六味抗癌方调控AMPK/mTOR信号通路对结肠癌细胞增殖和自噬的影响

摘要

目的 探究六味抗癌方（LKR）调控腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路对结肠癌（CC）细胞增殖和自噬的影响。 方法 常规培养CT26细胞，采用随机数字表法，按干预方式将小鼠CC细胞CT26分为对照组（含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基）、5-氟尿嘧啶（5-FU）组（1 μmol/L）和LKR低、中、高剂量组（0.5、0.75、1 mg/mL），持续干预24 h。采用CCK-8法检测细胞活力，平板克隆形成实验检测细胞增殖能力，单丹磺酰尸胺（MDC）染色法和透射电子显微镜观察细胞自噬水平及细胞自噬超微结构变化，采用Western blot检测细胞内增殖相关蛋白［增殖细胞核抗原（PCNA）］、自噬相关蛋白［Bcl-2相互作用蛋白1（Beclin-1）、微管相关蛋白1轻链3（LC3）、泛素结合蛋白（p62）］及AMPK/mTOR信号通路相关蛋白表达。 结果 与对照组比较，LKR中、高剂量组细胞活力均降低（P<0.05），细胞克隆球形成数目均减少（P＜0.05），自噬荧光强度均增强（P＜0.05），透射电子显微镜下自噬小体、自噬溶酶体增多，LC3Ⅱ和Beclin-1蛋白表达水平、磷酸化（p）-AMPK/AMPK比值均增高（P＜0.05），p62和PCNA蛋白表达水平、p-mTOR/mTOR比值均降低（P＜0.05）；与5-FU组比较，LKR高剂量组细胞活力降低（P＜0.05），细胞克隆球形成数目减少（P＜0.05），自噬荧光强度增强（P＜0.05），电子显微镜下自噬小体、自噬溶酶体增多，LC3Ⅱ蛋白表达水平增高（P＜0.05），PCNA蛋白表达水平降低（P＜0.05）；与LKR低剂量组比较，LKR中、高剂量组细胞活力降低（P＜0.05），细胞克隆球形成数目减少（P＜0.05），自噬荧光强度增强（P＜0.05），LC3Ⅱ蛋白表达水平、p-AMPK/AMPK比值均增高（P＜0.05），p-mTOR/mTOR比值均降低（P＜0.05），高剂量组p62、PCNA蛋白表达水平降低（P＜0.05）；与LKR中剂量组比较，LKR高剂量组细胞活力降低（P＜0.05），细胞克隆球形成数目减少（P＜0.05），自噬荧光强度增强（P＜0.05），电子显微镜下自噬小体、自噬溶酶体增多，LC3Ⅱ蛋白表达水平增高（P＜0.05），PCNA蛋白表达水平、p-mTOR/mTOR比值均降低（P＜0.05）。 结论 LKR可通过激活AMPK/mTOR信号通路诱导CC细胞自噬和抑制细胞增殖来发挥抗CC的作用。

Graphical abstract

关键词

结肠癌 / 六味抗癌方 / 增殖 / 自噬 / AMPK/mTOR信号通路

结肠癌（colon cancer，CC）是全球发病率第3、致死率第2的恶性肿瘤，且近年来发病趋势呈现出明显的年轻化特征^［1-2］。年龄增长、肥胖、遗传因素、肠道疾病、不健康生活方式等均是诱发CC的危险因素^［3］。目前，CC的治疗手段仍依赖于手术切除、化疗、放疗等传统疗法^［4］。然而，化疗产生的全身细胞毒性及多药耐药等问题，严重影响患者预后。因此，亟待探寻具备安全性高、疗效确切且耐药性低的新型抗CC药物。

近年来，中医药在防治CC领域展现出独特的优势和潜力。众多研究成果表明，中医药具有多成分、多靶点、多途径的作用特点，不仅能有效遏制CC发生、发展，还能减轻治疗过程中产生的毒副作用，改善患者生活质量。六味抗癌方（Liuwei Kang'ai Recipe，LKR），原名“六味消癌方”，为福建省肿瘤医院治疗CC常用方，疗效确切。本课题组前期研究发现，LKR对CC细胞CT26的增殖有显著抑制作用^［5］，但作用机制尚未完全阐明。现有研究表明，细胞自噬作为一种重要的细胞自我调控机制，通过维持肿瘤细胞稳态、促进肿瘤细胞死亡、抑制肿瘤细胞增殖及增强免疫监视等途径，影响肿瘤细胞的恶性生物学行为，从而直接或间接发挥抗肿瘤作用。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路作为细胞能量代谢与生长调控的核心枢纽，在调控上述肿瘤细胞增殖与自噬中发挥重要作用。因此，本研究拟通过细胞实验探讨LKR调控AMPK/mTOR信号通路对CC细胞增殖、自噬的影响，为临床应用LKR预防和治疗CC提供理论与实验依据。

