基于PI3K/Akt/mTOR信号通路探讨清解扶正颗粒调控糖酵解抑制大肠癌转移的作用机制

摘要

目的 研究清解扶正颗粒（QFG）通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调控糖酵解抑制大肠癌转移的作用机制。 方法 （1）细胞实验：① 常规培养HCT116细胞，按照随机数字表法分为0 mg/mL组、0.5 mg/mL组、1.0 mg/mL组、1.5 mg/mL组，采用不同浓度QFG分别干预24 h和48 h，通过CCK-8法检测细胞存活率，qRT-PCR检测各组细胞PKM2 mRNA转录水平，从而筛选出QFG最佳干预参数为1.0 mg/mL、48 h。② 在此基础上，按照随机数字表法分为空白组和QFG组，空白组不加任何干预药物，QFG组予以1.0 mg/mL的QFG溶液干预48 h，采用细胞划痕实验检测迁移能力、Transwell实验检测侵袭能力、生化法检测乳酸含量、流式细胞术联合2-NBDG荧光探针检测细胞葡萄糖摄取能力，同时通过Western blot检测PKM2蛋白相对表达量。③ 构建PKM2过表达载体，转染至HCT116细胞，分为0 mg/mL组、过表达空载（NC）组、PKM2过表达（PKM2 OE）组，采用qRT-PCR和Western blot分别检测PKM2 mRNA转录水平和蛋白相对表达量，以验证转染结果。④ 将转染成功的细胞分为NC组、PKM2 OE组、NC＋QFG组和PKM2 OE＋QFG组，通过CCK-8法检测细胞存活率、细胞划痕实验检测迁移、Transwell实验检测侵袭、流式细胞术联合2-NBDG荧光探针检测细胞葡萄糖摄取，通过Western blot检测PKM2蛋白相对表达量。（2）动物实验：采用皮下接种结肠癌细胞HCT116构建裸鼠皮下移植瘤模型，7 d后裸鼠腋下见明显质硬肿瘤生长，即为造模成功。将造模成功的裸鼠按照随机数字表法分为模型组及低、中、高剂量组，每组6只，低、中、高剂量组分别按0.5、1.0、2.0 g/（kg·d）给予QFG灌胃，模型组给予生理盐水灌胃，灌胃体积均为10 mL/kg，每日1次，连续干预15 d。干预结束后对小鼠进行称重，2 d 1次，持续15 d，在灌胃第3、6、9、12、15天测量瘤体长短径，计算瘤体体积。随后取肿瘤组织进行HE染色，观察组织病理结构。采用Western blot检测PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白（PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、HIF1-α、Myc）表达量，免疫组化检测肿瘤组织糖酵解相关蛋白（PKM2、MCT1、MCT4、GLUT1）表达量。 结果 （1）细胞实验：① QFG可呈时间、剂量依赖性抑制细胞增殖。干预24 h时，与0 mg/mL组比较，1.0、1.5 mg/mL组细胞存活率显著下降（P＜0.05），0.5、1.0、1.5 mg/mL组PKM2 mRNA转录水平均上调（P＜0.05）；干预48 h时，与0 mg/mL组比较，1.0、1.5 mg/mL组细胞存活率与PKM2 mRNA转录水平同步降低（P＜0.05），0.5 mg/mL组PKM2 mRNA变化差异无统计学意义（P＞0.05）。综合增殖抑制与PKM2转录水平结果，且规避1.5 mg/mL高浓度造成的严重细胞损伤，选定1.0 mg/mL、干预48 h作为后续实验条件。② 与空白组比较，QFG组细胞迁移和侵袭能力降低（P＜0.05），乳酸含量和荧光强度均降低（P＜0.05），PKM2蛋白相对表达量升高（P＜0.05）。③ PKM2 OE组PKM2 mRNA转录水平和蛋白相对表达量均较0 mg/mL组和NC组明显升高（P＜0.05），表明细胞转染成功；④ 与NC组比较，PKM2 OE组细胞迁移、侵袭、存活率、荧光强度均升高（P＜0.05），NC＋QFG组上述指标均降低（P＜0.05）；与PKM2 OE组比较，PKM2 OE＋QFG组上述指标也降低（P＜0.05）。与NC组相比，PKM2 OE组PKM2蛋白相对表达量升高（P＜0.05）；NC＋QFG组PKM2蛋白相对表达量亦高于NC组（P＜0.05），但低于PKM2 OE组（P＜0.05）；与PKM2 OE组比较，PKM2 OE＋QFG组PKM2蛋白相对表达量变化差异无统计学意义（P＞0.05）。（2）动物实验：与模型组比较，低、中、高剂量组瘤体体积、瘤体重量均降低（P＜0.05）；模型组细胞形态和组织结构排列较为规则，低、中、高剂量组细胞形态不规则，组织结构较为紊乱，且有不同程度的核大深染，部分还出现组织出血；与模型组比较，低剂量组PKM2、p-Akt蛋白相对表达量均升高（P＜0.05），Akt蛋白相对表达量降低（P＜0.05），中剂量组p-PI3K、HIF1-α蛋白相对表达量均降低（P＜0.05），PKM2蛋白相对表达量升高（P＜0.05），高剂量组p-Akt、mTOR、HIF1-α蛋白相对表达量均降低（P＜0.05）；与模型组比较，低、中、高剂量组瘤体中PKM2阳性表达均升高（P＜0.05），MCT1、MCT4、GLUT1阳性表达均降低（P＜0.05）。 结论 清解扶正颗粒可通过PI3K/Akt/mTOR信号通路以及调控PKM2功能状态抑制大肠癌细胞异常糖酵解与侵袭转移。

