、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、半胱天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）和Cleaved Caspase-3蛋白表达量。运用网络药理学分析汉黄芩苷治疗AMI的潜在靶点，STRING数据库分析潜在靶点间的互作关系，David数据库进行基因本体论（GO）功能注释和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。采用Western blot验证5组蛋白激酶B（Akt）、磷酸化Akt（p-Akt）、丝裂原活化蛋白激酶p38、磷酸化p38（p-p38）、细胞外信号调节激酶（ERK）、磷酸化ERK（p-ERK）蛋白表达量变化。 结果 与对照组比较，模型组细胞凋亡率明显升高（P＜0.05），线粒体膜电位明显降低（P＜0.05），Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase-3/Caspase-3均明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，低、中、高剂量组细胞凋亡率均明显降低（P＜0.05），线粒体膜电位均明显升高（P＜0.05），Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase-3/Caspase-3均明显降低（P＜0.05）。网络药理学结果显示，共获得汉黄芩苷药物作用靶点418个、AMI疾病靶点5 398个，取交集后得到251个交集靶点。GO功能注释发现，凋亡过程的负调控、MAPK级联的正调控等过程被显著富集；KEGG通路富集分析发现，MAPK、PI3K/Akt等信号通路被显著富集。实验验证结果表明，与对照组比较，模型组p-Akt/Akt明显降低（P＜0.05），p-p38/p38、p-ERK/ERK均明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，低、中、高剂量组p-Akt/Akt明显升高（P＜0.05），p-p38/p38、p-ERK/ERK均明显降低（P＜0.05）。 结论 汉黄芩苷可抑制氧糖剥夺诱导的心肌细胞凋亡，下调促凋亡蛋白Bax、Cleaved Caspase-3的表达，上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，其机制可能与抑制MAPK信号通路中ERK、p38的异常磷酸化激活及恢复PI3K/Akt信号通路中Akt蛋白的磷酸化水平有关。

Graphical abstract

关键词

急性心肌梗死 / 汉黄芩苷 / 细胞凋亡 / 氧糖剥夺 / MAPK信号通路 / PI3K/Akt信号通路 / 网络药理学

心血管疾病已成为全球最常见的死因^［1］，其中急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是全球致死率最高的疾病之一，2023年我国AMI住院患者达122.2万人次，发病率和病死率仍持续上升^［2］。尽管临床上主要以血运重建、规范药物干预等策略治疗，然而这些措施远期预后效果不佳，患者仍面临疾病的高复发风险^［2］。心肌细胞凋亡是AMI发生、发展的重要病理基础，AMI发作时冠状动脉急性闭塞引起心肌缺血缺氧，导致细胞内活性氧（ROS）大量蓄积、线粒体功能障碍，激活Caspase级联反应，同时上调促凋亡蛋白和抑制抗凋亡蛋白的表达，加速心肌细胞凋亡，最终引发心室重构及心力衰竭^［3］。因此有效延缓AMI引发的心肌细胞凋亡以改善患者预后，仍为亟待解决的难题。

黄芩具有清热解毒、燥湿止血等功效，在心血管疾病中具有抗炎、抗氧化、调节免疫等作用^［4］。汉黄芩苷（wogonoside，WO）是黄酮类化合物，是黄芩中提取出的主要有效活性成分之一，具有抗炎、抗凋亡、抗肿瘤等作用^［5-7］，然而其对AMI作用及其药理机制尚未明确。因此，本研究采用氧糖剥夺（oxygen glucose deprivation，OGD）诱导构建AMI细胞模型，以此验证WO对心肌细胞的抗凋亡作用。基于此，借助网络药理学构建“WO-AMI-靶点”交互网络，筛选WO治疗AMI的潜在信号通路和核心靶点，进而通过OGD细胞模型对上述生物信息学分析进行验证，以深入阐明WO抗心肌细胞凋亡和治疗AMI的药效作用机制。

