常绿钩吻碱壳聚糖微乳温敏凝胶的体外性质、安全性及抗脑胶质瘤活性研究

摘要

目的 对常绿钩吻碱壳聚糖微乳温敏凝胶（SPV-CTMH）的体外性质、安全性及抗脑胶质瘤活性进行研究。 方法 采用恒温磁力搅拌法制备常绿钩吻碱（SPV）微乳，结合冷溶法制备泊洛沙姆（P）407/P188温敏凝胶，并加入壳聚糖成功构建SPV-CTMH。通过高温［（40±2）℃］、强光（4 500 Lux）和长期［温度（25±2）℃、相对湿度（60±5）%、6个月］试验考察SPV-CTMH的稳定性；采用Franz扩散池法考察SPV-CTMH体外释放行为；建立蟾蜍上颚模型，考察纤毛持续摆动时间（PVD）和相对PVD百分率，并观察纤毛形态评价其纤毛毒性；同时，应用SD大鼠连续滴鼻模型，观察体质量、挠鼻和打喷嚏频次等行为学表征以及鼻黏膜组织病理学变化，综合评价制剂安全性；采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法考察SPV-CTMH对神经胶质瘤U251细胞的抑制作用。 结果 稳定性考察显示，SPV-CTMH在高温、强光和长期留样考察中，其外观性状稳定，pH值和载药量均无统计学差异（P＞0.05），具备良好稳定性。体外释药结果显示，与SPV溶液比较，SPV-CTMH具有双相释药特性，前期（0～8 h）快速释放以提供局部负荷剂量，后期平稳持久缓释，48 h累积释放率约90%。释药曲线符合Higuchi释放模型（Q＝13.37t^1/2－8.05，R²＝0.982 7）。安全性评价显示，SPV-CTMH组的PVD为（590.87±3.67）min，相对PVD百分率为（90.71±0.39）%，其安全性与呋麻滴鼻液相当（P＞0.05）；生物显微镜下见纤毛致密饱满、排列整齐，未见剥脱。大鼠滴鼻1周内体质量稳定增长，无全身系统性毒性；与生理盐水组和呋麻滴鼻液组比较，SPV-CTMH组挠鼻和打喷嚏频次总和差异均无统计学意义（P＞0.05）；组织病理学显示其鼻黏膜上皮结构完整，无充血、水肿及炎性细胞浸润。SPV-CTMH对U251细胞呈浓度依赖性的增殖抑制作用，其半数抑制浓度（IC₅₀）为（3.03±0.19）μmol/L，与SPV溶液的IC₅₀（3.04±0.21）μmol/L相当，2组抑制率无统计学差异（P＞0.05）。 结论 SPV-CTMH制备工艺可行且理化性质稳定，具备良好的缓释特性和鼻腔生理相容性，在安全递药的同时能高效保留SPV的抗脑胶质瘤活性，是一种极具潜力的脑靶向新型无创递药系统方案。

Graphical abstract

关键词

常绿钩吻碱 / 微乳温敏凝胶 / 稳定性 / 体外释放 / 安全性 / 脑胶质瘤

脑胶质瘤是起源于星形胶质细胞，在中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤，恶性程度高且侵袭性强，患者临床预后极差^［1］。流行病学研究显示，我国脑胶质瘤的发病率与病死率均为全球第1，且呈逐年攀升趋势，目前已成为35岁以下人群的第2大肿瘤致死原因^［2］。尽管化疗仍是目前临床治疗的主要方法之一^［3］，但血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）的存在限制了药物入脑效率，加之现有化疗药物普遍存在易诱发耐药性和毒副作用等瓶颈，导致总体治疗失败率居高不下^［4-6］，亟待探索新型递药策略。常绿钩吻碱（sempervirine，SPV）是存在于中药钩吻中的一种育亨宾型生物碱，已被证实对脑胶质瘤具有显著的抑制作用^［7］。然而，SPV不良的水溶性和难以透过BBB的理化特性，严重制约其体内药效的发挥与最终的临床转化。