Graphical abstract

关键词

大肠癌 / 清解扶正颗粒 / PKM2 / 糖酵解 / HCT116细胞

大肠癌（colorectal cancer，CRC）是全球高发的恶性肿瘤，据统计数据显示，50岁以下年轻患者确诊大肠癌时更易处于晚期并发生远处转移，该人群远处转移比例明显高于50岁及以上老年患者；同时20～49岁人群的远处转移发病率自1998年以来持续以每年2.7%的速度上升，是导致年轻患者大肠癌病死率逐年攀升的关键因素^［1-2］。清解扶正颗粒（Qingjie Fuzheng Granules，QFG）是辅助治疗大肠癌的中药复方，具有清热解毒、益气健脾的功效，契合大肠癌“邪毒蕴结、正气亏虚”的核心病机，研究显示其可抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路磷酸化，进而抑制大肠癌细胞增殖、凋亡、转移^［3-4］。然而其作用机制研究多集中于细胞凋亡、自噬调控及信号通路激活等方面^［5-6］，鲜有研究系统阐述其对肿瘤代谢过程的具体影响，缺乏对肿瘤能量代谢等关键环节的深入探究。因此，本研究以结直肠癌细胞HCT116及裸鼠皮下移植瘤模型为研究对象，体外借助CCK-8法、细胞划痕、Transwell、流式细胞术和Western blot等多项实验，探究QFG的生物学作用并验证PKM2的靶点功能；同时建立BALB/c裸鼠HCT116皮下移植瘤模型，观测QFG对移植瘤生长的干预效果，检测瘤组织中相关通路蛋白表达。从体外细胞与在体动物2个层面综合阐明QFG经PKM2调控PI3K/Akt/mTOR通路、抑制糖酵解以阻碍结直肠癌侵袭转移的分子机制，以期为结直肠癌转移的中医药防治提供实验依据与潜在作用靶点。

1 实验材料

1.1 实验动物及细胞株

SPF级4周龄BALB/c裸鼠，24只，雄性，购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（苏）2023-0009。饲养于江西中洪博元生物技术有限公司SPF级实验室，实验动物使用许可证：SYXK（赣）2020-0001。饲养温度20～26 ℃，湿度40％～70％，12 h光照/黑暗循环交替，小鼠生长繁殖饲料饲养，自由饮水。实验全程均遵循相关动物保护规定实施并通过江西中洪博元生物技术有限公司实验动物伦理委员会批准（审批号：LL202307060003）。人结肠癌HCT116细胞（湖南丰晖生物科技有限公司，货号：XB8396）。

1.2 实验药物

制备清解扶正颗粒溶液，将白花蛇舌草、半枝莲、炙黄芪、炒麦芽分别磨碎后按重量比1∶1∶1∶1称量并混合，加入12倍蒸馏水，加热回流提取2次，每次1.5 h，提取液过滤后，合并2次滤液，滤液浓缩至相对密度为1.28 g/mL的稠膏，与可溶性淀粉按照1∶1.42比例混合，在16目筛上制粒，干燥箱中60 ℃干燥，在干燥器中放冷后，再以10目筛和80目筛整粒，即得颗粒。