1 实验材料

1.1 实验细胞

小鼠CC细胞CT26（货号：CT26 TCM-C723）购自苏州海星生物科技有限公司，存放于福建中医药大学科技创新与转化中心液氮罐中。

1.2 实验药物

LKR组成：白花蛇舌草20 g，半枝莲20 g，莪术12 g，三棱12 g，山慈菇15 g，白毛藤15 g。中药饮片购买于福建省肿瘤医院中药房，存放于阴凉、干燥、通风处。注射用5-氟尿嘧啶（5-FU，山西普德药业有限公司，生产批号：02230804，规格：0.25 g）。

1.3 实验试剂

CT26细胞专用培养基（苏州海星生物科技有限公司，货号：TCM-G723）；0.25%胰蛋白酶溶液（含EDTA、酚红，溶于D-Hank's）（货号：ABK0004C）、飞克级超敏ECL发光液（货号：ABK0008W）均购自厦门艾碧康生物科技有限公司；泛素结合蛋白（p62/SQSTM1，杭州戴格生物技术有限公司，货号：db15523）；微管相关蛋白1轻链3（LC3）抗体（货号：14600-1-AP）、Bcl-2相互作用蛋白1（Beclin-1）抗体（货号：66665-1-Ig）、磷酸化（p）- mTOR（Ser2448）抗体（货号：67778-1-Ig）、mTOR抗体（货号：676888-1-Ig）均购自武汉三鹰生物技术有限公司；增殖细胞核抗原（PCNA）抗体（美国Selleck Chemicals有限责任公司，货号：F0018）；SuperKine™超敏型细胞增殖检测试剂（CCK-8，武汉亚科因生物技术有限公司，货号：BMU106）；丹酰戊二胺（MDC）自噬检测试剂盒（北京索莱宝生物技术有限公司，货号：G0170）；RIPA裂解液（高强度）（上海雅酶生物医药科技有限公司，货号：PC101）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，货号：AR1189）；β-肌动蛋白（β-actin）抗体（货号：YM3028）、p-AMPK α1/2（Thr183/172）抗体（货号：YP0575）、AMPK α1/2抗体（货号：YT0216）、HRP-GAM IgG（H＋L）（货号：RS0001）、HRP-GAR IgG（H＋L）（货号：RS0002）均购自美国Immuno Way Biotechnology公司。

1.4 实验仪器

细胞培养箱（美国Thermo Fisher Scientific公司，型号：3111）；荧光倒置显微镜（德国Leica公司，型号：DMIL LED）；酶标仪（瑞士Tecan公司，型号：SPARK）；高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司，型号：5430R）；化学发光成像系统（型号：Universal Hood Ⅱ）、转印系统（型号：PowerPac HC）均来自美国Bio-Rad公司；倒置显微镜［日本尼康映像仪器销售（中国）有限公司，型号：KP-Ts2-P-CF-1］；透射电子显微镜（日本Hitachi公司，型号：HT7800/HT7700）。

2 实验方法

2.1 药物制备

2.1.1 5-FU药液制备

精密称取5-FU粉末1.3 mg，加入1 mL基础培养基充分溶解，经0.22 μm微孔滤膜过滤，制备成浓度为10 mmol/L的5-FU药液，4 ℃冰箱避光保存。临用前采用完全培养基将其稀释至1 μmol/L的目标浓度。

2.1.2 LKR药液制备

将LKR中药饮片粉碎，按10倍质量比加入蒸馏水，煮沸并冷凝回流提取1 h，过滤收集提取液；药渣按上述条件重复提取1次。合并2次提取液并减压浓缩至100 mL，转移至蒸发皿中水浴蒸干水分，置于真空干燥箱减压干燥至恒重，即得LKR浸膏。精密称取适量LKR浸膏，加入基础培养基使其终浓度为10 mg/mL，超声30 min以充分溶解，经0.22 μm微孔滤膜过滤，分装于1.5 mL EP管中，4 ℃冰箱避光保存。临用前采用完全培养基稀释至目标浓度。