近年来，经鼻腔给药的脑靶向药物递送已成为国内外研究热点，药物经鼻腔给药后，可透过嗅区黏膜，沿嗅球神经束周围的结缔组织或嗅神经元轴突转运，跨越BBB直接进入脑脊液或脑室发挥药物治疗效果^［8-9］。微乳温敏凝胶兼具微乳与原位凝胶的双重剂型优势，前者不仅能提升难溶性药物的溶解度及黏膜渗透性，且在给药初期保持良好流动性，克服了传统滴鼻剂或喷鼻雾剂的局限性^［10］；后者在接触鼻腔生理温度环境后可迅速转变成半固体凝胶态，利用其良好的黏膜黏附特性实现药物在鼻黏膜的长效滞留^［11-12］。此外，壳聚糖作为一种优良的生物高分子促透剂，可进一步特异性改善药物在鼻黏膜的渗透行为^［13-14］。鉴于此，本研究在制备微乳温敏凝胶时加入壳聚糖，成功构建了常绿钩吻碱壳聚糖微乳温敏凝胶（SPV chitosan thermosensitive microemulsion-based hydrogel，SPV-CTMH）。该递药系统旨在改善SPV溶解性，延长其在鼻黏膜的滞留时间并促进有效吸收，使得SPV的脑靶向性能得以提升^［15］；同时，该制剂兼具快速、方便、无痛等优点，有利于实现SPV的临床推广应用。为奠定该鼻腔给药制剂的临床前研发基础，本研究对所制备的SPV-CTMH的体外性质及抗肿瘤活性进行评价，并对其安全性进行评估，为鼻腔给药制剂的研发奠定实验基础。

1 实验材料

1.1 实验动物

雄性SPF级6～8周龄SD大鼠，初始体质量180～200 g，由杭州医学院实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK（浙）2019-0002，质量合格证号：20211229Aazz0100000407，大鼠统一饲养于福建中医药大学药学院动物房。饲养环境温度（22±2）℃，相对湿度（50±5）%，采用12 h明暗交替光照，保持良好通风，自由饮食、饮水。普通级中华大蟾蜍，体质量40～50 g，雌雄兼有，购自当地正规农贸市场。

1.2 实验细胞

人神经胶质瘤U251细胞株（货号：SCSP-559）购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所，存放于福建中医药大学药学院-80 ℃冰箱中。

1.3 实验试药

SPV对照品（武汉天植生物技术有限公司，货号：CFS201902，纯度≥98%）；SPV样品（实验室自制，纯度≥98%）；泊洛沙姆407（P407，货号：GND32821B）、泊洛沙姆188（P188，货号：GNE20321B）均购自德国BASF公司；聚氧乙烯氢化蓖麻油（上海麦克林生化科技有限公司，货号：C12462376）；辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯（Labrasol^®，上海麦克林生化科技有限公司，货号：C11372212）；壳聚糖（货号：BCCF8502）、甲醇（货号：l11509071 20）、乙腈（货号：l1104130029）均购自德国默克集团有限公司；油酸聚乙二醇甘油酯［嘉法狮（上海）贸易有限公司，货号：3063BA2］；1，2-丙二醇（上海麦克林生化科技有限公司，货号：C11905857）；乙酸（上海阿拉丁生化科技有限公司，货号：J2121438）。

1.4 实验仪器

药物透皮扩散试验仪（上海黄海药检仪器有限公司，型号：RYJ-68）；磁力搅拌器（巩义市英峪博研仪器设备厂，型号：ZLCL-2A）；数显水浴锅（承德国华电器有限公司，型号：HH-2）；超高效液相色谱仪（美国Waters公司，型号：Waters 2695）；高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，型号：H2050R）；制冰机（宁波新芝生物科技股份有限公司，型号：XB-130）；全自动细胞计数仪（广州博大博聚科技有限公司，型号：JSY-SC-021H）；生物显微镜［奥林巴斯（中国）有限公司，型号：CX31］。

2 实验方法

2.1 SPV-CTMH的制备

基于前期处方筛选、伪三元相图法、Box-Behnken响应面法优化法确定处方工艺制备^［15］。按质量比5.00∶19.53∶19.25∶56.22的比例精密称定油酸聚乙二醇甘油酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油、1，2-丙二醇和蒸馏水。首先将聚氧乙烯氢化蓖麻油和1，2-丙二醇混合均匀，随后加入油酸聚乙二醇甘油酯，在恒温磁力搅拌下缓慢加入处方量SPV和蒸馏水，继续搅拌至混合均匀，制得SPV含量为2.2 mg/mL的SPV微乳。精确称取处方量4.21%（W/V）的P407和16.92%（W/V）的P188粉末^［16］，将其均匀铺展于蒸馏水面，于4 ℃静置24 h以上，直至聚合物完全溶胀，形成澄清透明无团块的空白温敏凝胶。随后，将空白温敏凝胶置于冰水浴中持续磁力搅拌，按1∶1质量比缓慢滴入前述SPV微乳，继续搅拌20 min使其充分混合，得到SPV微乳温敏凝胶。最后，将壳聚糖充分溶解于1%乙酸溶液中，并与SPV微乳温敏凝胶混合制成含0.2%（W/V）壳聚糖的SPV-CTMH。制得的SPV-CTMH的pH值为（6.03±0.05），本品的pH符合鼻用制剂的pH范围^［16］。

