基于COX-2/mPGES-1/PGE2信号通路探讨转化丸治疗大鼠腹膜纤维化的作用机制

摘要

目的 基于环氧合酶-2（COX-2）/微粒体前列腺素E合酶-1（mPGES-1）/前列腺素E2（PGE2）信号通路探索转化丸治疗大鼠腹膜纤维化（PF）的作用机制。 方法 将65只SD雄性大鼠按随机数字表法分为对照组、模型组和转化丸低、中、高剂量组各13只。除对照组外，其余各组大鼠予腹腔注射4.25%腹膜透析液100 mL/（kg·d），连续注射8周建立PF模型。随机选取对照组和造模组大鼠摘取腹膜组织，肉眼观察模型组大鼠腹膜颜色较对照组明显浑浊，且病理结果显示腹膜发生增厚，间皮细胞出现损伤、破坏，最终每组各纳入12只大鼠。造模成功后，各给药组灌胃给药，低剂量组给予5.31 g/kg灌胃，中剂量组给予10.62 g/kg灌胃，高剂量组给予21.24 g/kg灌胃，对照组和模型组灌胃等量生理盐水，1次/d，各组均连续干预4周后检测大鼠腹膜超滤量、葡萄糖转运量；取出腹膜组织，进行HE、Masson染色观察并测量腹膜厚度；RT-PCR和Western blot分别检测腹膜组织中COX-2、mPGES-1、前列腺素E2（PGE2） mRNA转录水平和蛋白相对表达量；用透射电镜观察分析腹膜组织超微结构的变化。 结果 与对照组比较，模型组腹膜超滤量明显降低（P＜0.05），葡萄糖转运量、腹膜厚度及腹膜组织中COX-2、mPGES-1和PGE2的 mRNA转录水平和蛋白相对表达量均明显升高（P＜0.05），此外，模型组腹膜间皮细胞脱落、不连续，胶原纤维增生沉积，炎细胞大面积浸润。与模型组比较，低、中、高剂量组腹膜超滤量明显升高（P＜0.05），葡萄糖转运量、腹膜厚度及腹膜组织中COX-2、mPGES-1、PGE2 mRNA和蛋白相对表达量均明显降低（P＜0.05），低、中、高剂量组腹膜形态结构较模型组有明显改善。透射电镜结果显示：对照组腹膜间皮细胞形态规则，结构完整，相邻细胞间及细胞与基质间紧密连接；模型组腹膜间皮细胞表面不平整，腹膜间皮细胞可以看到空泡样变性，并且胶原纤维排列不规则，低、中、高剂量组上述情况较对照组均有所改善。 结论 转化丸可改善腹膜纤维化大鼠的腹膜功能，其作用机制可能与抑制COX-2/mPGES-1/PGE2信号通路有关。

Graphical abstract

关键词

腹膜纤维化 / 转化丸 / 环氧合酶2 / 前列腺素E2 / 微粒体前列腺素E合酶-1

终末期肾病（end stage renal disease，ESRD）是慢性肾脏疾病的最终阶段，表现为肾功能严重丧失，无法满足机体的代谢需求，此时一般需进行透析或者肾移植治疗^［1］。腹膜透析（peritoneal dialysis，PD）是尿毒症患者重要的替代治疗方法^［2］。然而PD中使用的非生理性透析溶液，内含高浓度葡萄糖形成高渗透压、呈酸性pH，且大量液体反复灌注腹膜腔，多重因素共同促进腹膜纤维化（peritoneal fibrosis，PF）的发生与进展^［3］。越来越多的证据表明，炎症和纤维化反应在PD进展中起着重要作用，这2个过程之间的联系通常是双向的，彼此诱导^［4-5］。

中药在临床应用方面有着悠久历史，许多中药在长期临床应用中显示出有益可靠的治疗效果，在ESRD治疗方面越来越受到认可和关注^［6］。转化丸为福建省名中医魏仲南主任创立、用于改善PD患者PF病程的经验方^［7］，该方基于肾虚血瘀这一基本病机，由真武汤和升降散加减而成。有研究表明，转化丸在PD患者临床治疗中具有较好的效果，可减少腹透并发症发生率和延缓腹膜超滤功能下降^［8］。而转化丸对PD治疗中PF的作用机制尚不清楚，故本研究基于环氧合酶-2（COX-2）/微粒体前列腺素E合酶-1（mPGES-1）/前列腺素E2（PGE2）信号通路探讨转化丸对大鼠腹膜纤维化的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

