基于网络药理学和动物实验探讨茯苓酸改善糖尿病肾病的作用机制

摘要

目的 基于网络药理学探讨茯苓酸（PA）调控糖尿病肾病（DKD）的作用机制，并进行动物实验验证。 方法 利用SwissTargetPrediction、CTD、GeneCards和SEA数据库筛选PA作用靶点；利用GeneCards、OMIM和CTD数据库筛选DKD相关靶点，将PA作用靶点与DKD相关靶点取交集，筛选PA治疗DKD潜在作用靶点；利用STRING数据库构建交集靶点的蛋白质相互作用网络（PPI），并利用Cytoscape 3.7.1软件筛选核心靶点；借助Metascape平台进行基因本体（GO）功能和京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路富集分析。实验验证PA治疗DKD的作用机制，该研究采用随机对照设计，以12只符合自发成模标准［空腹血糖（FPG）＞11.1 mmol/L］的db/db小鼠作为研究对象，采用随机数字表法分为模型组和PA组，每组6只，并将6只db/m小鼠作为正常组。其中，PA组按照PA 5 mg/（kg·d）的剂量给予PA橄榄油溶液灌胃；模型组与正常组小鼠则于每日同一时间按照与PA组等体积的标准给予空白橄榄油溶液灌胃，持续干预4周。干预过程中，每周同一时间点记录小鼠精神状态、活动情况及摄食饮水等一般情况、体质量及FPG水平。4周后采用全自动生化分析仪检测血清肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）含量，采用尿总蛋白定量测试盒检测24 h尿总蛋白排泄量（24hUTP），苏木素-伊红（HE）染色、Masson染色及光学显微镜（×400）观察肾脏组织病理形态，采用逆转录-定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测肾脏组织中转化生长因子（TGF）-β、丝裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）mRNA相对表达水平。 结果 网络药理学筛选获得PA作用靶点228个，DKD相关靶点4 900个，PA治疗DKD潜在作用靶点150个；PPI网络显示，MAPK8、TGF-β1、NLRP3等为核心靶点；GO功能分析分别获得生物学过程（BP）、细胞组分（CC）及分子功能（MF）条目566、78和124个；KEGG信号通路富集分析获得155条通路，主要涉及晚期糖基化终末产物（AGE）-晚期糖基化终末产物受体（RAGE）、C型凝集素受体（CLR）和肿瘤坏死因子（TNF）等信号通路。动物实验结果显示，给药第1～4周，正常组体质量平稳增长，与正常组比较，模型组和PA组体质量和FPG均显著升高（P＜0.05）；给药第3～4周，与模型组比较，PA组FPG显著降低（P＜0.05）。药物干预4周后，与正常组比较，模型组Scr、BUN和24hUTP含量均显著升高（P＜0.05），肾小球基底膜明显增厚，肾间质可见大量胶原纤维增生及炎性细胞浸润，模型组肾脏组织中TGF-β、NLRP3、MAPK8 mRNA相对表达水平均显著升高（P＜0.05）。与模型组比较，PA组Scr、BUN和24hUTP水平均显著降低（P＜0.05），肾小球形态得以恢复，间质胶原纤维增生及炎症浸润现象显著改善，PA组肾脏组织中TGF-β、MAPK8、NLRP3 mRNA相对表达水平均显著下降（P＜0.05）。 结论 PA能有效降低db/db小鼠血糖水平，改善肾功能并减轻肾组织病理损伤，其改善肾损伤与纤维化的机制可能与多靶点协同及抑制TGF-β/MAPK8/NLRP3信号通路有关。

Graphical abstract

关键词

糖尿病肾病 / 茯苓酸 / TGF-β/MAPK8/NLRP3信号通路

糖尿病肾病（diabetic kidney disease，DKD）是导致终末期肾病（end-stage renal disease，ESRD）的主要原因，当前针对DKD的临床干预措施普遍存在靶点单一、不良反应显著及疗效局限等问题，无法有效延缓DKD向ESRD的进程。相较之下，中医药防治DKD具有多组分协同、多靶点调控的特征，在改善肾脏微环境方面展现出独特优势，但其核心物质基础与靶向机制的模糊性限制了临床转化与推广^［1］。茯苓作为具有“淡渗利湿”作用的代表性中药，在DKD的长期治疗中疗效确切且安全性高^［2］。药理学证实，茯苓酸（pachymic acid，PA）作为茯苓主要的三萜类活性单体^［3］，具有显著的抗氧化应激、抗炎及抗肿瘤等多重生物活性^［4］，这恰与DKD进程中炎症浸润、肾组织损伤、细胞外基质（ECM）沉积和上皮细胞间充质转化产生瘢痕等病理特征高度契合。然而，PA对DKD的作用机制目前尚缺乏系统的实验验证。因此，本研究依托网络药理学分析与动物实验验证，旨在明确PA对DKD肾损伤的保护作用并探究其分子机制，为开发基于天然产物单体的DKD靶向治疗策略提供坚实的科学依据。