2.2 稳定性考察

2.2.1 色谱条件

色谱条件参照文献［15］设定。色谱柱：ACQUITY UPLC^® BEH C₁₈色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流动相：乙腈（B）-0.1%甲酸水（D），梯度洗脱（0～0.5 min，90%B；0.5～2.0 min，90%B～20%B；2.0～2.5 min，20%B；2.5～2.8 min，20%B～90%B；2.8～5.0 min，90%B）；柱温45 ℃；流速0.25 mL/min；检测波长242 nm；进样量2 μL。

2.2.2 高温试验

依据2020年版《中华人民共和国药典：四部》通则9001“原料药物与制剂稳定性试验指导原则”中的相关要求进行高温试验^［17］458。预实验结果显示，SPV-CTMH在60 ℃条件下发生形态改变，故采用（40±2）℃作为高温试验温度。精确称取3组独立制备的SPV-CTMH样品置于恒温培养箱中，分别于第5天和第10天定时取样，并与0时初始样品比较。观察其外观性状，同时测定pH值，并采用UPLC法测定高温条件下的载药量。

2.2.3 强光照射试验

依据2020年版《中华人民共和国药典：四部》通则9001“原料药物与制剂稳定性试验指导原则”中的相关要求进行强光照射试验^［17］458。精确称取3组独立制备的SPV-CTMH样品平铺于透明玻璃小瓶中，置于光照强度为（4 500±500）Lux、温度恒定于25 ℃的光照培养箱中；分别于第5天和第10天定时取样，并与0时初始样品比较。观察其外观性状，同时测定pH值，并采用UPLC法测定强光条件下的载药量。

2.2.4 长期试验

依据2020年版《中华人民共和国药典：四部》通则9001“原料药物与制剂稳定性试验指导原则”中的相关要求进行长期试验^［17］458。精确称取3组独立制备的SPV-CTMH样品，分装于15 mL具塞西林瓶中，将其放置于温度（25±2）℃、相对湿度（60±5）%环境中进行长期留样考察。分别于试验的第0、1、3、6个月末定时取样，观察其外观性状，同时测定pH值、胶凝温度和不同时间点的载药量。

2.3 体外释放度考察

采用Franz扩散池法^［18］考察SPV-CTMH体外释放度。将截留分子量3 000的透析袋活化，裁剪为小段后用夹子固定两端，放置于供给池与接收池间。接收池中预先加入7 mL、pH值6.4的磷酸盐缓冲液，开启水浴循环系统，将扩散池整体温度恒定于模拟鼻腔生理温度（34±0.5） ℃，磁力搅拌速度为150 r/min。随后，分别精密称取1.0 g SPV溶液和SPV-CTMH各3份，均匀滴加涂布于供给池的半透膜表面，于（34±0.5） ℃水浴下放置15 min，促使凝胶完全固化。按设定时间节点，分别于0.5、0.75、1、2、4、6、8、12、24、48 h自接收池侧管精密吸取1 mL释放液，并立即补充同体积、同温度的磷酸盐缓冲液。取样液经0.22 μm滤膜过滤后，以UPLC测定药物浓度。按照公式（1）计算累计释放率（Q_n ）。

Q_n ＝（C_nV＋V_i{\sum }_{i=\mathrm{1}}^{n-\mathrm{1}}{C}_i）/Q₀×100%（1）

式中，Q_n 为第n个取样时间点的累积药物释放百分比，C_n 为第n次取样时测得的药物质量浓度，V为接收池的总体积，V_i 为每次固定取样的体积（1 mL），C_i 为前i次浓度总和，Q₀为制剂中SPV总量。最终以释药时间t为横轴、累积释放率Q_n 为纵轴，绘制释放曲线。