1 实验材料

1.1 实验细胞

大鼠心肌细胞（H9c2）购自中国武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.2 实验药物

汉黄芩苷，HPLC≥98%，购自中国上海源叶生物科技有限公司，溶解于DMSO溶液中，母液浓度200 mmol/L，分装储存于-20 ℃。

1.3 实验试剂

胎牛血清（货号：10091-148）、DMEM培养基（货号：C11995500BT）、0.25%胰蛋白酶（货号：25200-072）、BCA总蛋白浓度检测试剂盒（货号：23227）均购自美国Thermo Fisher Scientific公司；Annexin V-AbFluor^TM 647细胞凋亡检测试剂盒（货号：KTA0004）、CCK-8试剂（货号：KTA1020）均购自亚科因（武汉）生物技术有限公司；Bcl-2相关X蛋白（Bax）抗体（货号：34260）、半胱天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）抗体（货号：48562）、蛋白激酶B（Akt）抗体（货号：33748）、磷酸化Akt（p-Akt）抗体（货号：12126）、丝裂原活化蛋白激酶p38抗体（货号：35478）、磷酸化p38（p-p38）抗体（货号：11252）、细胞外信号调节激酶（ERK）抗体（货号：40901）、磷酸化ERK（p-ERK）抗体（货号：13887）均购自美国Cell Signaling Technology公司；β-actin抗体、羊抗兔二抗均购买于美国Signalway Antibody公司。

1.4 实验仪器

超净工作台（苏州净化设备有限公司，型号：SW-CJ-2F）；高速离心机（型号：75008592）、多功能酶标仪（型号：VLBLATGD2）均购自美国Thermo Fisher Scientific公司；流式细胞仪（美国BD公司，型号：BD FACSMelody^TM）；电泳仪（型号：1658005）、蛋白转印仪（型号：1703930）均购自美国Bio-Rad公司；倒置荧光显微镜（德国Leica公司，型号：DMi8）。

2 实验方法

2.1 H9c2细胞培养

H9c2细胞常规培养于含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 μg/mL链霉素的DMEM培养基中，培养条件为恒温37 ℃、5%CO₂的饱和湿度。

2.2 CCK-8法筛选WO干预浓度

按0.5×10⁵个/孔将H9c2细胞接种于96孔板中，贴壁经无血清培养基处理4～6 h，取0、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 μmol/L浓度WO干预24 h后，采用CCK-8法检测细胞活性，加入CCK-8试剂避光孵育2 h，在450 nm波长下测定吸光度值，并计算细胞活力。结果显示：与0 μmol/L比较，200 μmol/L组细胞活力明显降低（P＜0.05），见表1。提示3.125～100 μmol/L为WO安全浓度范围，综合团队前期研究结果，最终选取25、50、100 μmol/L作为WO后续实验低、中、高剂量所用浓度。

2.3 分组与干预

将H9c2细胞分为对照组、模型组和低、中、高剂量组，对照组用含10%胎牛血清的DMEM完全培养基常规培养，置于37 ℃、5%CO₂培养箱中；模型组和低、中、高剂量组更换无血清培养基，分别加入DMSO溶液和25、50、100 μmol/L WO干预，并置于37 ℃、5%CO₂、1%O₂和94%N₂低氧环境中，均培养24 h。

2.4 流式细胞术检测细胞凋亡情况

按1×10⁵个/mL密度将H9c2细胞接种于六孔板中，按“2.3”项下方法进行分组和干预，收集细胞后严格遵循Annexin V试剂盒说明书操作，应用流式细胞仪在647 nm和530 nm波长处检测Annexin V-Abflour^TM和PI荧光信号，并计算细胞凋亡率。

2.5 JC-1染色法检测细胞线粒体膜电位情况

将H9c2细胞以1×10⁵个/mL密度接种于共聚焦小皿中，按“2.3”项下方法进行分组和干预后，PBS溶液多次洗涤，加入2 μmol/L JC-1染色液，避光孵育30 min，孵育结束再次清洗，通过倒置荧光显微镜检测线粒体膜电位，放大倍数为200倍。

2.6 网络药理学与实验验证

2.6.1 汉黄芩苷-疾病交集靶点获取

在Pubchem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）搜索WO的3D结构，并上传至Pharm Mapper（https：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/submitfile.html）、Swiss Target Prediction数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch）进行分析，预测WO潜在作用靶点。数据录入Uniptot（http：//www.uniprot.org）剔除非人源的靶点合并剔除重复。通过GeneCards数据库（https：//www.genecards.org）以“Acute Myocardial Infarction”为关键词进行数据检索，同上述去重，靶点视为AMI高发病率候选靶点。将上述靶点输入至微生信网站获取交集靶点绘制韦恩图，交集靶点视为WO发挥药效功能干预AMI的潜在治疗靶点。

