基于网络药理学探讨解毒消癥饮治疗结直肠癌的作用机制

摘要

目的 基于网络药理学（NP）研究解毒消癥饮治疗结直肠癌（CRC）的作用机制，并进行实验验证。 方法 利用TCMSP和TCMID数据库筛选解毒消癥饮活性成分；利用SwissTargetPrediction数据库对解毒消癥饮活性成分作用靶点进行预测，利用GeneCards数据库筛选CRC相关靶点，将活性成分作用靶点与疾病靶点取交集，筛选解毒消癥饮治疗CRC的潜在作用靶点；利用Cytoscape 3.10.3软件绘制中药-活性成分-交集靶点网络图，筛选核心活性成分；利用STRING数据库构建交集靶点的蛋白质相互作用（PPI）网络，并筛选核心靶点；将交集靶点导入Metascape数据库进行基因本体论（GO）功能和京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路富集分析。实验验证解毒消癥饮治疗CRC的作用机制。制备解毒消癥饮乙酸乙酯提取物（EE-JXY）；以人结肠癌HCT-8细胞为研究对象，设立对照组及EE-JXY低（0.05 mg/mL）、中（0.1 mg/mL）、高（0.2 mg/mL）剂量组。采用倒置显微镜（40倍）观察EE-JXY对HCT-8细胞形态学的影响；采用CCK8法检测HCT-8细胞增殖活力；采用Western blot检测HCT-8细胞中PI3K-Akt信号通路相关蛋白［磷酸化（p）-磷酸肌醇3-激酶（PI3K）、PI3K、p-蛋白激酶B（Akt）、Akt］表达水平。 结果 NP筛选获得解毒消癥饮活性成分46个，活性成分作用靶点742个，疾病靶点1 788个，解毒消癥饮治疗CRC的潜在作用靶点245个；中药-活性成分-交集靶点网络包含木犀草素、槲皮素、山柰酚等18个核心活性成分；PPI网络显示Akt1、肿瘤坏死因子（TNF）、信号转导和转录激活因子3（STAT3）等20个核心靶点；GO功能分析获得2 704条显著富集条目，其中，生物学过程（BP）、细胞组分（CC）及分子功能（MF）分别包含2 285、127和292条；KEGG信号通路富集分析获得213条通路，主要涉及PI3K-Akt、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、缺氧诱导因子-1（HIF-1）等信号通路。实验验证表明，与对照组比较，EE-JXY低、中、高剂量组HCT-8细胞密度呈剂量依赖性下降，细胞间紧密连接遭到破坏，体积皱缩、变圆，并呈现不同程度脱落，细胞相对增殖活力均降低（P＜0.05），p-PI3K和p-Akt蛋白表达量均下降（P＜0.05），p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt比值均下降（P＜0.05），EE-JXY高剂量组PI3K蛋白表达量下降（P＜0.05）。 结论 解毒消癥饮能显著抑制CRC细胞增殖并诱导其发生形态学改变，其机制可能与复方中木犀草素、槲皮素等多种活性成分协同靶向抑制PI3K-Akt信号通路有关。

Graphical abstract

关键词

解毒消癥饮 / 网络药理学 / 结直肠癌 / PI3K-Akt信号通路

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是全球范围内高发病率和高病死率的常见消化道恶性肿瘤。流行病学研究显示，中国结肠癌发病率已达36.6/10万，死亡率17/10万^［1］。因其早期症状隐匿，病情进展常伴随复杂的局部及全身性病理改变，临床治疗极具挑战。针对该病发病特征，网络药理学（network pharmacology，NP）通过系统解析“药物-靶点-疾病”的相互作用网络，高度契合了中医药多成分、多靶点、多途径的整体治疗理念，打破了传统单一靶点的研究局限^［2-3］。杜建教授认为CRC病机以脾肾亏虚为本，湿热瘀毒为标，针对实证提出“清热解毒，软坚散结”治法，并创制解毒消癥饮，临床疗效确切^［4］。课题组前期研究已证实其能抑制肿瘤干细胞Wnt信号通路、促进肿瘤微环境中M1巨噬细胞极化来发挥抗肿瘤作用^［5-6］。然而，解毒消癥饮治疗CRC机制仍有待进一步研究。因此，本研究采用NP筛选并获取解毒消癥饮活性成分、潜在抗肿瘤靶点-靶点调控网络，发现磷酸肌醇3-激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）通路是解毒消癥治疗CRC的潜在关键通路，并开展细胞实验进行蛋白水平验证，从系统生物学角度将前期发现的单点机制扩展为全局调控网络，为深入开展多靶点协同治疗CRC的实验机制研究奠定理论基础。