2.4 安全性评价

2.4.1 纤毛毒性试验方法

将25只健康中华大蟾蜍按随机数字表法分为5组，每组5只，具体设定为：生理盐水组、呋麻滴鼻液组、1%脱氧胆酸钠组、空白壳聚糖微乳凝胶组、SPV-CTMH组，其中呋麻滴鼻液含1%盐酸麻黄碱。蟾蜍经探针毁髓毁脑后，采用在体上颚黏膜接触法给药。将蟾蜍仰卧固定于手术板，以止血钳撑口，充分暴露上颚，防止蟾蜍上颚闭合或者吞咽药物。根据组别分别精准滴加0.5 mL生理盐水、呋麻滴鼻液、1%脱氧胆酸钠、空白壳聚糖微乳凝胶、SPV-CTMH于蟾蜍上颚黏膜中心区域，确保溶液均匀覆盖纤毛表面并充分接触作用20 min。随后，无菌剪取约3 mm×3 mm的中心给药区上颚黏膜组织，用生理盐水温和漂洗去尽残留血渍和药液，将纤毛面朝上置于载玻片中央，滴加1滴生理盐水后缓慢覆上盖玻片，立即置于400倍的生物显微镜下连续观察各组纤毛摆动情况，并将载玻片移置于预先设定为25 ℃且底部盛有少量蒸馏水以维持饱和湿度的密闭层析缸中孵育，每隔25 min取样观察并补液，持续追踪直至该视野内所有纤毛彻底停止摆动，据此系统评价各供试液对黏膜纤毛系统生理活性的毒性影响。

2.4.1.1 纤毛持续摆动时间

严密记录从黏膜接触药液开始至显微视野下纤毛完全停止机械摆动的绝对时间跨度，该指标定义为纤毛持续摆动时间（PVD）。以生理盐水组PVD为基线（设为100%），计算其余各给药组PVD值与之的比值，即为相对PVD百分率。该百分率数值越高，供试制剂的鼻纤毛毒性越低。

2.4.1.2 纤毛形态

借助具有拍摄功能的生物显微镜记录各组蟾蜍上颚纤毛微观形态。

2.4.2 鼻黏膜刺激性考察

取健康成年SD大鼠30只，按随机数字表法分为5组，每组6只，即生理盐水组、呋麻滴鼻液组、1%脱氧胆酸钠溶液组、空白壳聚糖微乳凝胶组、SPV-CTMH组。采用平头微注射器经大鼠单侧鼻腔给予药液50 μL，给药后轻压大鼠鼻翼数秒以防药液反流或被直接吸入气管。参照文献［19］每日定时单侧给药1次，连续7 d。分别于第1、3、5、7天给药后连续观察30 min，详细记录大鼠行为学表征，以体质量变化、挠鼻和打喷嚏频次总和为核心指标进行鼻黏膜刺激性分析。于第7天末次给药后24 h，采用颈椎脱臼法处死各组大鼠，迅速完整剥离带有受试黏膜的鼻中隔组织，以4%多聚甲醛固定。经标准梯度脱水、石蜡包埋、切片（厚度4～5 μm）及苏木精-伊红（HE）染色后，于400倍生物显微镜下观察并比较5组给药后大鼠鼻黏膜组织病理学变化。

2.5 药效学考察

2.5.1 细胞复苏及培养

取出冻存于-80 ℃的神经胶质瘤U251细胞，置于37 ℃恒温水浴锅中摇晃解冻。将细胞转入含10%胎牛血清、100 μg/mL双抗（青霉素和链霉素）的DMEM培养基中，于37 ℃、5% CO₂的细胞恒温培养箱中常规培养。待细胞贴壁生长融合至对数生长期（70%～80%）后，用含0.25% EDTA的胰酶消化，按照1∶2比例传代后继续扩增培养。