1.3 实验试剂

Leibovitz's L-15完全培养基（武汉普诺赛生命科技有限公司，货号：PM151010）；DMEM完全培养基（含10%FBS、1%青-链霉素，货号：KGM12800S）、CCK-8试剂盒（货号：KGA317）均购自南京凯基生物科技发展有限公司；2-NBDG葡萄糖探针（美国MCE公司，货号：HY-116215）；L-乳酸（LA）比色法测试盒（货号：E-BC-K044M）、BCA蛋白定量试剂盒（货号：E-BC-K318-M）均购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；结晶紫（北京索莱宝科技有限公司，货号：G1061）；PKM2抑制剂（上海吉玛制药技术有限公司，货号：PKM2-IN-1）；Lipofectamine^TM 3000转染试剂（含P3000试剂，货号：L3000015）、超敏发光液（货号：RJ239676）均购自美国Thermo Fisher Scientific公司；TRIzon试剂（货号：CW0580S）、RNA超纯提取试剂盒（货号：CW0581M）、RNA逆转录试剂（货号：R223-01）均购自北京康为世纪生物科技有限公司；PKM2抗体（货号：15822-1-AP）、PI3K抗体（货号：60225-1-IG）、Akt抗体（货号：10176-2-AP）、p-Akt抗体（货号：80455-1-RR）、mTOR抗体（货号：66888-1-Ig）、Myc抗体（货号：16286-1-AP）、Rabbit Anti-MCT1抗体（货号：20139-1-AP）、Anti-GLUT1抗体（货号：21829-1-AP）均购自美国Proteintech公司；p-PI3K抗体（美国Affinity Biosciences公司，货号：AF3241）；HIF1-α抗体（货号：bs-0737R）、Rabbit Anti-MCT4抗体（货号：bs-2698R）均购自北京博奥森生物技术有限公司；Mouse Anti-β-Actin抗体（北京全式金生物技术股份有限公司，货号：HC201）；HRP conjugated Goat Anti-Mouse IgG （H＋L）（货号：GB23301）、HRP conjugated Goat Anti-Rabbit IgG（H＋L）（货号：GB23303）均购自武汉赛维尔生物科技有限公司；苏木素（北京中杉金桥生物技术有限公司，货号：ZLI-9610）。

1.4 实验仪器

CO₂恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司，型号：BPN-80CW）；实时荧光定量PCR仪［伯乐生命医学产品（上海）有限公司，型号：CFX Connect™］；化学发光成像系统（上海天能科技有限公司，型号：Tanon-5200）；流式细胞仪［艾森生物（杭州）有限公司，型号：NovoCyte 2060R］；倒置显微镜（日本奥林巴斯株式会社，型号：BX43）；高速离心机（德国Eppendorf公司，型号：5424R）；酶标仪（上海闪谱生物科技有限公司，型号：SuPer Max3100）；酶标仪（北京六一仪器厂，型号：WD-2012B）；紫外可见分光光度计（德国NanoPhotometer公司；型号：NP80）。

2 实验方法

2.1 细胞实验

2.1.1 细胞培养及分组

HCT116细胞贴壁先培养于Leibovitz's L-15完全培养基中，置于37 ℃、5% CO₂、95%饱和湿度的恒温培养箱中进行培养，待细胞贴壁且融合度达到80%～90%时，使用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2的比例进行传代，移到含10%FBS、1%青-链霉素DMEM完全培养基中，置于37 ℃、5% CO₂、95%饱和湿度的恒温培养箱中继续培养，取处于对数生长期且生长状态良好的HCT116细胞制备细胞悬液，按每孔0.8×10⁴个细胞均匀接种至96孔板中，按照随机数字表法将其分为4组：0 mg/mL组、0.5 mg/mL组、1.0 mg/mL组、1.5 mg/mL组，每组设置6个平行复孔。

2.1.2 CCK-8法检测细胞活力

使用含DMEM完全培养基溶解配制不同浓度QFG（0.5、1.0、1.5 mg/mL）。待细胞完全贴壁后，空白组加入含DMEM完全培养基100 μL，0 mg/mL组、0.5 mg/mL组、1.0 mg/mL组、1.5 mg/mL组分别加入对应的含药培养基100 μL，分别在24 h和48 h后更换成不含DMEM培养基100 μL，于避光条件下向每孔加入10 μL CCK-8试剂，置于培养箱中孵育2 h，随后使用酶标仪在450 nm波长处检测每孔的吸光度（A）。