65只SPF级SD雄性大鼠，体质量（190±10）g，购自斯贝福（苏州）生物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（苏）2022-0006。大鼠合格证编号：B202506060289。饲养于福建安布瑞生物科技有限公司实验动物中心，实验动物使用许可证：SYXK（闽）2022-0002。饲养条件为温度（23±3）℃，湿度（50±10）%，饮食自由。本实验已获福建安布瑞生物实验动物伦理委员会批准（审批号：IACUC FJABR2025021502）。

1.1.2 主要试剂

Masson三色染液试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号：G1340）；COX-2（货号：66351-1-lg）、PGE2（货号：66921-1-Ig）、GAPDH抗体（货号：60004-1-Ig）、COX-2抗体（货号：66351-1-Ig）、PGE2抗体（货号：66921-1-Ig）均购自武汉三鹰生物技术有限公司；mPGES-1抗体（武汉爱博泰克生物科技有限公司，货号：A18632）；蛋白酶抑制剂Cocktail（不含EDTA，100×DMSO储液，货号：MB2678）、0.25%胰蛋白酶-EDTA（货号：MA0233）、BCA蛋白定量试剂盒（货号：MA0082-2）均购自大连美仑生物技术有限公司。

1.1.3 实验药物

转化丸由淡附片6 g，桂枝9 g，干姜9 g，生地黄15 g，姜黄9 g，赤芍15 g，丹参20 g，三七3 g，黄芪20 g，大黄12 g组成，药材购买于福建中医药大学附属第二人民医院。用清水冲洗药材后浸泡40 min，煎煮2次后合并滤液，浓缩至含生药量分别为低剂量531 mg/mL、中剂量1 062 mg/mL、高剂量2 124 mg/mL，4 ℃保存备用。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及PF大鼠模型建立

大鼠适应性喂养1周后，根据随机数字表法分为对照组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组各13只；除对照组外，其余4组均用4.25%葡萄糖PD液按照100 mL/（kg·d）腹腔注射8周制作PF大鼠模型^［9］。随机选取对照组和模型组大鼠摘取腹膜组织，肉眼观察模型组大鼠腹膜颜色较对照组明显浑浊；同时病理结果显示腹膜发生增厚，间皮细胞出现损伤、破坏，见图1。造模期间，各组均未出现死亡情况。确认造模成功后，观察其余各组大鼠的精神状态、腹部紧张度、自主活动及饮食状况进行活体表型统一筛选，发现表型符合模型特征、整体状态基线一致，未出现不典型个体，最终每组各纳入12只大鼠。

1.2.2 动物给药

造模成功后，根据人和动物体表面积折算的等效剂量方法，将转化丸的临床剂量折算成SD大鼠的等效剂量。转化丸临床等效剂量为10.62 g/（kg·d），中剂量组给予10.62 g/kg灌胃，低剂量组给予5.31 g/kg灌胃，高剂量组给予21.24 g/kg灌胃。对照组和模型组灌胃等量生理盐水。各组大鼠灌胃1次/d，连续灌胃4周。

1.2.3 腹膜功能的检测

干预结束后对各组大鼠进行腹膜平衡试验：腹腔注射25 mL 4.25%葡萄糖PD液，0、4 h抽取大鼠尾静脉血，检测血液中葡萄糖的浓度；4 h后，麻醉处死大鼠，固定后打开腹腔，使用注射器自大鼠左下腹尽量抽取腹腔内液体，记录引流量，随后提起大鼠腹部，沿腹白线剪开腹腔，塞入干燥纱布充分吸取腹腔内残余液体并计算纱布前后质量差^［10］，以及大鼠腹膜超滤量（ultrafiltration volume，UFV）和葡萄糖转运量（mass transfer of glucose，MTG）^［11］。

