有氧跑台运动调控外泌体miRNA改善APP/PS1小鼠学习记忆能力的机制研究

摘要

目的 观察有氧跑台运动对淀粉样前体蛋白/早老素1（APP/PS1）双转基因小鼠学习记忆能力及外泌体miRNA表达谱的影响，探讨有氧运动调控外泌体miRNA改善学习记忆的可能作用机制。 方法 将16只4月龄APP/PS1雄性小鼠按照随机数字表法分为模型组和运动组各8只，另外取8只同月龄野生型C57BL/6雄性小鼠为野生组。运动组进行为期13周的有氧跑台运动。适应期1周：第1～2天速度为5 m/min，第3～4天速度为8 m/min，第5～6天速度为12 m/min，每天运动15 min，第7天休息。训练期12周：每天45 min，0～5 min速度为5 m/min，6～10 min速度为8 m/min，11～40 min速度为12 m/min，41～45 min速度为5 m/min，每周5次，跑台坡度为0°。模型组和野生组于同一时间在静止不动的跑台上自由活动。干预前后采用新物体识别实验评估学习记忆能力，并对海马组织外泌体进行miRNA测序，筛选差异外泌体miRNA及其靶基因，并对其靶基因进行基因本体（GO）功能及京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。 结果 ① 行为学结果显示，干预前模型组与运动组1 h和24 h新物体识别率均低于野生组（P＜0.05），但运动组与模型组上述指标比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。干预后运动组1 h和24 h的新物体识别率均高于模型组（P＜0.05），且运动组1 h和24 h新物体识别率均较干预前显著升高（P＜0.05）。② 外泌体miRNA测序结果显示，模型组对比野生组得到34个差异表达miRNA（上调20个、下调14个）；运动组对比模型组得到23个差异表达miRNA（上调14个、下调9个）。取上述2个部分的差异表达miRNA进行交集分析得到miR-5119，其在模型组下调、运动后上调。后续基于2组差异miRNA的靶基因完成GO功能和KEGG通路富集分析。GO功能富集分析结果显示，模型组与野生组差异表达外泌体miRNA预测靶基因在BP层面主要富集于MAPK活性的激活、神经元凋亡过程等；在CC层面显著定位在突触、神经元树突棘、突触前活性区膜以及细胞骨架等结构；在MF层面主要涉及泛素样蛋白连接酶结合、离子通道结合、电压门控钾离子通道活性，以及谷氨酸受体活性等功能。KEGG通路富集分析结果显示，模型组与野生组差异表达外泌体miRNA预测靶基因显著富集于8条通路，主要包括谷氨酸能突触、硫胺素代谢、MAPK信号通路、癌症通路等。运动组与模型组差异表达外泌体miRNA预测靶基因的GO功能富集分析结果显示，在BP层面显著富集于谷氨酸能突触传递的正调控、长时程突触增强的调控、突触可塑性的调控等；在CC层面主要位于线粒体膜间隙、细胞骨架等结构；在MF层面则富集于肌动蛋白依赖性ATP酶活性、离子型谷氨酸受体结合以及磷酸酶结合等功能。KEGG通路富集分析结果显示，运动组与模型组差异表达外泌体miRNA预测靶基因也显著富集于8条通路，主要包括肌醇磷酸代谢、肌动蛋白细胞骨架的调控、错配修复、醚脂代谢、果糖和甘露糖代谢等。 结论 有氧跑台运动可有效改善APP/PS1小鼠的学习记忆能力，其机制可能与调控外泌体miRNA表达谱，尤其是上调miR-5119有关。生物信息学分析提示，运动干预主要影响突触可塑性与线粒体功能相关通路，本研究为后续深入探讨miR-5119在运动改善AD中的分子机制提供了新的研究线索与候选靶点。