细胞存活率＝（A_QFG组－A_空白组）/（A_{0 mg/mL组}－A_空白组）×100%

2.1.3 细胞划痕实验检测细胞迁移能力

取处于对数生长期且生长状态良好的HCT116细胞制备细胞悬液，将细胞接种至6孔板中，每孔约1×10⁶个细胞，按随机数字表法将其分为空白组和QFG组，待融合度达到90%以上后进行划痕，使用200 μL枪头在每孔进行划痕，弃去培养基，用PBS清洗，换成无血清培养基后给每孔划痕拍照，记为0 h；QFG组予以1.0 mg/mL的QFG溶液干预48 h，空白组不加任何干预药物，放入培养箱中，48 h后给每孔的划痕拍照。通过ImageJ测量划痕面积计算各组细胞划痕愈合率。

2.1.4 Transwell实验检测细胞侵袭能力

取处于对数生长期且生长状态良好的HCT116细胞制备细胞悬液，按5×10⁴个/mL细胞密度接种于24孔板中，待细胞贴壁后，按随机数字表法将其分为空白组和QFG组，空白组不加任何干预药物，QFG组予以1.0 mg/mL的QFG溶液干预48 h。吸弃各孔溶液后消化，用无血清培养基重悬细胞，将0.3 mL含5×10⁴个细胞悬液接种于预先基质胶包被（侵袭实验）的Transwell小室上室中，下室加入0.5 mL含FBS的完全培养基，于37 ℃、5% CO₂、95%饱和湿度的恒温培养箱中培养48 h后，取出小室，弃去培养基，将小室拿出用4%多聚甲醛固定20 min，用0.1%结晶紫染色1 h，超纯水漂洗3次，用棉签擦去上室未迁移细胞和小室内的多余液体，于倒置显微镜下进行观察并拍照，拍照完成后去除染色液，加入33%乙酸处理，在562 nm波长下用酶标仪测定各孔吸光度（A）。

相对侵袭率＝A_QFG组/A_空白组×100%

2.1.5 生化检测细胞乳酸含量

按照L-乳酸（LA）比色法测试盒操作说明书检测细胞上清中乳酸的含量，收集细胞上清，1 000 r/mim离心20 min，按照试剂盒说明书进行生化检测，用酶标仪在530 nm处测定各孔吸光度（OD值），计算各组细胞培养基中乳酸含量。

2.1.6 流式细胞术结合2-NBDG荧光探针检测细胞葡萄糖摄取能力

吸弃各孔溶液，加入含50 μmol/L 2-NBDG无葡萄糖的DMEM培养基1 mL，孵育30 min，用温热的PBS清洗细胞3次，用胰蛋白酶消化24孔板内细胞，使细胞脱壁，置于离心机中以1 500 r/min离心5 min，弃上清，加500 μL PBS重悬细胞后，置于NovoCyte™流式细胞仪，检测各组细胞的平均2-NBDG探针荧光强度，以评估细胞对葡萄糖的摄取能力。

2.1.7 Western blot检测PKM2蛋白相对表达量

收集细胞，弃去培养基，用RIPA裂解液提取总蛋白；加入RIPA裂解液，提取组织总蛋白，12 000 r/min高速离心机4 ℃离心10 min，取上清液，BCA蛋白定量试剂盒对总蛋白进行定量。蛋白样品变性后，进行十二烷基硫酸钠凝胶电泳1.5 h，后用300 mA恒流转膜1 h。PVDF膜用5%脱脂奶粉封闭后，进行一抗PKM2（1∶1 000）孵育，4 ℃过夜，次日PVDF膜室温孵育二抗2 h，置于超高灵敏度化学发光成像系统中进行显影，目的蛋白灰度值/内参灰度值为目的蛋白相对表达量。