1 实验材料

1.1 实验动物

SPF级8周龄健康雄性db/db小鼠14只，体质量（39.4±2.1）g，SPF级同周龄健康雄性db/m小鼠6只，体质量（22.0±0.8）g，所有实验动物均购自常州卡文斯实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（苏）2016-0010，实验动物使用许可证号：SYXK（闽）2019-0007，饲养于福建中医药大学动物实验中心。饲养环境维持屏障系统标准条件：室温恒定于22~25 ℃，相对湿度50%，12 h/12 h昼夜明暗交替光照。实验期间小鼠均给予分笼饲养，其中，db/m小鼠与db/db小鼠均给予SPF级辐照灭菌标准小鼠饲料，自由摄食和饮水。本动物实验方案经福建中医药大学实验动物伦理委员会审核批准（批件号：FJTCMIACUC2021078）。

1.2 实验药物与试剂

PA（成都普思生物科技股份有限公司，货号：PS010073，纯度≥98.0%）；罗氏活力型肌酐（Cr）测定试剂盒（货号：C011-2-1）、尿素氮（BUN）测试盒（货号：C013-1-1）、尿总蛋白定量（UTP）测试盒（货号：C035-2-1）均购自南京建成生物工程研究所；Takara反转录试剂盒（货号：RR047A）、Takara定量PCR试剂盒（货号：RR420A）均购自宝日医生物技术（北京）有限公司；TRIzol总RNA抽提试剂（货号：R0016）、Masson三色染色试剂盒（货号：C0189S）均购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.3 实验仪器

电子天平（上海精科天平公司，型号：JA3003）；组织研磨仪（常州市凯航仪器公司，型号：JJ-2）；高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司，型号：5417R）；光学显微镜（日本Nikon公司，型号：ECLIPSE511）；石蜡切片机（德国Leica公司，型号：RM2235）；化学发光成像仪（型号：Universal Hood Ⅱ）、荧光定量PCR仪（型号：CFX96）均购自美国Bio-Rad公司；石蜡包埋机（孝感市亚光医用电子技术公司，型号：YB-7LF）。

2 实验方法

2.1 网络药理学分析

2.1.1 PA作用靶点的筛选

利用SwissTargetPrediction数据库（https：//swisstargetprediction.ch/）、CTD数据库（https：//ctdbase.org/）、GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）和SEA数据库（https：//sea.bkslab.org/）进行PA作用靶点筛选。将获取的靶点蛋白导入UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/），限定物种来源为“Homo Sapiens”，对PA作用靶点名称进行标准化处理，并验证各作用靶点的完整性。经合并去重处理后，最终构建PA作用靶点数据库。

2.1.2 DKD相关靶点的筛选

利用GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）、OMIM数据库（https：//www.omim.org/）和CTD数据库（https：//ctdbase.org/），以“kidney disease”（肾病）和“diabetic”（糖尿病）作为DKD相关靶点的关键词进行检索。经交集去重处理后，最终构建DKD相关靶点数据库。

2.1.3 PA和DKD相关交集靶点的筛选

在生物信息学和进化基因组学分析平台（https：//www.bioinformatics.com.cn/）中，将PA作用靶点和DKD相关靶点进行映射，绘制PA-DKD韦恩图，提取二者交集靶点，构建PA治疗DKD潜在作用靶点数据库。

2.1.4 PPI网络构建及核心靶点筛选

将交集靶点导入STRING 12.0数据库（https：//cn.string-db.org/），限定物种来源为“Homo Sapiens”，设定最低相互作用阈值为“高”（Confidence score≥0.9），构建蛋白质相互作用（PPI）网络。为量化网络拓扑特征，将PPI网络文件导入Cytoscape 3.7.1软件进行可视化处理，并运用其拓扑分析插件NetworkAnalyzer计算网络中各节点度值（Degree）、介数中心性及接近中心性等关键拓扑学参数。以节点度值作为筛选阈值进行网络拓扑特征量化，最终确认PA治疗DKD的核心靶点。