Graphical abstract

关键词

阿尔茨海默病 / 有氧运动 / 外泌体miRNA

阿尔茨海默病（Alzheimer Disease，AD）是一种与年龄相关的中枢神经系统退行性疾病，临床主要表现为进行性记忆与认知功能损害^［1-2］，最终可导致患者独立生活能力丧失。AD在中医学中属“健忘”“呆病”等范畴，其发生、发展常与“髓海空虚”有关^［3］，阳气亏虚是重要病机之一^［4］。阳气为气血运行之动力，阳气不足则无力推动气血上荣于脑，致使脑失所养，神机失用，最终影响神志清明^［4］。有氧运动外动形体、内畅气机，有“动而生阳”、温煦升发之效，契合AD“阳虚髓空”病机的干预思路，因此被认为是延缓认知功能衰退的有效非药物疗法^［4-6］。然而，运动所产生的全身性调节效应如何转化为脑内神经保护作用，其关键分子介质及具体调控机制仍有待进一步阐明。

外泌体（exosomes，EXs）是细胞释放的纳米级细胞外囊泡，近年来被认为是神经系统中介导细胞间通信的关键角色^［7］。外泌体可携带包括miRNA在内的多种功能性分子，并将其递送至受体细胞，从而参与远程调控基因表达^［8-9］。既往研究表明，外泌体miRNA在AD等神经退行性疾病中会发生动态改变，具有作为潜在生物标志物的研究价值^［10］。此外，有氧运动作为一种系统性干预方式，已被证明能调控外泌体及其miRNA组成^［11-12］。鉴于此，有氧运动是否通过调控脑内外泌体miRNA参与AD相关病理进程及认知功能改善，仍是值得进一步探讨的科学问题。淀粉样前体蛋白/早老素1（amyloid precursor protein/presenilin 1，APP/PS1）双转基因小鼠是国际上公认研究AD较为理想和经典的模型动物。鉴于3月龄APP/PS1小鼠脑内即开始出现Aβ沉积，6月龄左右行为学可观察到明显的认知功能障碍^［13］，故本研究选取4月龄APP/PS1转基因小鼠作为实验对象，观察有氧跑台运动对该模型小鼠学习记忆能力的影响，并通过生物信息学分析脑内外泌体miRNA的差异表达，以揭示其作为潜在生物标志物的价值及背后的关键神经保护机制，从而为运动干预AD提供实验依据。

1 实验材料

1.1 实验动物与分组

本研究共纳入4月龄雄性小鼠24只，其中16只APP/PS1转基因雄性小鼠［初始体质量（26.09±1.02）g］，采用随机数字表法分为运动组和模型组，每组8只；另取8只同月龄野生型C57BL/6雄性小鼠作为野生组［初始体质量（27.45±1.15）g］。实验动物均购于上海菲诺克生物科技有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2023-0008，饲养于福建中医药大学动物实验中心，实验动物使用许可证号：SYXK（闽）2023-0004，所有动物适应性喂养1周，期间自由摄食饮水，给予标准普通维持饲料。饲养环境温度22 ℃，相对湿度50％～70％，昼夜周期12 h/12 h。本方案经过福建中医药大学实验动物伦理委员会批准（审批号：FJTCMIACUC 2024207）。

1.2　实验试剂　PBS［生工生物工程上海（股份）有限公司，货号：E607008］；0.45 μm过滤膜（广州洁特生物过滤股份有限公司，货号：FPV403030）；Ⅱ型胶原酶（美国Sigma公司，货号：C9407）；FITC标记抗小鼠CD9抗体（货号：124807）、FITC标记抗小鼠CD63抗体（货号：143919）均购自美国Biolegend公司；［CD81 Monoclonal Antibody （Eat2），FITC］（美国Invitrogen公司，货号：MA5-17939）

1.3 实验仪器

小动物跑台（型号：XR-PT-10B）和新物体识别测试系统（型号：XR-XX117）均购于上海欣软信息科技公司；小型冷冻离心机（美国Beckman公司，型号：Allegra X-30R）；超速离心机（型号：CP100MX）和透射电镜（型号：HT-7700）均购于日本Hitachi公司；粒径分析仪（福建厦门NanoFCM公司，型号：N30E）。