2.5.2 MTT比色法试验

取处于对数生长期的U251细胞，用含0.25% EDTA的胰酶消化脱壁，1 000 r/min离心5 min，吸弃上清，用上述DMEM培养基混合成均匀的单细胞混悬液。使用全自动细胞计数仪进行细胞计数，调整细胞接种密度为3×10⁵个/mL，用移液枪吹打均匀，接种于96孔细胞培养板中，每孔100 μL，置于细胞培养箱中过夜培养使其充分贴壁。次日吸弃培养基后，加入含不同浓度（1、2、4、8、16 μmol/L）SPV溶液和SPV-CTMH的完全培养基各100 μL作为给药考察组，同时设立空白组（不含药物的完全培养基）和对照组（不含细胞不给药，只有完全培养基），每组平行设置6个复孔。于细胞培养箱中培养72 h后，吸弃各孔原有培养基，每孔加入四甲基偶氮唑盐（MTT）工作液（10 mg/mL）10 μL，将96孔板重新放入细胞培养箱中避光孵育4 h。随后吸弃孔内液体，每孔加入100 μL DMSO充分溶解，于酶标仪540 nm波长处测定吸光值（OD值）。按照公式（2）计算各给药组对增殖的抑制率。进一步利用GraphPad Prism软件计算半数抑制浓度（IC₅₀）并绘制量效关系曲线，以此评价SPV溶液和SPV-CTMH对U251细胞增殖的抑制作用。

抑制率＝（OD_实验组－OD_对照组）/（OD_空白组－OD_对照组）×100%（2）

2.6 统计学方法

采用SPSS 24.0软件进行数据分析。计量资料符合正态分布以（\overline{x}±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，若方差齐，组间两两比较采用LSD-t法；若方差不齐则采用Games-Howell法。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结　果

3.1 稳定性考察结果

3.1.1 色谱行为考察

根据参考文献［15］，该色谱条件下SPV色谱峰形良好，分离度符合要求。线性关系考察结果显示，在2.5～30 μg/mL范围内线性关系良好（r＝0.999 9）；精密度与加样回收率试验结果均符合相关规定，表明该色谱条件适用于SPV的含量测定。

3.1.2 高温试验考察结果

与第0天SPV-CTMH样品比较，第5天和第10天的SPV-CTMH样品外观性状未发现明显变化，体系的pH值和载药量差异均无统计学意义（P＞0.05），提示该制剂在高温条件下稳定性良好。见表1。

3.1.3 强光试验考察结果

与第0天SPV-CTMH样品比较，第5天和第10天的SPV-CTMH样品外观性状未发现明显变化，体系的pH值和载药量差异均无统计学意义（P＞0.05），提示该制剂在强光条件下稳定性良好。见表2。

3.1.4 长期试验考察结果

与第0天SPV-CTMH样品比较，第1、3、6个月的SPV-CTMH样品外观性状无明显变化，体系的pH值、胶凝温度和载药量差异均无统计学意义（P＞0.05），提示该制剂在拟定储存条件下具备长期稳定性。见表3。

3.2 体外释放度考察结果

释药曲线显示，SPV对照溶液呈现快速自由扩散特征，其在12 h内累积释放率约75%，24 h时接近90%，并于48 h时基本完成释放。SPV-CTMH表现出双相释药特性：在给药初期（约0～8 h）呈现快速释放，有助于鼻腔给药后迅速提供局部负荷剂量以快速入脑起效；随后转入平稳持久的缓释相，其24 h累积释放率控制在约60%，至48 h时累积释放率稳步达到约90%，有效避免药物在鼻腔黏膜的过快清除。见图1。

以零级、一级和Higuchi释药模型对扩散池法测得的SPV-CTMH中SPV的累积释放率进行释药行为拟合分析。与零级动力学比较，SPV-CTMH释药行为与一级动力学和Higuchi方程的拟合优度极高，其中又以Higuchi方程拟合度最高，提示该药物释放过程遵循微乳液滴从凝胶网状结构中的扩散控释机制，表现为典型的缓释特征，可有效延长制剂在鼻黏膜局部的滞留时间。见表4。

3.3 安全性评价

3.3.1 纤毛毒性试验结果

3.3.1.1 5组蟾蜍上颚PVD和相对PVD百分率比较

见表5。

3.3.1.2 5组纤毛形态比较

1%脱氧胆酸钠组纤毛基本脱落，运动接近停止，提示1%脱氧胆酸钠溶液对黏膜组织具有破坏性和结构毒性，能显著抑制纤毛运动；生理盐水组、呋麻滴鼻液组、空白壳聚糖微乳凝胶组和SPV-CTMH组均观察到致密、饱满且排列整齐的纤毛刷状缘结构，未见明显的组织水肿、细胞变性坏死或纤毛剥脱现象，提示SPV、壳聚糖微乳凝胶辅料及SPV-CTMH对鼻纤毛运动影响较小，安全性良好，适用于鼻腔给药。见图2。