2.1.8 HCT116细胞转染构建PKM2过表达细胞

取对数生长期、状态良好的HCT116细胞制备细胞悬液，以5×10⁴个/mL的密度接种于6孔板，分为0 mg/mL组、过表达空载组（NC）、PKM2过表达（PKM2 OE）组。0 mg/mL组不做任何处理，其他2组待细胞融合度达70%时开展转染实验。转染前更换1 mL无血清培养基，取2支灭菌EP管，各加入125 μL Opti-MEM，一管加入5 μL lipofectamine^TM 3000试剂，另一管加入2.5 μg DNA与5 μL P3000试剂，混匀后室温静置5 min。将两管液体充分混匀，室温孵育15 min后滴加至对应细胞孔中，置于孵箱中培养。转染4 h后，每孔加入1 mL含20%血清的完全培养基，继续培养48 h后采用qRT-PCR和Western blot分别检测PKM2 mRNA转录水平和蛋白相对表达量，以验证转染结果。

2.1.9 qRT-PCR检测PKM2 mRNA表达

采用TRIzon试剂提取细胞中的总RNA，采用RNA超纯提取试剂盒提取mRNA，利用紫外可见分光光度计测定mRNA的浓度和纯度（A₂₆₀/A₂₈₀），通过RNA逆转录试剂合成cDNA，采用荧光PCR仪进行荧光定量PCR。反应步骤如下：预变性95 ℃，10 min；变性95 ℃，10 s；退火58 ℃，30 s；延伸72 ℃，30 s；40个循环。引物序列由通用生物系统（安徽）有限公司提供，见表1，以β-actin作为内参，基因的转录水平采用2^-ΔΔCt法计算。

2.1.10 多实验验证PKM2对细胞生物学行为及糖代谢的调控作用

将转染成功的HCT116细胞分为空载组（NC）组、PKM2过表达（PKM2 OE）组、空载＋QFG（NC＋QFG）组、PKM2过表达＋QFG（PKM2 OE＋QFG）组，采用前文所述细胞划痕、Transwell、CCK-8、流式细胞术结合2-NBDG荧光探针及Western blot实验方法，分别检测各组细胞迁移、侵袭、存活率、葡萄糖摄取及PKM2蛋白相对表达量。

2.2 动物实验

2.2.1 裸鼠皮下移植瘤模型构建及分组

取对数生长期HCT116细胞，胰酶消化并调节细胞密度至1×10⁸/mL，取BALB/c裸鼠24只，于其右侧腋下接种0.1 mL细胞悬液，即接种细胞数为2×10⁶个，7 d后裸鼠腋下见明显质硬肿瘤生长即是造模成功^［7-8］。采用随机数字表法将所有裸鼠分为模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组6只。使用生理盐水将QFG配制成浓度为50、100、200 mg/mL溶液，用于低、中、高剂量组灌胃。低、中、高剂量组分别按0.5、1.0、2.0 g/（kg·d）给与QFG灌胃，模型组按1.0 g/（kg·d）给予生理盐水灌胃，灌胃体积均为10 mL/kg，每日1次，连续干预15 d。第16天进行取材，取3只裸鼠肿瘤组织进行Western blot实验，另外3只裸鼠肿瘤组织进行免疫组化和HE染色实验。

2.2.2 裸鼠体质量及肿瘤体积测量

在干预过程中对裸鼠进行称重，1次/2 d，持续15 d；同时在给药第3、6、9、12、15天测量瘤体长短径，计算瘤体体积。

2.2.3 Western blot检测PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白表达量

参见“2.1.7”项下方法检测PI3K（1∶1 000）、p-PI3K（1∶1 000）、Akt（1∶5 000）、p-Akt（1∶8 000）、mTOR（1∶5 000）、HIF1-α（1∶1 000）、Myc（1∶4 000）蛋白相对表达量，具体步骤同前。

2.2.4 免疫组化检测PKM2、MCT1、MCT4、GLUT1表达

取裸鼠肿瘤组织切片，烤片、脱蜡、水化后，用柠檬酸缓冲液进行抗原修复。经5%BSA抗原封闭后，分别使用Anti-PKM2、Rabbit Anti-MCT1、Rabbit Anti-MCT4、Anti-GLUT1（稀释比均为1∶200）进行一抗孵育，4 ℃过夜后，进行辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗孵育，经DAB显色，苏木素复染反蓝，脱水透明后，封片，在显微镜下进行观察。

2.2.5 HE染色观察肿瘤组织病理结构

取裸鼠肿瘤组织切片，烤片、脱蜡、水化后，用苏木素染液染色3～5 min，流水冲洗后，用1%盐酸乙醇分化，反蓝液反蓝，伊红染色3～5 min后，切片脱水，封片，在显微镜下观察。