2 实验方法

2.1 干预方案

有氧运动方案参考文献［14］制定。采用连续13周跑台运动干预。为减少昼夜节律对结果的影响，每日固定于下午3点开始训练。跑台训练分为适应期和训练期。适应期1周：第1～2天速度为5 m/min，第3～4天速度为8 m/min，第5～6天速度为12 m/min，每天运动15 min，第7天休息。训练期12周：0～5 min速度为5 m/min，6～10 min速度为8 m/min，11～40 min速度为12 m/min，41～45 min速度为5 m/min，每天45 min，每周5次，跑台坡度为0°。模型组和野生组于同一时间在静止不动的跑台上自由活动。

2.2 行为学评估

参照文献［15］采用新物体识别实验评估小鼠干预前后学习记忆能力。实验在规格为40 cm×40 cm×50 cm的白色无盖木箱中进行，测试时间集中在上午9—12点，测试期间保持环境安静，每只小鼠测试后用75%乙醇擦拭以消除气味残留。刺激物为3个实心物体，包括一对相同物体A1、A2及一个外形相异的新物体B。实验严格遵循适应、学习与测试3个阶段流程：适应阶段，小鼠于空箱内自由探索5 min；学习阶段，小鼠同时接触并探索相同物体A1和A2，共10 min；测试阶段分别于学习阶段结束后1 h（短期记忆）和24 h（长期记忆）进行，将A2置换为新物体B，记录小鼠在5 min测试期内对旧物体A1与新物体B的探索时间，从而评价其记忆功能。

新物体识别率＝新物体头部探究时间/（新物体头部探究时间＋旧物体头部探究时间）×100%

2.3 取材

组织样本采集在运动干预与行为评估结束24 h后进行。取材前所有小鼠禁食12 h，自由饮水。随后，小鼠经异氟烷麻醉后处死，迅速取出全脑，在冰盘上分离海马脑组织，并去除小脑和下丘脑等其余部分，置于液氮中快速冷冻后，转移至-80 ℃超低温冰箱中保存，所得海马脑组织用于外泌体miRNA测序。

2.4 外泌体分离与鉴定

取海马脑组织经37 ℃解冻，经PBS清洗后，用眼科剪将组织样本剪成约1 mm×1 mm×1 mm大小的组织碎片，继而用特定酶解液于37 ℃下以70 r/min震荡消化2～3 h至细胞悬液呈乳浊状，加入含10%无外泌体血清（exosome-depleted FBS）的DMEM培养基终止消化。消化液经4 ℃下2 000×g离心5 min后收集上清。外泌体分离采用超速离心法，将上述上清依次经2 000×g离心30 min、10 000×g离心45 min及0.45 μm滤膜过滤后，对滤液进行超速离心（100 000×g，4 ℃，70 min）以沉淀外泌体。弃上清后，以预冷PBS重悬沉淀，再次于相同条件下超速离心以洗涤外泌体。然后加入PBS重悬沉淀，获得海马组织来源外泌体。除组织消化步骤外，其余离心、过滤和重悬操作均在4 ℃条件下进行。外泌体鉴定分析包括透射电镜观察形态、粒径分析检测粒径分布，并通过荧光标记检测CD9、CD63、CD81等外泌体表面标志物表达。以上三者结合（电镜形态＋粒径范围＋标志物阳性）即可鉴定所提取的囊泡为外泌体。

2.5 外泌体RNA提取、文库构建和测序

取各组外泌体样本，每组6只小鼠，每2只小鼠的外泌体合并为1个样本，每组3个生物学重复。采用QIAGEN miRNeasy试剂盒提取外泌体总RNA。RNA样品质量采用多平台联合检测：使用超微量紫外-可见光分光光度计（NanoDrop™ OneC）检测RNA纯度，使用生物大分子分析仪（LabChip^® GX Touch）分析RNA完整性，并使用荧光计（Qubit™ 3.0）及miRNA检测试剂盒测定RNA浓度。经检测，miRNA总量≥10 ng，浓度≥2 ng/μL，A₂₆₀/A₂₈₀≥1.0，符合建库要求。符合建库标准的样品，按QIAseq miRNA建库试剂盒说明书构建miRNA文库，经PCR扩增、AMPure XP磁珠纯化后获得测序文库。文库质控合格后，于NovaSeq X Plus平台进行PE150测序。测序数据质控标准：原始测序数据使用fastp软件进行过滤，去除含接头、低质量（Q＜20）及长度过短的读段。过滤后的清洁读段（clean reads）要求碱基质量Q30占比≥85%，GC含量分布稳定且无明显偏差，读段长度分布峰值集中于21～23 nt，符合成熟miRNA的典型长度特征。