1 实验材料

1.1 细胞

人结肠癌细胞HCT-8购自中国科学院细胞库/干细胞库（TCHu 18）。

1.2 中药及制备

解毒消癥饮由白花蛇舌草（批号：231001）、夏枯草（批号：231101）、山慈菇（批号：03-22100101）、苦参（批号：2312280201）组成，上述饮片均购自福建中医药大学附属第三人民医院中药房，并经福建中医药大学曾建伟高级实验师鉴定为正品。取中药饮片依次按白花蛇舌草∶夏枯草∶山慈菇∶苦参＝2∶1∶1∶1的质量比混合并粉碎均匀。取混合药粉，按1∶10的料液比，加入75%乙醇浸泡30 min，加热回流提取2次，每次1 h；合并2次回流提取液，使用旋转蒸发仪减压蒸馏浓缩后，依次使用石油醚提取3次、乙酸乙酯萃取3次；合并萃取液，减压蒸馏浓缩并真空冷冻干燥，即得解毒消癥饮乙酸乙酯提取物（EE-JXY）；干膏粉妥善保存备用。实验前准确称取适量干膏粉，使用二甲基亚砜（DMSO）完全溶解，配制成250 mg/mL的EE-JXY储备液。严格控制最终给药体系中DMSO的体积分数＜0.1%，以排除溶剂本身对细胞增殖的干扰。

1.3 试剂与耗材

RPMI-1640培养基（中国江苏凯基生物公司，货号：KGL1503-500）；胎牛血清（货号：A5669701）、含0.25% EDTA胰蛋白酶（货号：25200072）、BCA蛋白检测试剂盒（货号：23225）均购自美国Thermo Fisher Scientific公司；磷酸化（p）- PI3K抗体（澳大利亚Affinity Biosciences公司，货号：AF3241）；PI3K（货号：20584-1-AP）、p-Akt（货号：66444-1-Ig）、Akt抗体（货号：60203-2-Ig）均购自美国Proteintech公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体（美国Signalway Antibody公司，货号：21337）；羊抗兔二抗（中国江苏亲科生物公司，货号S0001）；羊抗鼠二抗（中国北京酷来搏科技公司，货号：AB2102）；超敏型细胞增殖检测试剂（CCK8，货号：BMU106）、增强型ECL发光液（货号：BMU101）均购自中国武汉亚科因生物公司；DMSO（中国北京索莱宝科技公司，货号：67-68-5）；Western及IP细胞裂解液（中国上海碧云天生物技术公司，货号：P0013）；磷酸酶抑制剂（货号：HY-K0021）、蛋白酶抑制剂（货号：HY-K0010）均购自美国MedChemExpress公司；一步法7.5% PAGE凝胶快速制备试剂盒（中国上海雅酶生物医药科技公司，货号：PG221）；无蛋白快速封闭液（中国武汉赛维尔生物科技公司，货号：G2052-500ML）。

1.4 仪器

倒置生物显微镜（德国Leica公司，型号：DMI1）；酶标仪［赛默飞世尔科技（中国）有限公司，型号：Multiskan FC］；基础电泳仪电源（型号：1645050）、电泳仪（型号：1658000）与转印槽（型号：1660827EDU）均购自美国Bio-Rad公司；高速冷冻离心机（中国香港力康生物医疗科技公司，型号：NEO 15R）；Amersham Image Quant 800超灵敏多功能成像仪（美国Danaher公司，型号：29399481）。

2 方　法

2.1 运用NP构建分子网络

2.1.1 解毒消癥饮活性成分和作用靶点的筛选

利用TCMSP（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）和TCMID（https：//www.megabionet.org/tcmid）数据库获取解毒消癥饮化学成分信息，以口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18作为阈值进行初筛。将初筛所得活性成分输入PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）获取其对应的标准SMILES ID。为进一步提高活性成分筛选可靠性，将上述SMILES ID导入SwissADME平台（http：//www.swissadme.ch），以高胃肠道吸收效率（GI absorption=high）和类药性（Druglikeness＝yes）为筛选条件，进行二次药代动力学过滤，最终锁定该复方活性成分。将活性成分导入SwissTargetPrediction数据库（http：//swisstargetprediction.ch），筛选Probability≥0.05并剔除重复项后，获取解毒消癥饮活性成分作用靶点。