2.2 细胞培养及分组

将CT26细胞接种于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，置于37 ℃、体积分数5% CO₂和95 %饱和湿度的恒温细胞培养箱常规培养。待细胞贴壁且融合度达到80%～90%时，经0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2的比例进行传代。取处于对数生长期的细胞用于后续实验，按随机数字表法将其分为5组：对照组（含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基）、5-FU组（1 μmol/L）和LKR低、中、高剂量组（0.5、0.75、1 mg/mL）。

2.3 CCK-8法检测细胞活力

选择处于对数期且生长状态良好的CT26细胞制备细胞悬液，按1 000个/孔的密度均匀接种于96孔板中，每组设置6个平行复孔。待细胞完全贴壁后，对照组加入完全培养基，给药组分别加入对应的含药培养基，另向6个新孔中加入完全培养基并设为空白组；24 h后于避光条件下向每孔加入10 μL CCK-8试剂，置于培养箱内继续孵育50～90 min；随后使用酶标仪于450 nm波长下检测吸光度值（A）。

细胞存活率＝（A_{药物处理组}－A_空白组）/（A_对照组－A_空白组）×100%

2.4 平板克隆形成实验检测细胞增殖能力

选择处于对数期且生长状态良好的CT26细胞制备细胞悬液，按400个/孔的密度分别接种于6孔板，每组设置3个平行复孔。待细胞贴壁后，分别加入含各组对应终浓度药物的培养基进行干预，置于常规培养条件下继续培养7 d；使用PBS缓冲液轻柔漂洗细胞2次；加入4％多聚甲醛溶液，室温固定细胞20 min，加入1％结晶紫染色液室温避光染色30 min；随后使用PBS缓冲液反复漂洗至洗脱液基本澄清，置于室内自然干燥，并在倒置显微镜下观察，将包含50个及以上细胞的细胞群落计数为有效克隆，最后使用手机拍照软件以原始倍数进行拍照记录。

2.5 MDC法检测细胞自噬水平

选择处于对数期且生长状态良好的CT26细胞制备细胞悬液，按每孔4×10⁵个/孔的密度分别接种于6孔板，每组设置3个平行复孔。待细胞贴壁后，分别加入含各组对应终浓度药物的培养基进行干预24 h；干预结束后，沿孔壁缓慢加入清洗液清洗细胞；于避光条件下，向每孔加入1 mL MDC染液，室温避光孵育15～30 min；孵育结束后吸除染液，使用清洗液充分洗涤以去除游离染液；立即置于阻断滤光片波长512 nm的荧光倒置显微镜下观察细胞荧光形态，采集图像，采用ImageJ软件分析自噬荧光强度，以荧光强弱评估细胞自噬水平，MDC荧光强度越强，自噬水平越高。

2.6 透射电子显微镜观察细胞自噬超微结构

细胞接种、分组及给药干预同“2.5”项下方法。干预结束后，加入2.5%的常温戊二醛固定5 min，使用细胞刮刀轻柔刮下细胞并收集至离心管中，以3 000 r/min离心2 min收集细胞沉淀；弃上清后，缓慢沿管壁加入新鲜的2.5%戊二醛固定液避光固定30 min，4 ℃储存送样；经1%锇酸避光室温固定2 h，依次经梯度乙醇脱水、环氧树脂渗透并包埋，制备厚度约60～80 nm的切片；经2%醋酸铀及2.6%枸橼酸铅染色，室温干燥过夜；于透射电子显微镜下观察细胞自噬超微结构变化，并采集图像进行分析。