2.1.5 GO功能和KEGG通路富集分析

将交集靶点导入Metascape数据库（https：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1），开展基因本体论（GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路富集分析。其中，GO功能分析涵盖生物学过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）3个核心维度。以P＜0.05为统计学显著性阈值，并按-log₁₀（P值）降序排列，以评估各项条目的生物学重要性，分别筛选出GO功能3大分类中排名前10的功能条目，以及KEGG信号通路富集分析中排名前20的信号通路。导出分析结果后，利用微生信平台（https：//www.bioinformatics.com.cn/）进行可视化处理。

2.2 动物实验

2.2.1 分组、模型鉴定与给药

经1周适应性饲养后，根据小鼠遗传背景进行初始定性分组：将6只db/m小鼠设为正常组，14只db/db小鼠设为成模预备组。其间，成模预备组中2只小鼠因发育过程中的自然原因死亡，予以剔除。待成模预备组自然发育至12周龄后，禁食不禁水12 h，经尾静脉检测空腹血糖（FPG），并以FPG＞11.1 mmol/L作为模型鉴定成功标准。结果显示，与正常组比较，成模预备组FPG显著升高（P＜0.05），提示糖尿病模型自然发病并鉴定成功，见表1。模型鉴定成功后，将符合标准的12只db/db小鼠依据FPG水平，采用随机数字表法分为2组：模型组（n＝6）和PA组（n＝6）。正常组（n＝6）作为空白对照继续同条件饲养，PA组按照PA 5 mg/（kg·d）的剂量给予PA橄榄油溶液灌胃；模型组与正常组小鼠则于每日同一时间按照与PA组等体积的标准给予空白橄榄油溶液灌胃。各组小鼠每日同一时间干预1次，连续给药4周，并于每周固定时间禁食不禁水12 h后经尾静脉检测FPG水平。

2.2.2 取材

给药4周后，将3组小鼠单只置于代谢笼中，收集终点24 h尿液，记录总尿量，室温、3 000 r/min离心10 min后获取上清液，并置于-80 ℃冰箱冻存，以待测24 h尿总蛋白排泄量（24hUTP）。尿液收集完毕后，常规麻醉小鼠，经眼眶静脉丛采血。全血样本室温静置后，4 ℃、3 000 r/min离心10 min，分离获取上层血清，于-80 ℃环境保存以备肾功能检测。采血完毕后，立即于冰上快速剥离小鼠双侧肾脏，生理盐水冲洗干净并用吸水纸吸干。将肾脏沿冠状面纵切为2部分：一部分置于4%多聚甲醛溶液中固定，用于后续的病理形态学检查；另一部分置于冻存管中，于液氮中速冻1 h后，转入-80 ℃超低温冰箱保存，用于基因表达检测。

2.2.3 观察指标

2.2.3.1 一般情况

自给药第1周起，每周定时观察小鼠的精神状态、活动情况及摄食饮水等一般情况，每周固定时间称量1次小鼠体质量。

2.2.3.2 血糖检测

自给药第1周起，每周同一时间禁食不禁水12 h后，经尾静脉采血测定FPG。

2.2.3.3 肾功能与24hUTP检测

取上述冻存的小鼠血清样本，在冰上融化后，严格按照试剂盒说明书操作，采用全自动生化分析仪检测血清肌酐（Scr）和BUN含量。取上述冻存的终点24 h尿液样本，室温融化后，采用UTP测试盒测定尿蛋白浓度，并结合总尿量计算24hUTP。

2.2.3.4 肾脏组织病理形态学检查

取固定于4%多聚甲醛溶液中的小鼠肾脏组织，石蜡包埋。使用切片机切成厚度约为5 μm连续切片，脱蜡至水后进行染色。① 苏木素-伊红（HE）染色：切片经PBS溶液洗涤2次，浸泡于苏木素染液中；采用0.1%盐酸乙醇分化，冲洗后经伊红染液复染。② Masson染色：切片脱蜡至水后依次经5%硫代硫酸钠反应、Weiger铁苏木精浸染、1%盐酸乙醇分化，随后行丽春红酸性品红染色液染色及苯胺蓝染色液复染，并以1%冰醋酸处理分化。置于光学显微镜下观察肾脏组织结构的病理学改变。