2.1.2 CRC相关靶点数据库构建

在GeneCards数据库（https：//www.genecards.org）中以“Colonic Neoplasms”（结肠肿瘤）为关键词检索CRC相关靶点，构建CRC相关靶点数据库。

2.1.3 活性成分和疾病交集靶点的筛选

为提高预测的准确性并减少假阳性，筛选相关度评分≥10的疾病靶点。将解毒消癥饮活性成分作用靶点与CRC相关靶点进行映射并取交集；利用jvenn在线绘图工具（https：//www.bioinformatics.com.cn/static/others/jvenn/example.html）绘制韦恩图，筛选交集靶点，即为解毒消癥饮治疗CRC潜在作用靶点。

2.1.4 中药-活性成分-交集靶点网络图的构建

将交集靶点和对应的中药活性成分导入Cytoscape 3.10.3软件中，构建中药-活性成分-交集靶点网络图。通过软件内网络分析工具Network Analyzer完成网络拓扑分析，获取并导出拓扑数据。以节点度值（degree）平均数作为量化筛选阈值，旨在从复杂网络中精准识别并筛选起到关键调控作用的核心活性成分。

2.1.5 PPI网络构建

将交集靶点导入STRING数据库（https：//cn.string-db.org/），物种严格限定为“Homo Sapiens”，置信度阈值≥0.4，构建蛋白质相互作用（PPI）网络。将该图以tsv文件格式保存并导入Cytoscape 3.10.3软件中，最终确认解毒消癥饮治疗CRC的核心靶点。

2.1.6 GO功能和KEGG信号通路富集分析

将交集靶点导入Metascape数据库（https：//Metascape.org/gp/index.html#/main/step1）进行基因本体论（GO）功能和京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路富集分析。其中，GO功能分析全面涵盖生物学过程（BP）、细胞组分（CC）及分子功能（MF）3个重要维度。设定统计学显著性阈值为P＜0.01，并依据-log₁₀（P值）降序排列以评估其生物学重要性。分别筛选出GO功能分析3大分类排名前10的功能条目，以及KEGG信号通路富集分析排名前20的信号通路。导出分析数据后，利用微生信平台（https：//www.bioinformatics.com.cn/）绘图。

2.2 细胞实验

2.2.1 HCT-8细胞培养

HCT-8细胞常规培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，置于37 ℃、5% CO₂的恒温细胞培养箱内进行常规传代与扩增。

2.2.2 EE-JXY对HCT-8细胞形态学的影响

选取对数生长期的HCT-8细胞，以2×10⁵个/孔的密度接种于6孔板，待细胞贴壁后，吸弃旧培养基，加入含EE-JXY的新鲜培养基进行干预。依据药物终浓度设置对照组（仅加入与EE-JXY高剂量组等体积的DMSO，且严格控制体系内DMSO终浓度＜0.1%），以及EE-JXY低、中、高剂量组（终浓度分别为0.05、0.1、0.2 mg/mL）。4组细胞经上述对应药物持续干预48 h后，置于倒置显微镜（40倍）下观察HCT-8细胞的形态学改变及生长状态。

2.2.3 CCK8法检测HCT-8细胞增殖活力

选取对数生长期的HCT-8细胞，以8×10³个/孔的密度接种于96孔板中，待细胞贴壁后，吸弃旧培养液，加入含EE-JXY的新鲜培养基进行干预，给药分组与干预浓度均同“2.2.2”项。4组细胞经上述对应药物持续干预48 h后，吸弃各孔培养液，并用PBS轻轻洗涤1次，每孔加入100 μL现配的CCK-8溶液（由10 μL CCK-8原液与90 μL无酚红新鲜培养基混合配制），放入37 ℃、5%CO₂恒温培养箱孵育2 h。孵育结束后，使用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度（OD）值。以对照组平均OD值为100%基准进行均一化比较，计算各给药组细胞相对增殖活力。