2.6.2 蛋白质-蛋白质相互作用网络的构建和核心靶点筛选

将交集靶点导入Gene MANIA（https：//genemania.org）和STRING数据库（https：//string-db.org/），构建WO-AMI蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络图。使用Cytoscape3.7.2软件以度值（Degree）、介数中心性（Betweenness）和接近中心性（Closeness）为参考项进行拓扑算法分析，筛选Degree排名前30位视为核心靶点。

2.6.3 生物信息学分析

将核心靶点导入David数据库分别开展基因本体论（GO）功能注释和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，以P＜0.05作为显著富集阈值，获得WO作用相关的主要生物过程（BP）、细胞组分（CC）、分子功能（MF）和信号通路。根据P值，取排名居前条目绘制成气泡图。

2.6.4 Western blot检测PI3K/Akt和MAPK信号通路相关蛋白表达量

按1×10⁵个/mL密度将H9c2细胞接种于六孔板中，按“2.3”项下方法进行分组和干预，应用Western及IP裂解液提取细胞中总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。经蛋白变性、电泳、转膜后，使用0.5%BSA室温封闭2 h，置于Bax、Bcl-2、Caspase-3、Cleaved Caspase-3、Akt、p-Akt、p38、p-p38、ERK、p-ERK（均1∶1 000）一抗中4 ℃孵育过夜，清洗后置于二抗（1∶5 000）中室温孵育2 h，清洗后于避光环境中均匀滴加型化学发光试剂，应用Bio-Rad成像系统完成成像，ImageJ软件量化目标条带蛋白表达灰度值，统计时以β-actin为内参进行标准化。

2.7 统计学方法

采用SPSS 25.0软件对数据进行分析。计量资料符合正态分布以（\overline{x}±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，若方差齐，两两比较采用Bonferroni检验；若方差不齐则采用Games-Howell检验。不符合正态分布以M（P₂₅，P₇₅）表示，采用Kruskal-Wallis H检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结　果

3.1 5组细胞凋亡情况及凋亡率比较

与对照组比较，模型组细胞凋亡率明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，低、中、高剂量组细胞凋亡率均明显降低（P＜0.05）。见图1和表2。

3.2 5组线粒体膜电位比较

与对照组比较，模型组线粒体膜电位明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，低、中、高剂量组线粒体膜电位均明显升高（P＜0.05）。见图2和表3。

3.3 5组凋亡相关蛋白表达量比较

与对照组比较，模型组Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase-3/Caspase-3均明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，低、中、高剂量组Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase-3/Caspase-3均明显降低（P＜0.05）。见图3和表4。

3.4 网络药理学与验证

3.4.1 交集靶点筛选

通过数据库筛选并以中位数为筛选标准，共获得汉黄芩苷药物作用靶点418个、AMI疾病靶点5 398个，取交集后得到251个交集靶点。见图4。

3.4.2 PPI网络模型构建与分析

将交集靶点导入Gene MANIA数据库中，其功能靠前为平滑肌细胞增殖调控、磷脂酰肌醇介导的信号转导、磷脂酰肌醇3-激酶信号通路，见图5。将交集靶点导入STRING数据库中得到靶点互作关系进行拓扑算法分析，该网络模型中汉黄芩苷干预心梗的潜在靶点有249个节点，3 253条相互作用线，节点为不同基因蛋白，边为其相连接的蛋白具有相互作用关系。节点大小以及颜色对应每个基因蛋白Degree值的大小，度值排名前3的核心靶点为肿瘤坏死因子（TNF）、白蛋白（ALB）、Akt1，见图6。

3.4.3 GO功能注释分析与KEGG通路富集分析

GO功能注释共获得生物学过程（BP）194条目项、细胞组分（CC）81条目项和分子功能（MF）182条目项，各条目排名前20的GO富集结果见图7A～7C。KEGG通路富集分析共得到163条信号通路，WO治疗AMI潜在靶点主要富集于MAPK和PI3K/Akt信号通路等途径，显著性排名前20结果见图7D。