3.3.2 鼻黏膜刺激性考察结果

在体质量方面，各组大鼠在给药前3 d大鼠体质量出现轻微波动，归因于动物对初期固定与滴鼻操作的生理应激反应；随后各给药组体质量均恢复稳定增长，且SPV-CTMH组的总体生长曲线与生理盐水组高度重合，表明该递药系统无明显全身系统性毒性。在局部刺激性行为学评价方面，与生理盐水组比较，1%脱氧胆酸钠溶液组挠鼻和打喷嚏频次总和显著增加（P＜0.05）；与1%脱氧胆酸钠溶液组比较，SPV-CTMH组挠鼻频次和打喷嚏频次总和显著下降（P＜0.05），且与生理盐水组和呋麻滴鼻液组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。综合第7天鼻黏膜组织病理学检查进一步确证：1%脱氧胆酸钠溶液组黏膜结构遭受严重破坏，表现为纤毛脱落、黏膜增厚及大量炎性细胞浸润；SPV-CTMH组鼻黏膜形态与生理盐水组、呋麻滴鼻液组和空白壳聚糖微乳凝胶组一致，表现为上皮结构致密完整，纤毛形态与排列正常，黏膜下固有层无充血、水肿及炎性细胞浸润。上述结果表明，SPV-CTMH对鼻黏膜无局部刺激性与组织破坏性，安全性良好。见图3～4和表6。

3.4 药效学考察结果

与空白组比较，随着给药浓度增加，SPV溶液组与SPV-CTMH对U251细胞增殖的抑制作用均增强（P＜0.05），且呈现浓度依赖性，见图5。SPV溶液组、SPV-CTMH组作用于U251细胞72 h时的IC₅₀分别为（3.04±0.21）μmol/L和（3.03±0.19）μmol/L，此时SPV溶液与SPV-CTMH对U251的抑制率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

4 讨　论

经稳定性考察结果证实，SPV-CTMH在高温和强光条件下性质较为稳定，且在温度（25±2）℃、相对湿度（60±5）%条件下，该递药系统可较长时间保持稳定。

药物经鼻黏膜渗透吸收主要包括释放和渗透（膜转运）2个过程。因此，本研究取半透膜作为扩散屏障探讨SPV-CTMH的体外释放能力。体外释放结果显示，相较于无载体约束、呈自由快速释放的SPV溶液，SPV-CTMH表现出显著且平稳的缓释特征。其机制在于：壳聚糖微乳凝胶是一种将微乳均匀分散并固定于三维凝胶网状结构中的新型给药载体，载有SPV的微乳液滴经物理包裹于凝胶基质内，使SPV-CTMH兼具微乳的载药性能与凝胶的滞留性。药物先由微乳内相扩散至外相，继而通过凝胶网状结构缓慢释放，从而实现药物释放速率的延缓与作用时间的延长^［20］。此外，该凝胶体系的体外释放符合Higuchi方程，从数理逻辑上说明药物释放为骨架溶蚀与药物扩散的协同作用，从而实现平稳、持久且可控的缓释给药行为^{［16，21］}。

本研究采用鼻腔给药方式，目的是通过“鼻-脑”通路促进药物绕过BBB直达脑胶质瘤病灶。然而，鼻腔存在纤毛摆动的清除功能，不仅是药物吸收的屏障，更是易受损的组织。2020年版《中华人民共和国药典：四部》通则0106鼻用制剂中规定：“鼻用制剂应尽可能无刺激性，并不可影响鼻黏膜和鼻纤毛的功能”^［17］8。因而，本研究在选择辅料时尤其关注鼻腔用药安全性。鉴于此，在评价SPV-CTMH安全性时采取了多种考察策略。在功能学评价层面，本研究采用活体蟾蜍上颚模型，并严格遵循国际纤毛毒性评价规范的评价逻辑：即以生理盐水作为绝对安全的空白基线，引入临床广泛应用的呋麻滴鼻液作为市售参比制剂，该制剂无明显纤毛毒性^［22］，以此确立具有临床转化价值的安全阈值标准^［23］。考察结果显示，SPV-CTMH组的PVD虽较生理盐水组出现正常范围内的轻微降低，但与市售参比制剂相比差异无统计学意义。在形态学与病理学层面，通过观察给药后大鼠鼻黏膜组织结构和表面纤毛形态的改变评价鼻黏膜刺激性，黏膜切片结果发现，1%脱氧胆酸钠溶液组对大鼠鼻黏膜刺激性较大，造成严重的结构破坏，空白壳聚糖微乳凝胶组和SPV-CTMH组大鼠鼻黏膜上皮完整，纤毛排列致密，基本无组织学刺激性。综合在体蟾蜍上颚纤毛毒性试验及在体大鼠鼻黏膜刺激性试验结果，SPV-CTMH在确保有效载药的同时，表现出良好的鼻黏膜相容性。壳聚糖作为天然多糖载体，兼具生物黏附性和生物相容性^［24］，可在延长药物滞留时间的同时避免对纤毛的机械或化学损伤。与1%脱氧胆酸钠溶液组比较，SPV在微乳凝胶体系中亦未表现出额外的纤毛毒性。上述结果表明，SPV-CTMH对鼻黏膜毒性小，安全性良好，可应用于鼻腔。