2.6 外泌体miRNA差异表达分析

为探究有氧运动对APP/PS1小鼠海马脑组织外泌体miRNA表达谱的影响，本研究进行了2组独立的差异表达分析。首先，比较了模型组与野生组，以鉴定由AD疾病本身引起的外泌体miRNA紊乱。其次比较了运动组与模型组，以识别可被有氧运动调控与改善的特定外泌体miRNA。上述均以log₂ (fold change)＞1.5，且P＜0.05作为显著性阈值。

2.7 差异外泌体miRNA靶基因GO功能和KEGG通路富集分析

对所有差异表达的外泌体miRNA进行靶基因预测。采用RNAhybrid（2.1.2版本）和miRanda（3.3a版本）软件预测差异表达miRNA的靶基因。基于小鼠NCBI RefSeq数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/）中的mRNA 3'UTR序列为参考进行基因预测。筛选阈值：RNAhybrid预测结合自由能≤-20 kcal/mol，且P＜0.05，miRanda预测结合自由能≤-20 kcal/mol，且得分≥140。为提高预测结果的稳健性，取2款软件预测结果的交集作为候选靶基因集合。随后，采用R软件中的clusterProfiler包对候选靶基因进行基因本体（GO）功能及京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，GO分析包括生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）3个层面，KEGG分析以小鼠为物种背景。富集结果以P值＜0.05作为显著富集标准。

2.8 统计学方法

采用SPSS 27.0软件分析行为学数据。符合正态分布的计量资料以（\overline{x}±s）表示，组内干预前后比较采用配对样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t，方差不齐时采用Games Howell法；非正态分布的计量资料以M（P₂₅，P₇₅）表示，组内干预前后比较采用Wilcoxon符号秩检验，多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验，组间两两比较采用Dunn-Bonferroni法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结　果

3.1 3组新物体识别率比较

见表1。

3.2 外泌体鉴定结果

透射电镜结果显示，所分离颗粒呈茶托样膜性囊泡结构，边界较清晰，见图1。粒径检测结果显示，颗粒粒径主要分布于50～150 nm，见图2。荧光标记检验结果显示，CD9、CD63和CD81阳性事件比例分别为4.2%、6.9%、11.7%，均高于空白对照的1.5%，提示分离颗粒可检测到外泌体相关表面标志物表达，见图3。综合透射电镜表征、粒径分布及表面标志物检测结果，提示本研究分离所得颗粒具有小细胞外囊泡（外泌体）的基本特征。

3.3 外泌体miRNA测序数据质控

各样本过滤后获得的清洁读段在6 000～8 000万条，有效数据率介于90.5%～93.2%。各样本Q30及以上碱基比例均≥88%，GC含量分布稳定，碱基质量分布未见明显异常。长度分布分析显示，清洁读段长度峰值集中于21～23 nt，与成熟miRNA的典型长度范围一致，符合miRNA文库的片段分布特征。上述结果提示，本研究外泌体miRNA测序数据质量较好，可用于后续差异表达分析及功能预测。

3.4 APP/PS1模型相关差异表达外泌体miRNA

与野生组比较，模型组小鼠的海马脑组织外泌体中共筛选出34个显著差异表达miRNA，其中，20个miRNA表达上调，14个miRNA表达下调，提示这些差异miRNA可能与AD病理进程相关。见表2。

3.5 有氧运动干预相关的差异表达外泌体miRNA

与模型组比较，运动组小鼠的海马脑组织外泌体中共筛选出23个差异表达miRNA，其中14个miRNA表达上调，9个miRNA表达下调，提示有氧运动干预可影响APP/PS1小鼠海马组织外泌体miRNA表达谱。见表3。

为进一步筛选可能参与有氧运动改善APP/PS1小鼠AD病理状态的候选miRNA，本研究将APP/PS1模型相关差异miRNA与有氧运动干预相关差异miRNA进行交集分析。结果显示，仅miR-5119同时存在于2组比较的差异miRNA集合中。见图4。