UFV＝（纱布吸液后的质量－纱布的质量）×1 g/mL＋腹腔抽吸量－腹腔注射量

MTG＝（0 h葡萄糖浓度－4 h葡萄糖浓度）×PD液注入体积

1.2.4 HE和Masson染色观察腹膜病理学变化

大鼠安乐死后，分离各组大鼠腹膜组织，将部分腹膜组织置于-80 ℃冰箱进行保存，其余腹膜组织立即用4%多聚甲醛进行固定，乙醇和二甲苯脱水，石蜡包埋，切片，脱蜡，分别用HE、Masson进行染色，具体操作参照各自试剂盒说明书，显微镜观察各组大鼠腹膜组织的病理学变化和纤维化，使用ImageJ软件计算腹膜厚度。

1.2.5 RT-PCR检测腹膜组织中COX-2、mPGES-1、PGE2 mRNA转录水平

取各组大鼠腹膜组织放入液氮中粉碎，使用反转录试剂盒反转录为cDNA，以cDNA为模板进行扩增，扩增条件：95.0 ℃预变性5 min，95.0 ℃变性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃ 30 s延伸）×40循环。以GAPDH为内参，用{\mathrm{2}}^{-\mathrm{\Delta }\mathrm{\Delta }\mathrm{C}\mathrm{T}}法计算COX-2、mPGES-1、PGE2 mRNA转录水平。引物序列见表1。

1.2.6 Western blot检测腹膜组织中COX-2、mPGES-1、PGE2蛋白相对表达量

取各组大鼠腹膜组织，裂解后迅速研磨为匀浆，离心提取上清，采用BCA法进行蛋白定量后，再加入上样缓冲液煮沸变性。上样，进行电泳、切胶、转膜处理，室温下置于5%脱脂牛奶中封闭1.5 h，并采用一抗COX-2（1∶8 000）、mPGES-1（1∶8 000）、PGE2（1∶20 000）、GAPDH（1∶40 000）室温孵育1 h，4 ℃过夜；次日取出膜，采用TBST洗3次，每次10 min，加入二抗（1∶15 000）室温孵育1 h，TBST洗涤，显色液显色并利用成像仪成像后拍照，采集图像保存，用ImageJ软件测量蛋白灰度值，分析目的蛋白表达情况。

1.2.7 透射电镜观察腹膜组织超微结构的变化

切取腹膜组织于2.5%戊二醛（pH 7.2）固定2 h以上，随后弃去戊二醛固定液，以4 ℃预冷的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液漂洗3次，每次停留时间10～15 min；再置于1％四氧化锇避光固定2 h。再次漂洗后进行梯度丙酮脱水，采用环氧树脂进行梯度浸透、模具包埋、60 ℃恒温烘箱聚合固化；固化树脂块经机械修块后制备半薄切片，甲苯胺蓝染色后于光学显微镜下完成靶组织精准定位；重新修整样品切面，切取厚度60～80 nm超薄切片并捞片于铜网，恒温烘烤干燥后，依次进行醋酸铀、柠檬酸铅双重金属染色，漂洗干燥后置于电镜下观察腹膜组织超微结构。

1.3 统计学方法

应用SPSS 27.0统计软件进行分析。计量资料符合正态分布以（\overline{x}±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，若方差齐，两两比较采用LSD-t检验；若方差不齐则采用Games-Howell检验。不符合正态分布以M(P_{\mathrm{25}},P_{\mathrm{75}})表示，采用Kruskal-Wallis H检验，使用Dunnett检验进行事后两两比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结　果

2.1 5组腹膜超滤量、葡萄糖转运量和腹膜厚度比较

见图2。

2.2 5组腹膜组织HE和Masson染色比较

与对照组比较，模型组腹膜间皮细胞脱落、不连续，胶原纤维增生沉积，炎细胞大面积浸润；低、中、高剂量组腹膜组织结构和炎性浸润情况较模型组有明显改善，见图3。

2.3 5组腹膜组织超微结构比较

透射电镜结果显示：对照组腹膜间皮细胞形态规则，结构完整，相邻细胞间及细胞与基质间紧密连接；模型组腹膜间皮细胞表面不平整，腹膜间皮细胞可以看到空泡样变性，并且胶原纤维排列不规则；低、中、高剂量组上述情况较对照组均有所改善。见图4。