2.7 Western blot检测细胞增殖、自噬及AMPK/mTOR信号通路相关蛋白表达

选择处于对数期且生长状态良好的CT26细胞制备细胞悬液，按8×10⁵个/孔的密度分别接种于6孔板中，每组设置3个复孔。待细胞贴壁后，分别加入含各组对应终浓度药物的培养基进行干预24 h；干预结束后，收集细胞并加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解液提取细胞总蛋白；使用BCA法测定所得蛋白样品浓度，剩余蛋白加入蛋白上样缓冲液，并于100 ℃金属浴中变性处理10 min，存放于-80 ℃冰箱；设定每孔蛋白上样量为20 μg，经SDS-PAGE凝胶电泳分离后，采用湿法将目标蛋白转至PVDF膜，室温封闭30 min；随后分别加入细胞内增殖相关蛋白［PCNA（1∶1 000）］、自噬相关蛋白［Beclin-1（1∶5 000）、LC3（1∶5 000）、p62（1∶5 000）］、AMPK/mTOR信号通路相关蛋白［p-AMPK（1∶1 000）、AMPK（1∶1 000）、p-mTOR（1∶1 000）、mTOR（1∶1 000）］和内参蛋白［β-actin（1∶10 000）］的相应一抗孵育液，于4 ℃下摇床孵育12～18 h；经TBST洗膜后，加入对应HRP-GAR IgG（H＋L）（1∶5 000）或HRP-GAM IgG（H＋L）（1∶5 000）二抗孵育液，室温下摇床孵育1 h；再次经TBST充分漂洗，均匀滴加ECL化学发光显影液进行曝光并获取条带图像；采用ImageJ软件对条带灰度值进行定量分析，实验结果以目的蛋白与内参蛋白灰度值的比值表示。

2.8 统计学方法

采用SPSS 31.0软件进行统计分析。计量资料符合正态分布以（\overline{x}±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐时采用LSD检验进行两两比较，方差不齐时采用Tamhane's T²检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结　果

3.1 5组细胞活力比较

见表1。

3.2 5组细胞增殖能力比较

见图1和表2。

3.3 5组细胞自噬水平比较

见表3和图2。

3.4 4组细胞自噬超微结构比较

前期MDC染色结果显示，低剂量LKR干预并未显著改变细胞自噬水平。因此，后续的透射电子显微镜观察聚焦于中、高剂量LKR组，通过观察细胞自噬超微结构，进一步验证LKR对细胞自噬的调控作用。透射电子显微镜结果显示，与对照组比较，5-FU组、LKR中剂量组细胞受损，细胞膜界限模糊，胞内基质局部溶解不均匀，部分线粒体基质溶解，可见自噬溶酶体；LKR高剂量组细胞严重受损，细胞膜界限模糊，胞内基质大面积溶解，线粒体膜模糊，部分线粒体基质溶解，线粒体嵴断裂且数量减少，可见较多自噬溶酶体及少量自噬小体。见图3。

3.5 5组细胞增殖、自噬相关蛋白表达水平比较

见图4和表4。

3.6 4组细胞AMPK/mTOR信号通路相关蛋白表达水平比较

见图5和表5。

4 讨　论

CC与中医“积聚”“肠覃”“脏毒”等病具有较高临床相关性^［6］，湿热互结、瘀毒阻滞、气血亏虚为其重要病理因素^［7］。LKR具有清热解毒、活血化瘀、软坚散结的功效，临床上治疗CC疗效确切。大量研究表明，CC发生、发展的原因之一是肿瘤细胞异常增殖，PCNA在肿瘤细胞中的高表达是反映细胞增殖活性的关键指标^［8］。本研究结果显示，LKR干预后，CT26细胞活力和细胞克隆形成能力显著降低，PCNA蛋白表达水平下调，CT26细胞增殖活性受到抑制，且抑制作用随着药物浓度的增加而增强，LKR高剂量组对CT26细胞增殖的抑制作用强于5-FU组，提示LKR可通过抑制CC细胞增殖而发挥抗CC作用。

药理研究发现，LKR中的6味药材提取物或活性成分均能诱导肿瘤细胞自噬。“白花蛇舌草-半枝莲”药对组分激活人胃癌细胞（SGC-7901）线粒体自噬，抑制细胞增殖^［9］；“三棱-莪术”药对组分通过下调磷酸肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/mTOR信号通路诱导CC细胞发生自噬，抑制细胞增殖^［10］；山慈菇中的羟基酪醇通过调节活性氧类（ROS）/c-Jun氨基末端激酶（JNK）信号通路诱导骨肉瘤细胞自噬抑制其生长增殖^［11］；白毛藤的乙醇提取物可通过抑制Akt-mTOR信号通路，激活人卵巢癌腺癌细胞（SKOV3）的细胞自噬，发挥抗癌作用^［12］。这些研究从不同肿瘤细胞模型和分子机制层面证实了LKR组方药材均具有诱导肿瘤细胞自噬的能力。基于组方药材的药理活性，推测LKR可能通过诱导细胞自噬发挥抗CC的作用。已有研究报道，5-FU作为治疗CC、胃癌等消化道肿瘤的化疗药物，可通过诱导细胞自噬发挥抗肿瘤作用^［13-16］。因此，本研究设置5-FU作为阳性对照组，观察5-FU和LKR分别对CT26细胞自噬情况的影响。结果显示，5-FU和LKR组CT26细胞的自噬荧光强度显著增强，细胞受损并伴有自噬小体和自噬溶酶体增多，说明细胞自噬活性增强，且细胞自噬活性随药物浓度的增加而增强，LKR高剂量组诱导CT26细胞自噬的作用在本实验体系内强于5-FU组，提示LKR可通过诱导CT26细胞自噬而发挥抗CC作用。