3.6 差异表达外泌体miRNA靶基因的功能富集分析

为探究外泌体miRNA在APP/PS1模型中和有氧运动干预中的作用，分别提取“模型组vs野生组”的34个差异miRNA（20个上调、14个下调）和“运动组vs模型组”的23个差异miRNA（14个上调、9个下调），并对这2组miRNA所预测的靶基因分别进行GO功能和KEGG通路富集分析。

3.6.1 APP/PS1模型相关差异表达外泌体miRNA预测靶基因功能分析

3.6.1.1 GO功能富集分析

结果显示，模型组与野生组差异表达外泌体miRNA预测靶基因在BP层面主要富集于MAPK活性的激活、神经元凋亡过程等；在CC层面显著定位在突触、神经元树突棘、突触前活性区膜以及细胞骨架等结构；在MF层面主要涉及泛素样蛋白连接酶结合、离子通道结合、电压门控钾离子通道活性以及谷氨酸受体活性等功能。见图5。

3.6.1.2 KEGG通路富集分析

结果显示，模型组与野生组差异表达外泌体miRNA预测靶基因显著富集于8条通路，主要包括谷氨酸能突触、硫胺素代谢、MAPK信号通路、癌症通路等。见图6。

3.6.2 有氧运动干预相关差异表达外泌体miRNA预测靶基因功能分析

3.6.2.1 GO功能富集分析

结果显示，运动组与模型组差异表达外泌体miRNA预测靶基因在BP层面显著富集于谷氨酸能突触传递的正调控、长时程突触增强的调控、突触可塑性的调控等过程；在CC层面主要位于线粒体膜间隙、细胞骨架等结构；在MF层面则富集于肌动蛋白依赖性ATP酶活性、离子型谷氨酸受体结合以及磷酸酶结合等功能。见图7。

3.6.2.2 KEGG通路富集分析

结果显示，运动组与模型组差异表达外泌体miRNA预测靶基因显著富集于8条通路，主要包括肌醇磷酸代谢、肌动蛋白细胞骨架的调控、错配修复、醚脂代谢、果糖和甘露糖代谢等。见图8。

［4］ 王冰. 黄帝内经素问［M］. 校注本. 北京：人民卫生出版社，1963：518.

［5］ 李湛，贾春华. “痰生百病”的隐喻分析［J］. 中医杂志，2022，63（8）：701-705.

［6］ 严用和. 济生方［M］. 影印本. 北京：人民卫生出版社，1956：76.

4 讨　论

中医学认为，脑为“髓海”，其功能有赖于阳气的温煦与推动。如《灵枢·海论》言：“髓海有余，则轻劲多力；髓海不足，则脑转耳鸣，胫酸眩冒。”^［16］本团队前期研究曾系统阐述“从阳论治”AD的学术思想，指出AD的核心病机可概括为“阳气亏虚，髓海空虚”，阳气不足既不能上奉于脑以滋养“髓海”，也无法抵御痰浊、瘀血等病理产物的侵袭，最终导致神机失用、认知衰退^［4］。基于此理论框架，提出“动而生阳”的康复策略，即通过主动运动促使阳气生发，达到“益气温阳、填精充髓”之效。

本研究新物体识别实验证实，APP/PS1小鼠存在显著学习记忆障碍。有氧运动干预后，运动组识别率显著高于模型组，验证了“动而生阳以益脑”理论的可靠性。而运动产生的宏观效应通过何种微观载体上达于脑尚未可知，有研究表明，外泌体可跨越血脑屏障，其携带的miRNA与神经退行性疾病密切相关^［10］，并且有氧运动可调控外泌体及其miRNA表达^［11-12］。为此，本研究比较了野生组、模型组和运动组的外泌体miRNA谱。结果发现：与野生组相比，模型组20个miRNA上调、14个下调。与模型组相比，运动组14个上调、9个下调。取APP/PS1模型相关差异miRNA与有氧运动干预相关差异miRNA进行交集分析，获得唯一miRNA：miR-5119，提示其可能是运动改善AD的关键效应分子。

