高糖通过抑制蛋白磷酸酶2A下调自噬导致HL-1细胞损伤的机制

摘要

目的 通过观察高糖(HG)条件下蛋白磷酸酶2A(PP2A)催化亚基Cα/β、微管相关蛋白1轻链3(LC3B)以及螯合体1(SQSTM1/p62)蛋白在小鼠心肌细胞株(HL-1)中的表达变化，探讨PP2ACα蛋白表达减少或PP2A酶活性降低是否通过抑制自噬水平而导致HG心肌细胞的损伤。方法 采用不同浓度HG(11、22、33和44 mmol/L)处理72 h, 33 mmol/L HG处理不同时间(24、48及72 h)体外培养HL-1细胞，并设正常葡萄糖组(NG组，5.5mmol/L葡萄糖)和甘露醇组(Mannitol组，终浓度为33或44 mmol/L)作为对照；细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测心肌细胞活力，明确HG对心肌的损伤作用以及HG处理浓度和时间；蛋白免疫印迹法(Western blot)检测p-PP2ACα Tyr307和PP2ACα/β蛋白水平，以及HG、氯喹(CQ)和雷帕霉素(RAPA)处理后的LC3B和SQSTM1/p62蛋白表达，以明确细胞自噬情况；实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)检测Map1lc3b和sqstm1的mRNA表达水平；使用冈田酸盐(OA,10 nmol/L)抑制PP2A活性，以及在稳定敲低或过表达Ppp2cα后，检测HL-1心肌细胞活力、细胞培养基上清液中乳酸脱氢酶(LDH)含量、细胞LC3B和SQSTM1/p62的蛋白及mRNA水平。结果 HG处理以时间和浓度依赖方式降低HL-1心肌细胞活力，增加细胞中p-PP2ACα Tyr307水平，并减少PP2ACα/β蛋白表达(P<0.05);HG处理还可降低LC3B和SQSTM1/p62蛋白和mRNA表达(P<0.05);在NG和HG条件下，CQ处理可增加SQSTM1/p62蛋白水平，RAPA可增加LC3B蛋白表达，并减少SQSTM1/p62蛋白表达(P<0.05);OA可降低心肌细胞活力，并加重心肌细胞损伤(P<0.05),减少LC3B和SQSTM1/p62蛋白及mRNA表达水平(P<0.05);敲低Ppp2cα结果与OA处理效应相似，过表达Ppp2cα可部分恢复心肌细胞活力，并减轻心肌细胞损伤，增加LC3B和SQSTM1/p62蛋白及mRNA水平(P<0.05)。结论 PP2A酶活性降低或PP2ACα蛋白表达减少促进了HG导致的心肌损伤，其分子机制与抑制Map1lc3b和sqstm1的mRNA转录有关。

关键词

高糖 / 蛋白磷酸酶2A / 自噬 / 糖尿病心肌病 / 小鼠心肌细胞