自噬是生物体内至关重要的细胞内降解机制，Beclin-1、LC3Ⅱ和p62常被认为是检测自噬水平的重要指标^［17］。Beclin-1和LC3Ⅱ作为自噬过程的关键调控因子，在自噬体成核、自噬体膜的延伸过程中发挥重要作用^［18］。在自噬进程中，Beclin-1表达水平上调可解除对自噬的抑制，促进自噬小体形成^［19］。LC3Ⅰ可与磷脂酰乙醇胺结合并转化为LC3Ⅱ，后者定位于自噬体膜并参与自噬体的形成与延伸。因此，LC3Ⅱ表达水平升高通常提示自噬体数量增加^［20］。一般情况下，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值可用于自噬水平的半定量分析。但在Western Blot检测中，LC3Ⅱ的检测灵敏度往往高于LC3Ⅰ，LC3Ⅰ条带易出现信号较弱或不稳定的情况，导致LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值误差较大，进而影响结果可靠性。因此，本研究采用LC3Ⅱ/内参蛋白比值评价自噬相关变化。p62促进自噬体内容物转向自噬溶酶体而被降解^［21］。本研究结果显示，LKR能显著上调Beclin-1和LC3Ⅱ蛋白表达水平，并下调p62蛋白表达水平。这表明LKR有效激活了自噬流，促进了从自噬双层膜形成、自噬体成熟，到自噬溶酶体的形成与降解的完整动态过程。这一系列分子水平的变化与电镜观察到给药组细胞自噬小体和自噬溶酶体增多相互印证，进一步提示LKR可通过诱导CC细胞CT26自噬而发挥抗CC作用，但具体作用机制有待进一步研究。

为进一步探讨LKR诱导CC细胞自噬，抑制细胞增殖的分子机制，本研究对AMPK/mTOR信号通路中的关键蛋白进行了检测。AMPK是一种能量感应激酶，将其激活后，负向调控mTOR活性，可诱导肿瘤细胞自噬，抑制肿瘤细胞增殖^［22］。研究结果显示，LKR呈剂量依赖性促进AMPK磷酸化表达水平，抑制mTOR磷酸化蛋白表达水平。已有报道显示，当mTOR表达降低时，可通过磷酸化转录因子EB（TFEB）进入细胞核，调控LC3、Beclin-1和p62在内的自噬相关基因转录，增强细胞自噬能力^［23］。本研究结果再次验证了抑制mTOR表达，能提高Beclin-1和LC3Ⅱ蛋白表达水平，下调p62蛋白表达水平，促使自噬小体形成，降解自噬底物，进一步证实LKR通过激活AMPK/mTOR信号通路诱导肿瘤细胞自噬的作用；同时，活化的mTOR还能通过促进蛋白质合成，调控细胞周期进程，间接上调PCNA表达水平，进而促进细胞增殖^［24］。LKR抑制mTOR表达，下调PCNA表达水平，抑制CC细胞增殖。以上研究结果提示，激活AMPK/mTOR信号通路可能是LKR诱导CC细胞自噬、抑制细胞增殖的作用机制。

综上，LKR可通过激活AMPK/mTOR信号通路诱导CC细胞CT26自噬，下调PCNA蛋白表达水平，抑制CC细胞增殖。但其调控AMPK/mTOR信号通路的机制仍有待进一步研究，课题组将在后期研究中加入AMPK抑制剂进一步验证，为阐明LKR抗CC的作用机制提供更全面的理论与实验依据。

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基金资助

医健公益行-药学科研专项(ZGC-YXKY-45)

医健公益行-药学科研专项(ZGC-YXKY-81)

“2024耀动神州-药学科研能力建设基金”项目(Z04J2023E095)