2.2.3.5 RT-qPCR法检测肾脏组织中TGF-β、MAPK8、NLRP3 mRNA相对表达水平

取50 mg保存于-80 ℃的小鼠肾脏组织，在-40 ℃下采用组织研磨仪充分均质化。采用TRIzol法提取肾脏组织总RNA，并测定其纯度与浓度。配制逆转录反应液，以随机引物逆转录合成cDNA。以合成的cDNA为模板，β-actin为内参，采用SYBR Green染液为标记，对转化生长因子（TGF）-β、丝裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）和NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）进行实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）扩增。扩增反应体系为20 μL，其中，SYBR qPCR试剂盒预混液10 μL，前引物0.5 μL，后引物0.5 μL，cDNA 1 μL，超纯水8 μL。反应条件如下：93 ℃预变性3 min；93 ℃变性10 s；60 ℃退火20 s；70 ℃延伸40 s，共进行40个循环；最后72 ℃稳定延伸10 min。相关基因引物序列由福州博涵生物科技公司设计制作，见表2。以β-actin作为内源性参照，采用2^-ΔΔCt法计算各目的基因的mRNA相对表达量。

2.2.4 统计学方法

数据统计采用SPSS 25.0软件进行。符合正态分布的计量资料以（\overline{x}±s）进行描述。多组间比较采用单因素方差分析，两两比较方差齐采用LSD-t法，方差不齐采用Games-Howell法。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 结　果

3.1 PA作用靶点、DKD相关靶点及交集靶点筛选

经筛选、去重后共获得228个PA作用靶点，4 900个DKD相关靶点，取交集后共获得150个PA治疗DKD潜在作用靶点。见图1。

3.2 PPI网络图的构建与核心靶点分析

PPI网络共包含106个节点和261条边，见图2。节点度值前10的蛋白相关拓扑学参数，见表3。其中，MAPK8、TGF-β1和NLRP3位于网络中心，推测其为治疗DKD的核心靶点。

3.3 GO功能富集分析

GO功能富集分析共获得566个BP、78个CC和124个MF显著富集条目。见图3。

3.4 KEGG信号通路富集分析

KEGG信号通路富集分析共筛选获得155条信号通路，按照显著性水平降序排列，筛选排名前20位的信号通路，主要信号通路涉及晚期糖基化终末产物（AGE）-晚期糖基化终末产物受体（RAGE）、C型凝集素受体（CLR）和TNF等关键信号通路。见图4。

3.5 3组一般情况比较

给药第1～4周，正常组体质量平稳增长，与正常组比较，模型组和PA组体质量显著升高（P＜0.05）。见表4。给药期间，正常组小鼠状态活跃，对外界刺激反应敏捷，且被毛浓密光洁；与正常组比较，模型组小鼠表现出精神萎靡、反应迟钝、被毛粗糙甚至局部脱落等体征，并伴有显著的多饮、多食及多尿现象；与模型组比较，PA组小鼠精神状态明显好转，自主活动量增加，被毛逐渐恢复平顺与光泽，且多饮、多食、多尿等症状均呈不同程度减轻。

3.6 3组FPG水平比较

见表5。

3.7 3组肾功能和24hUTP水平比较

见表6。

3.8 3组肾脏组织病理形态学比较

HE染色结果显示，正常组肾小球结构形态正常，基底膜光滑，肾小球形态规则，肾小管排列整齐；与正常组比较，模型组肾小球体积增大且呈分叶状，基底膜增厚，肾小管排列结构紊乱；与模型组比较，PA组肾小球体积明显减小，基底膜厚度降低，炎症细胞的浸润减少。Masson染色结果显示：正常组肾小球和肾小管排列形态均正常，无大量胶原纤维增生；与正常组比较，模型组肾间质组织中可见大量胶原纤维增生；与模型组比较，PA组肾小管排列较规则，肾间质胶原纤维增生减少。见图5。

3.9 3组肾脏组织中TGF-β、MAPK8、NLRP3 mRNA相对表达水平比较

见表7。

4 讨　论

流行病学研究显示，约20%～40%的糖尿病患者表现出不同程度的肾损伤，是导致ESRD的重要因素^［5］。DKD的核心病理机制涉及炎症-纤维化级联反应、代谢紊乱和细胞损伤等，其肾组织特征性改变包括肾小球基底膜增厚、足细胞损伤等^［6］。延缓乃至逆转DKD患者肾功能损伤是当前防治DKD的重要切入点。中医药在改善DKD肾脏微环境方面具有多组分、多靶点调控的独特优势。茯苓具有淡渗利湿、健脾宁心的功效，在临床治疗DKD中疗效确切。药理研究证明，茯苓能激活丙二醛（MDA）水平及超氧化物歧化酶（SOD）活性来影响抗氧化作用，进而缓解DKD进展，其核心单体PA能够通过下调IL-1β和IL-6等炎症介质表达^［7］，影响细胞炎症氧化应激反应，在肾间质纤维化的治疗中具有积极作用^［8］，但其具体作用机制尚待进一步明确^［9］。本研究将网络药理学预测与动物实验相结合，深入探讨了PA对改善DKD小鼠肾损伤的具体作用机制。