2.2.4 Western blot检测HCT-8细胞中PI3K-Akt信号通路相关蛋白表达水平

选取对数生长期的HCT-8细胞，以2×10⁵个/孔的密度接种于6孔板，待细胞贴壁后，吸弃旧培养液，加入含EE-JXY的新鲜培养基进行干预，给药分组与干预浓度均同“2.2.2”项。药物干预48 h后，胰酶消化收集细胞，4 ℃预冷的PBS溶液洗涤细胞后，加入含磷酸酶抑制剂与蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，转移裂解液至离心管，于冰上裂解30 min。在4 ℃下以14 000 r/min离心20 min，转移上清至新的离心管中。经BCA法测定蛋白浓度后，取等质量蛋白以7.5% SDS-PAGE凝胶电泳分离，并将蛋白转移至孔径为0.45 μm的PVDF膜上，将膜置于脱脂牛奶封闭1 h；随后分别加入p-PI3K（1∶750）、PI3K（1∶750）、p-Akt（1∶2 000）、Akt（1∶5 000）、GAPDH（1∶5 000）抗体，于4 ℃摇床孵育过夜。次日用TBST溶液漂洗PVDF膜3次，10 min/次，随后向p-PI3K、PI3K、GAPDH一抗加入兔二抗（1∶10 000），向p-Akt、Akt一抗加入鼠二抗（1∶10 000），室温孵育1 h。用同法漂洗PVDF膜，滴加ECL显影液进行显影并使用ImageJ软件量化各蛋白条带灰度值。

2.3 统计学方法

采用SPSS 26.0软件对数据进行分析，对计量资料进行Shapiro-Wilk正态性检验与Levene方差齐性检验，符合正态分布且方差齐性以（\overline{x}±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结　果

3.1 解毒消癥饮活性成分及作用靶点筛选

通过筛选获得解毒消癥饮活性成分48个，去重后为46个有效活性成分，活性成分作用靶点742个。见表1。

3.2 CRC相关靶点和解毒消癥饮治疗CRC潜在作用靶点

筛选获得CRC相关靶点1 788个。将解毒消癥饮活性成分作用靶点与CRC相关靶点相映射并取交集，获得解毒消癥饮治疗CRC的潜在作用靶点245个。见图1。

3.3 中药-活性成分-交集靶点网络分析

该网络包含244个节点和1 101条边。以网络节点度值平均数24.5作为阈值，共识别出拓扑重要性大于该均值的核心活性成分18个，包括木犀草素、槲皮素、山柰酚等。见图2和表2。

3.4 PPI网络图的构建与分析

PPI网络共245个节点和5 499条相互作用关系，见图3A。取度值排序前20的核心靶点再次绘图，见图3B。前20名核心靶点的具体排名为蛋白激酶B（Akt1）、肿瘤坏死因子（TNF）、信号转导和转录激活因子3（STAT3）、白细胞介素-6（IL-6）、胱天蛋白酶3（Caspase-3）、缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）、热休克蛋白90α家族A类成员1（HSP90AA1）、雌激素受体1（ESR1）、核因子-κB1（NF-κB1）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）、热休克蛋白90α家族B类成员1（HSP90AB1）、丝裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、Erb-B2受体酪氨酸激酶2（ERBB2）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）、前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）、磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶催化亚基α（PIK3CA）、成纤维细胞生长因子2（FGF2）、丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、信号转导和转录激活因子1（STAT1）。见表3。

3.5 GO功能富集分析

GO功能富集分析共获得2 704条显著富集条目。其中，BP、CC和MF分别包含2 285、127和292条。见图4。

3.6 KEGG信号通路富集分析

KEGG通路富集分析共获得213条通路。根据-log₁₀（P值）进行降序排序，筛选出排名前20的通路，主要涉及信号通路包括PI3K-Akt、MAPK、HIF-1、Ras和AGE-RAGE等。见图5。

3.7 4组HCT-8细胞形态学比较

对照组HCT-8细胞呈典型的上皮细胞样形态，贴壁状态良好，细胞形态饱满且紧密堆积，形成明显的细胞集落。与对照组比较，EE-JXY低、中、高剂量组细胞的增殖与贴壁能力受到显著抑制，呈现出明显的剂量依赖性形态学改变：细胞密度进行性下降，细胞间紧密连接遭到破坏导致集落松散；细胞体积逐渐皱缩、变圆，并呈现不同程度脱落。见图6。