2.3 统计学方法

应用Graphpad Prism 9.0软件进行图形绘制和统计分析。计量资料符合正态分布以（\overline{x}±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，若方差齐两两比较采用S-N-K法，若方差不齐则采用Games-Howell检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结　果

3.1 不同浓度QFG干预不同时间对细胞存活率和PKM2 mRNA转录水平的影响

QFG干预24 h后，与0 mg/mL组比较，1.0 mg/mL组和1.5 mg/mL组细胞存活率均降低（P＜0.05），0.5 mg/mL组、1.0 mg/mL组和1.5 mg/mL组细胞PKM2 mRNA表达均升高（P＜0.05）；QFG干预48 h后，与0 mg/mL组比较，1.0 mg/mL组和1.5 mg/mL组细胞存活率均降低（P＜0.05），1.0 mg/mL组和1.5 mg/mL组细胞PKM2 mRNA转录水平均降低（P＜0.05），0.5 mg/mL组细胞PKM2 mRNA变化差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。QFG对细胞增殖的抑制作用呈剂量和时间依赖性，1.0 mg/mL QFG干预48 h时，既能产生的细胞增殖抑制作用（P＜0.05），又能观察到PKM2 mRNA转录水平出现明显下调（P＜0.05），同时避免了高浓度QFG（1.5 mg/mL）导致的过度细胞损伤，因此选择1.0 mg/mL QFG干预48 h作为后续研究的干预措施。

3.2 QFG对HCT116细胞迁移和侵袭能力的影响

与空白组比较，QFG组细胞迁移能力和侵袭能力均降低（P＜0.05）。见图2。

3.3 QFG对HCT116细胞乳酸含量、葡萄糖摄取能力和PKM2蛋白相对表达量的影响

与空白组比较，QFG组细胞乳酸含量和葡萄糖摄取荧光强度均下降（P＜0.05），PKM2蛋白相对表达量升高（P＜0.05）。见图3。

3.4 HCT116细胞PKM2过表达效率验证

与0 mg/mL组比较，PKM2 OE组PKM2 mRNA转录水平、PKM2蛋白相对表达量均升高（P＜0.05）；与NC组比较，PKM2 OE组PKM2 mRNA转录水平、PKM2蛋白相对表达量均升高（P＜0.05）。见图4。

3.5 4组细胞迁移、侵袭、存活率、葡萄糖摄取能力和PKM2蛋白相对表达量比较

与NC组比较，PKM2 OE组细胞迁移、侵袭、存活率、荧光强度均升高（P＜0.05），NC＋QFG组上述指标均降低（P＜0.05）；与PKM2 OE组比较，PKM2 OE＋QFG组细胞迁移、侵袭、存活率均降低（P＜0.05）；与NC组相比，PKM2 OE组PKM2蛋白相对表达量升高（P＜0.05）；NC＋QFG组PKM2蛋白相对表达量亦高于NC组（P＜0.05），但低于PKM2 OE组（P＜0.05）；与PKM2 OE组相比，PKM2 OE＋QFG组PKM2蛋白相对表达量变化差异无统计学意义（P＞0.05）。见图5。

3.6 4组裸鼠移植瘤瘤体生长、组织病理及糖酵解和PI3K/Akt/mTOR通路相关蛋白表达比较

与模型组比较，低、中、高剂量组瘤体体积、瘤体重量均降低（P＜0.05）；HE染色结果显示，模型组细胞形态与组织结构排列较为规则，低、中、高剂量组细胞形态不规则，组织结构较为紊乱，且有不同程度的核大深染，部分还出现组织出血；与模型组比较，低剂量组PKM2、p-Akt蛋白相对表达量升高（P＜0.05），Akt蛋白相对表达量降低（P＜0.05），中剂量组p-PI3K、HIF1-α蛋白相对表达量降低（P＜0.05），高剂量组p-Akt、mTOR、HIF1-α蛋白相对表达量均降低（P＜0.05）；免疫组化结果显示：与模型组比较，低、中、高剂量组瘤体中PKM2阳性表达均升高（P＜0.05），MCT1、MCT4、GLUT1阳性表达均降低（P＜0.05）。见图6。