为探究其药效，本研究选用db/db小鼠作为动物模型进行宏观药效评价。结果显示，经PA连续干预肾功能后，不仅小鼠的高血糖状态得到显著控制，其肾功能及24hUTP水平均较模型组显著下降，提示PA能有效改善DKD小鼠肾脏滤过功能，减少尿蛋白漏出。在此基础上，HE与Masson染色结果进一步提供了直接的组织病理学证据：模型组小鼠存在明显的肾小球体积增大、基底膜增厚、炎性细胞浸润及肾间质大量胶原纤维增生；而经PA干预后，肾小球形态得以恢复，基底膜厚度降低，且间质胶原纤维增生与炎性细胞浸润现象得到显著改善。这充分证实了PA在改善肾脏微观结构、延缓纤维化进程中的确切疗效。

在明确宏观药效的基础上，本研究进一步结合网络药理学与分子生物学手段，深度挖掘了PA发挥药效的微观机制。经筛选共获得150个PA治疗DKD的潜在作用靶点。在PPI网络中，MAPK8、TGF-β1及NLRP3具有高拓扑特征值，被确认为PA发挥多靶点、多通路肾脏保护作用的核心靶点。进一步KEGG通路富集分析结果显示，AGE-RAGE等关键代谢与炎症通路被显著富集。结合既往研究，在长期高血糖状态下，DKD患者体内大量AGEs聚集，可诱导肾小球系膜细胞（GMCs）中的RAGE上调；该过程不仅通过激活还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶引发氧化应激和炎症发生，还能从蛋白表达及脱乙酰酶活性双重层面抑制沉默信息调节因子1（SIRT1）水平，最终导致TGF-β的过量分泌与肾脏实质纤维化^［10-11］。

基于上述网络预测与病理机制，TGF-β作为介导肾脏纤维化的核心因子，而MAPK8与NLRP3炎症小体作为介导肾脏局部炎症反应和细胞凋亡的关键节点，二者在调控网络中共同发挥着关键作用。进一步RT-qPCR实验证实，模型组肾脏组织中TGF-β、MAPK8、NLRP3 mRNA相对表达水平显著升高；而PA干预显著下调这3个关键基因的mRNA表达。该结果不仅与网络药理学核心靶点的预测结果高度吻合，也进一步从转录水平阐明了PA的抗炎与抗纤维化机制。有研究显示，DKD肾小管间质纤维化受到TGF-β轴调控^［12-14］，且该轴与MAPK8信号通路间存在串扰机制^［15］。当机体细胞处于高糖环境时，TGF-β信号通路被激活，不仅直接促进ECM大量沉积，还可通过保守的三级酶促反应（MAPKKK→MAPKK→MAPK）诱发MAPK8通路的激活。活化的MAPK8信号激活下游促炎和促纤维化分子，不仅参与介导肾小管上皮细胞向间充质表型的去分化及细胞凋亡，加剧DKD肾脏纤维化^［16］，还能作为上游信号触发NLRP3炎症小体的形成。由于NLRP3炎症小体介导的促炎级联反应贯穿于DKD的发生与发展，抑制其转录与激活可有效减缓炎症反应发生^［17］。

综上所述，PA能有效降低db/db小鼠FPG水平，改善肾功能并减轻肾组织病理损伤。其内在分子机制表现为多靶点、多通路的协同干预，其中抑制TGF-β/MAPK8/NLRP3信号通路、减轻炎症级联反应与纤维化基质沉积可能是其发挥肾脏保护作用的核心环节。本研究将TGF-β/MAPK8/NLRP3通路作为其核心作用轴系，为后续深入解析关键靶点蛋白与PA的直接相互作用奠定基础，但其更深入的作用靶点及机制，还需通过直接靶点验证及多组学解析来进一步探究。

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基金资助

国家级大学生创新创业训练项目(202310393002)

福建省大学生创新创业训练项目(S202310393007)