2.4 5组腹膜组织COX-2、mPGES-1和PGE2的mRNA转录水平比较

见图5。

2.5 5组腹膜组织COX-2、mPGES-1、PGE2蛋白相对表达量比较

见表2和图6。

3 讨　论

PD是终末期肾病患者重要的肾脏替代疗法之一，主要通过腹膜生物半透膜特性清除代谢废物和超滤水分^［12］。然而，长期使用PD液（含高浓度葡萄糖）会改变腹膜的结构和功能，腹膜间皮细胞的间皮-间充质转变使腹膜发生纤维化，最终造成终末期肾病患者PD失败^［13］。因此探究引起PF的机制并寻找相关药物延缓PF至关重要^［14］。

中医药具有改善PF进展的独特优势。因PD患者为肾衰病的终末期，往往病程较长，病情迁延，故常表现为正气不足，邪实留恋^［15］。杨洪涛教授结合长程透析患者久病入络、易瘀易滞的特点，总结临床，确立了健脾益肾、祛瘀降浊的中医治法^［16］。福建省名中医魏仲南主任认为，腹膜透析清除水分和毒素分别属中医“肾主水液”“肾主泄浊”的功能，均依赖于肾阳之气化而发挥作用。因此，温阳化气以补脾肾、活血化瘀以化“微型癥积”，利水行湿以祛水湿之邪对治疗腹膜纤维化尤为重要。转化丸能够调动命门之火、脾肾阳气，以化气行水，化除体内浊毒，扭转衰竭的腹膜功能，故名“转化”。方中附子为君，臣以干姜，佐以桂枝，三药辛温，共奏温阳散寒之效；大黄通腑泄浊，赤芍、丹参、三七、黄芪益气活血，使气血运行顺畅，助大黄消壅降浊；生地黄滋阴，以防辛温太过，津液耗损。全方共奏温阳化气、活血化瘀、利水行湿之功^［7］。

PD相关性腹膜纤维化是由多种因素共同作用导致^［17］。主要与长期暴露于高浓度葡萄糖、高级糖基化降解产物、尿毒症毒素等有关，其中，高糖腹透液诱导的腹膜纤维化是目前公认的导致PD技术受限的主要原因^［18］。长期暴露于高糖PD液中可导致腹膜氧化应激，进一步诱导腹膜纤维化。因此，采用高糖PD液刺激腹膜，能够明显诱导大鼠腹膜出现纤维化^［19］，与本研究结果一致。模型组大鼠腹膜显著增厚，腹膜组织病理改变明显，炎症细胞大面积浸润，电镜下腹膜间皮细胞形态明显异常，出现超滤功能障碍；转化丸各剂量组与模型组相较，腹膜功能得到明显提升，腹膜厚度也显著变小，腹膜病理组织结构及电镜下超微结构均有所改善，提示转化丸干预能减缓大鼠PF进程。

COX是参与氧化花生四烯酸合成前列腺素的限速酶，其中，COX-1固定表达并参与稳态功能，COX-2在正常组织低表达或几乎不表达，受炎症因子、损伤刺激后诱导性表达，参与多种病理过程，包括炎症、血管生成和肿瘤生长^［20］。研究表明，前列腺素在腹膜透析患者的腹膜腔内局部产生，且在腹膜炎期间其合成增加，从而增强腹膜对大分子的通透性。前列腺蛋白释放到PD透析液中最可能的来源是巨噬细胞和间皮细胞。体外实验表明，单核细胞暴露于高级糖基化终产物时，COX-2表达和PGE2分泌增加，且高葡萄糖浓度会增加腹膜间皮细胞（peritoneal mesothelial cell，PMC）中PGE2的合成。mPGES-1作为PGE2合成的主要合成酶，是炎症的主要介质，参与炎症、疼痛、血管生成和肿瘤发生^［21］。本研究结果中转化丸各剂量组的COX-2、mPGES-1、PGE2 mRNA转录水平和蛋白相对表达量均较模型组明显下降，表明转化丸能抑制相关通路的激活。

综上所述，转化丸治疗可能通过抑制COX-2/mPGES-1/PGE2信号通路，从而发挥抑制腹膜纤维化的作用，未来可增加该通路抑制剂组，进一步证明转化丸对该通路的干预作用，为防治PD相关性腹膜纤维化提供新思路及新方法。

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基金资助

福建省自然科学基金项目(2023J01812)

福建省卫生健康青年A类课题(2023QNA078)