尽管miR-5119在AD中的直接功能未见报道，但近期不同疾病模型证据表明，该分子兼具调控免疫稳态与炎症信号的双重功能。一方面，程序性死亡受体-配体1（PD-L1）是维持免疫稳态的关键检查点。2项研究明确了miR-5119对PD-L1的靶向调控：ZHANG等^［17］发现PD-L1是miR-5119潜在靶基因；YANG等^［18］证明miR-5119可靶向抑制PD-L1缓解结肠炎。与此同时，c-Jun（AP-1转录因子核心组分）与NF-κB（核因子κB）是炎症应答核心转录因子。LIU等^［19］在非酒精性脂肪性肝炎中发现miR-5119抑制NF-κB和c-Jun信号通路。

值得注意的是，PD-L1与NF-κB/c-Jun均与AD病理密切相关^［20-23］。研究证明，PD-L1免疫检查点阻断可清除脑内Aβ斑块并改善认知^［21］。NF-κB持续激活驱动小胶质细胞促炎极化^［22］，JNK/c-Jun通路过度活化与Aβ诱导突触损伤及神经元凋亡相关^［23］。结合本研究中miR-5119在模型组下调、运动组上调的动态变化，可以推测，AD病理状态下外泌体miR-5119减少，可能同时改变PD-L1表达与NF-κB/c-Jun炎症轴激活状态，协同加剧神经炎症失衡。有氧运动可能通过分泌富含miR-5119的外泌体，一方面抑制NF-κB/c-Jun炎症轴，另一方面下调PD-L1以解除免疫抑制，从而协同重塑中枢免疫微环境，改善认知功能。此外，本研究中差异表达的miR-19b-3p和miR-539-5p均与AD病理相关。模型组下调的miR-19b-3p可靶向BACE1参与Aβ沉积^［24］，运动组上调的miR-539-5p抑制GSK-3β减轻tau蛋白磷酸化^［25］。这些变化与既往报道一致。

生物信息学分析显示，与野生组相比，模型组在生物学过程中富集于神经元凋亡过程、MAPK活性的激活等，细胞组分富集突触、神经元树突棘、细胞骨架等神经元相关结构的改变，分子功能富集于谷氨酸受体活性、电压门控钾离子通道活性等。KEGG通路富集于MAPK信号通路、谷氨酸能突触，与AD中兴奋性毒性及炎症协同损伤相关^［26-27］。

运动组与模型组比较，在生物学过程中富集于AMPA受体活性的正调控、突触可塑性及长时程突触增强的调控，细胞组分富集细胞骨架、线粒体膜间隙，分子功能富集肌动蛋白依赖性ATP酶活性、离子型谷氨酸受体结合等。KEGG通路富集于肌动蛋白细胞骨架调控通路，提示运动通过维持细胞骨架与线粒体功能发挥保护作用^［28-30］。

本研究表明，有氧运动可有效改善APP/PS1小鼠的学习记忆能力，外泌体miRNA测序首次筛选出miR-5119作为关键候选分子。基于生物信息学预测的生信分析显示，AD病理主要涉及突触结构损伤及谷氨酸受体功能异常，而运动干预则显著富集于突触可塑性与线粒体功能相关通路。结合文献报道，可推测miR-5119可能通过调控PD-L1/NF-κB/c-Jun轴参与运动重塑AD神经免疫微环境，但此推测尚需实验验证。本研究局限性在于：miR-5119靶基因尚未通过分子实验直接验证，且海马组织外泌体来源的细胞类型尚不明确。后续研究将聚焦：① 采用双荧光素酶报告基因验证miR-5119与下游靶基因的直接结合，结合Western blot明确蛋白表达变化，并进一步通过小胶质细胞-神经元共培养体系及通路特异性抑制剂，解析miR-5119介导的信号轴调控神经炎症的机制；② 利用细胞特异性表面标志物分离不同海马细胞亚群来源的外泌体，明确miR-5119功能性外泌体的关键来源细胞，以期为运动干预神经退行性疾病提供更深入的实验依据。

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基金资助

福建省自然科学基金项目(2022J01377)