为验证SPV制成SPV-CTMH后是否对人神经胶质瘤具有抑制作用，研究采用MTT法测定SPV-CTMH对U251细胞的相对细胞毒性，比较游离SPV溶液与SPV-CTMH抑制U251细胞的增殖作用。研究结果发现，SPV-CTMH仍具有抑制U251细胞作用，且与游离SPV溶液相比，差异无统计学意义。尽管游离SPV溶液具有显著的神经胶质瘤抑制作用，但其BBB穿透率低，导致脑内药物浓度无法达到治疗阈值，极大限制了其临床应用。为解决这一科学问题，本研究成功构建的SPV-CTMH不仅具备优良的理化稳定性与高度的鼻腔生理安全性，更展现出理想的缓释特征。本课题组前期研究显示，SPV-CTMH能提高SPV在鼻黏膜的滞留时间和渗透量^［16］，该特性能增加药物与嗅上皮细胞的接触机会，从而促进SPV通过嗅神经通路直接转运入脑。需要强调的是，SPV-CTMH的微乳结构屏障与温敏凝胶基质阻滞协同作用导致体外释放缓慢，但在MTT实验中SPV-CTMH与游离SPV溶液对U251的细胞毒性差异无统计学意义，考虑是由于将SPV制成微乳温敏凝胶后其溶解度提升^［15］，同时壳聚糖作为天然阳离子多糖，可通过静电作用与带负电的细胞膜结合，促进药物的内吞摄取^［24］。综上，SPV-CTMH在提升药物溶解度和细胞摄取能力的同时，弥补了缓释带来的释放速率不足的问题，最终达到与游离SPV溶液相当的细胞毒性效果。结合体外细胞实验中SPV-CTMH可保留SPV显著的抗神经胶质瘤活性，提示SPV-CTMH相较于传统制剂更能高效发挥抗胶质瘤的治疗效果。

综上所述，SPV-CTMH为SPV的鼻用制剂开发提供了设计思路，同时为神经胶质瘤的无创靶向治疗提供了新的候选方案，但仍存在一定局限性：① 体外释放实验采用半透膜为扩散屏障，未能完全模拟鼻腔复杂的生理环境，体内释放行为有待进一步验证；② 本研究仅通过MTT法评价了制剂对U251细胞的增殖抑制作用，尚未深入探讨其诱导细胞凋亡的具体机制及体内抗胶质瘤疗效。后续研究可通过建立原位脑胶质瘤动物模型评价SPV-CTMH的体内抑瘤效果，并结合药代动力学及分子生物学手段深入阐明其“鼻-脑”转运机制与抗肿瘤作用机制，为临床转化提供更充分的实验依据。

参考文献

[1] WANG L M， ENGLANDER Z K， MILLER M L，et al. Malignant glioma ［M］//Human Brain and Spinal Cord Tumors：From Bench to Bedside. Volume 2. Cham：Springer International Publishing，2023：1-30.

[2] 陈雯琳，王月坤，刘千舒，等. 2022年度我国脑胶质瘤领域研究进展［J］. 协和医学杂志，2023，14（5）：983-990.

[3] 中国抗癌协会脑胶质瘤专业委员会. 中国抗癌协会脑胶质瘤整合诊治指南（精简版）［J］. 中国肿瘤临床，2022，49（16）：811-818.

[4] KIM J， ZHU Y， CHEN S H，et al. Anti-glioma effect of ginseng-derived exosomes-like nanoparticles by active blood-brain-barrier penetration and tumor microenvironment modulation ［J］. J Nanobiotechnology，2023，21（1）：253.