3.8 4组HCT-8细胞增殖活力比较

见表4。

3.9 4组HCT-8细胞中PI3K-Akt信号通路相关蛋白表达水平比较

选取KEGG通路富集分析获得评分较高的PI3K-Akt信号通路以进一步验证解毒消癥饮治疗CRC作用机制。见图7和表5。

4 讨　论

解毒消癥饮是杜建教授治疗消化道肿瘤的经典验方，其在临床治疗肝癌、胃癌及CRC方面均展现出确切疗效^［7-9］。本研究基于NP策略，系统挖掘该方治疗CRC的核心活性成分及潜在作用靶点。网络拓扑分析显示，Akt1、STAT3、IL-6、TNF、NF-κB1等核心靶点节点度值较高，且KEGG富集结果高度集中于PI3K-Akt、MAPK及HIF-1等经典癌症信号通路，提示中药复方多组分、网络化协同干预的整体特征。文献研究表明，本研究筛选出的核心活性成分的抗肿瘤活性及其药理机制高度聚焦于PI3K-Akt信号通路。例如，木犀草素、槲皮素、山柰酚及飞燕草素已被证实能通过靶向抑制PI3K-Akt及其下游级联通路，进而逆转前列腺癌耐药性或诱导肺癌、宫颈癌及卵巢癌等多种癌细胞的凋亡与侵袭抑制^［10-13］。上述研究结果提示，PI3K-Akt通路可能参与解毒消癥饮治疗CRC的作用机制。此外，前期研究已证实，解毒消癥饮可通过抑制HIF-1/miR-210表达，抑制细胞糖酵解能力，达到抑制肝癌细胞增殖、侵袭及转移的目的^［7］。本研究通过KEGG富集分析同样获得解毒消癥饮调控HIF-1缺氧诱导信号通路的结果，这与前期研究结论一致。该结果也进一步证实了解毒消癥饮多通路、多途径的抗肿瘤作用。

PI3K-Akt信号通路是介导CRC肿瘤生长的核心级联调控网络，当PI3K被上游受体酪氨酸激酶激活后，可催化生成第二信使磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3），招募并磷酸化Akt蛋白，进一步抑制下游促凋亡蛋白，激活促增殖因子，调控代谢重编程，驱动肿瘤生长^［14-15］。药理研究表明，解毒消癥饮的核心药味均具有显著靶向该通路的抗癌潜力。例如，白花蛇舌草通过PI3K-Akt信号通路诱导5-氟尿嘧啶耐药的结肠癌细胞凋亡并抑制细胞生长^［16］；夏枯草通过PI3K-Akt通路抑制乳腺癌的血管新生和炎症反应^［17］；山慈菇调控PI3K-Akt信号通路，抑制乳腺癌细胞的增殖并诱导凋亡^［18］。此外，本研究发现，EE-JXY不仅显著抑制了上游核心激酶PI3K的蛋白表达水平，同时还削弱了PI3K及其下游效应分子Akt的磷酸化激活状态，进一步提示通过抑制PI3K-Akt信号通路激活是解毒消癥饮治疗CRC的潜在途径。

综上，本研究通过NP并结合文献报道，推测解毒消癥饮通过木犀草素、槲皮素、山柰酚等多个核心活性成分，广泛作用于Akt1、STAT3、IL-6等核心蛋白靶点，进而调控PI3K-Akt、MAPK、HIF-1等信号通路，在理论层面展现出抗炎、抗增殖、促凋亡、抑制血管新生等多种生物过程，发挥对CRC细胞的干预作用。本研究进一步通过细胞实验确证，EE-JXY不仅能显著破坏HCT-8细胞的形态集落，并呈剂量依赖性地抑制CRC细胞增殖活力；其内在机制部分归因于EE-JXY能够下调PI3K蛋白表达，并特异性降低p-PI3K和p-Akt磷酸化水平，从而有效阻断PI3K-Akt信号通路激活。本研究不仅初步阐明了解毒消癥饮治疗CRC的分子机制，也为其作为抗癌候选药物的后续临床转化及深度开发提供了可靠的实验支撑与理论依据。

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基金资助

福建省自然科学基金项目(2025J01891)

福建中医药大学校管课题(X2024034)