4 讨　论

大肠癌的转移是一个多步骤、多分子参与的复杂过程，有氧糖酵解（Warburg效应）是肿瘤代谢重编程的核心特征^［9］。中医药治疗大肠癌具有多靶点、毒副反应低的作用特点，可有效控制肿瘤的发生和发展^［10］。QFG作为临床常用的抗肿瘤中药复方，由白花蛇舌草、炙黄芪等中药配伍而成，具有清热解毒、益气健脾的功效，可兼顾“祛邪”与“扶正”，多项研究已表明QFG可通过调控PI3K/Akt信号通路诱导大肠癌细胞凋亡，抑制大肠癌细胞增殖、迁移和侵袭^［11-12］。

肿瘤微环境是决定大肠癌细胞增殖、侵袭与转移的核心条件，肿瘤细胞通过Warburg效应大量摄取葡萄糖、持续分泌乳酸，造成微环境酸化、局部缺氧，进一步诱发炎症浸润与免疫逃逸，为肿瘤进展、远处转移创造适宜条件^［13］，PKM2作为有氧糖酵解的核心限速酶，成为连接肿瘤代谢重编程与微环境稳态的重要分子纽带^［14］。PKM2存在二聚体、四聚体2种功能相反的聚合构象，二聚体具备促癌活性，四聚体可逆转肿瘤异常糖酵解^［15］。现有研究普遍认为下调PKM2表达可抑制肠癌侵袭转移。但本实验结果显示，QFG干预后大肠癌细胞PKM2总蛋白表达显著升高，与传统认知存在差异。据此推测，QFG并非下调PKM2表达，而是促进PKM2组装为高活性四聚体，重塑蛋白功能，进而抑制肿瘤恶性表型。本实验仅检测PKM2总蛋白，未检测酶活性、构象比例与核定位，该调控机制仍有待后续验证。

中药药效与服用剂量密切相关，传统中医理论以“辨证定剂量”为核心原则，剂量选择需随证候轻重、病势缓急、患者体质强弱动态调整；经方体系更通过剂量梯度精准调控药力峻缓，同时恪守“中病即止”的用药准则，以药效阈值作为剂量终止的判断依据^［16］。本研究发现，相同干预时长下，QFG的抑癌效果随药物浓度升高逐步增强；各浓度药物干预24 h均上调PKM2 mRNA转录水平，延长至48 h后，中、高浓度则转为下调PKM2 mRNA转录水平，体现药效随作用时间发生动态变化。提示临床应用QFG治疗大肠癌时，需结合患者病情、体质精准把控给药剂量与疗程。

葡萄糖转运体GLUT1是介导细胞葡萄糖摄取的核心分子^［17］，乳酸转运体MCT1、MCT4则负责将胞内乳酸排出至胞外微环境^［18］，PI3K/Akt/mTOR信号通路激活后可通过HIF1-α、Myc等转录因子，调节GLUT1、MCT1、MCT4和PKM2表达，驱动大肠癌细胞有氧糖酵解与酸性微环境，促进大肠癌侵袭进展^［19-20］。本研究HE染色显示，模型组肿瘤组织结构紊乱、核深染、伴出血，QFG干预可改善上述病理改变，提示其具有抑瘤作用。同时QFG可剂量依赖性抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路活化，下调PI3K、Akt、mTOR的磷酸化水平，降低HIF1-α、Myc蛋白表达水平，促进GLUT1、MCT1、MCT4和PKM2糖酵解相关分子的表达，驱动有氧糖酵解进程，提示QFG可通过阻断上游信号通路，逆转糖酵解相关分子的异常表达，削弱肿瘤代谢优势。值得注意的是，低剂量QFG干预时，肿瘤组织p-Akt出现代偿性升高，但该代偿效应并未激活下游HIF1-α、mTOR等促癌分子，未重启糖酵解级联反应；中、高剂量QFG则可彻底抑制Akt磷酸化，阻断PI3K/Akt/mTOR信号传导，使移植瘤体积、质量下降，体现了药物作用的剂量特征与双向调节特点^［21-22］。

综上所述，QFG可在体内外抑制大肠癌细胞增殖、迁移、侵袭及糖酵解水平，其作用机制与调控PI3K/Akt/mTOR信号通路、上调糖酵解关键酶PKM2表达密切相关。

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基金资助

福建省自然科学基金项目(2022J01889)

福建省自然科学基金项目(2026J001898)