[5] WU D D， CHEN X H， ZHOU S Q，et al. Reactive oxidative species （ROS） -based nanomedicine for BBB crossing and glioma treatment：current status and future directions ［J］. Front Immunol，2023，14：1241791.

[6] FARSHBAF M， MOJARAD-JABALI S， HEMMATI S，et al. Enhanced BBB and BBTB penetration and improved anti-glioma behavior of Bortezomib through dual-targeting nanostructured lipid carriers ［J］. J Control Release，2022，345：371-384.

[7] 李高攀，王文义，任丽，等. 常绿钩吻碱抑制人神经胶质瘤U251细胞增殖的体内外作用特征［J］. 药学学报，2021，56（3）：786-792.

[8] PASTOR Y， TING I， MARTÍNEZ A L，et al. Intranasal delivery system of bacterial antigen using thermosensitive hydrogels based on a Pluronic-Gantrez conjugate ［J］. Int J Pharm，2020，579：119154.

[9] AGRAWAL M， SARAF S， SARAF S，et al. Stimuli-responsive in situ gelling system for nose-to-brain drug delivery ［J］. J Control Release，2020，327：235-265.

[10] 李紫红，姚力豪，阮慧妮，等. 中药口服自微乳释药系统的研究进展与挑战［J］. 中成药，2025，47（12）：4092-4098.

[11] 夏天翊，陈甜甜，索敬远，等. 氯诺昔康纳米粒温敏凝胶的质量评价和细胞学研究［J］. 滨州医学院学报，2024，47（6）：433-439.

[12] PHAN H， COSSUTTA M， HOUPPE C，et al. Polymerization-Induced Self-Assembly （PISA） for in situ drug encapsulation or drug conjugation in cancer application ［J］. J Colloid Interface Sci，2022，618：173-184.

[13] 朱瑞凯，杨开典，赵凯. 壳聚糖基材料应用于口腔黏膜给药系统的研究进展［J］. 药学学报，2024，59（12）：3232-3241.

[14] 杨水艳，盛扬，孙一新，等. 基于丙烯酸-N-琥珀酰亚胺酯共聚物交联剂的壳聚糖水凝胶的生物相容性研究［J］. 材料导报，2024，38（12）：238-247.

[15] 蒋文文，宋煜，许文，等. 常绿钩吻碱微乳处方优化及其安全性评价［J］. 中成药，2023，45（10）：3187-3193.

[16] 宋煜，蒋文文，林欣欣，等. 常绿钩吻碱壳聚糖微乳温敏凝胶的制备及质量评价［J］. 中国医院药学杂志，2024，44（17）：2015-2020.

[17] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典：四部［M］. 北京：中国医药科技出版社，2020.

[18] 张水杰，童晓云，曾媛，等. 马来酸阿塞那平微乳凝胶剂的制备及经鼻入脑的靶向性研究［J］. 中国药师，2024，27（2）：199-208.

[19] 李依寒，俞晨杰，钱晓云，等. 鼻周期不同时相下鼻腔功能的相关性研究［J］. 中国中西医结合耳鼻咽喉科杂志，2020，28（5）：383-385，354.

[20] 郝欣岩，张远冬，侯盈盈，等. 壳聚糖修饰的纳米乳用于鼻腔疫苗递送的研究［J］. 四川大学学报（医学版），2021，52（4）：592-597.

[21] 李桂凤，仲婷婷. 苯甲酸利扎曲普坦原位凝胶鼻喷剂的制备［J］. 中国医院药学杂志，2019，39（7）：686-690.

[22] CHU K D， CHEN L D， XU W，et al. Preparation of a paeonol-containing temperature-sensitive in situ gel and its preliminary efficacy on allergic rhinitis ［J］. Int J Mol Sci，2013，14（3）：6499-6515.

[23] 谢伟容. 黄连解毒鼻用温敏凝胶对蟾蜍上颚黏膜纤毛毒性作用的研究［J］. 江西中医药大学学报，2019，31（2）：85-87.

[24] AIBANI N，RAI R， PATEL P，et al. Chitosan nanoparticles at the biological interface：implications for drug delivery ［J］. Pharmaceutics，2021，13（10）：1686.

基金资助

福建省科技厅高校产学合作项目(2024Y4010)