3.4.4 5组PI3K/Akt和MAPK信号通路相关蛋白表达量比较

与对照组比较，模型组p-Akt/Akt明显降低（P＜0.05），p-p38/p38、p-ERK/ERK均明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，低、中、高剂量组p-Akt/Akt明显升高（P＜0.05），p-p38/p38、p-ERK/ERK均明显降低（P＜0.05）。见图8和表5。

4 讨　论

AMI发生、发展过程中，持续氧糖剥夺可导致心肌能量代谢紊乱和内环境失衡，引发细胞结构破坏与功能障碍，最终造成细胞凋亡与坏死，推动心室重构并进展为心力衰竭^［8］。其中线粒体功能障碍是心肌细胞凋亡的关键环节^［3］，氧糖剥夺可引起线粒体膜通透性增加、膜电位下降，激活凋亡信号。Bcl-2蛋白家族在此过程中起关键调控作用，促凋亡蛋白Bax与抗凋亡蛋白Bcl-2比例失衡时，线粒体释放细胞色素C，继而激活Caspase-3级联反应，引发细胞凋亡^［9］。因此，Bax、Bcl-2和Caspase-3的表达是评估凋亡的重要指标，抑制心肌细胞凋亡及线粒体损伤是防治心肌梗死的关键策略。本研究结果显示，WO能有效改善氧糖剥夺条件下心肌细胞损伤，降低线粒体膜电位下降幅度及细胞凋亡率，并显著下调促凋亡蛋白Bax和Cleaved Caspase-3的表达，上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，从而阻断凋亡级联反应，促进细胞存活。然而，WO发挥治疗AMI的作用机制尚不明确。

基于网络药理学分析，本研究整合筛选出251个汉黄芩苷针对AMI的潜在作用靶点，继而构建靶点互作网络及信号通路富集图，发现MAPK、PI3K/Akt信号通路被显著富集。PI3K/Akt信号通路是维持细胞存活和抑制凋亡的重要信号通路，其失活被证实可加速细胞凋亡进程^［10-11］，Akt作为该信号通路的关键蛋白激酶，当其磷酸化被抑制时，抗凋亡蛋白Bcl-2与促凋亡蛋白Bad形成异源二聚体，从而降低Bcl-2表达并增强Bax活性，最终激活Caspase级联反应，促进细胞凋亡。本研究结果表明，WO干预能够显著上调p-Akt/Akt比值，抑制Akt磷酸化失活，从而改善PI3K/Akt信号通路功能，发挥抗凋亡作用。同时，MAPK信号通路的异常激活也与细胞凋亡密切相关。MAPK家族成员p38和ERK在氧糖剥夺条件下磷酸化水平升高，促进凋亡因子的表达与合成^［12］。其中，p38 MAPK作为丝裂原活化蛋白激酶家族成员，在细胞应激反应和凋亡过程中发挥关键作用。而ERK在受到急性应激刺激时，若持续过度激活，同样可诱导细胞凋亡^［13］。研究表明，ERK活性与促凋亡蛋白Bax、P53呈正相关，与抗凋亡蛋白Bcl-2呈负相关^［14］。本研究结果显示，WO干预可显著降低p38和ERK的磷酸化水平，抑制MAPK信号通路异常激活，从而抑制细胞凋亡。

综上所述，WO可通过抑制心肌细胞凋亡、减弱MAPK信号通路异常激活，并恢复PI3K/Akt信号通路活性，从而减轻氧糖剥夺导致的心肌损伤。尽管本研究揭示了WO在抗AMI中的重要作用机制，但其在动物模型中的系统验证及关键靶点的功能研究仍需进一步深入。

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基金资助

福建省自然科学基金杰出青年项目(2024J010032)

福建省科技创新联合资金项目(2024Y9514)

第三批福建省卫生健康中青年领军人才研修培养项目

国家资助博士后研究人员计划C档资助项目(GZC20252576)

福建中医药大学项目资助项目(X2022001)

福建中医药大学项目资助项目(X2024008)