兔毛角蛋白海绵的制备及其对亚甲基蓝的吸附研究

Preparation of rabbit hair keratin sponge and study on its adsorption performance for methylene blue

摘要

针对兔毛角蛋白资源浪费，采用冻融-干燥的方法制备了兔毛角蛋白海绵，通过红外光谱、X射线衍射、扫描电镜对其结构、形貌等进行表征。以亚甲基蓝为溶液，考察了角蛋白浓度、亚甲基蓝初始浓度、吸附时间对角蛋白海绵吸附性能的影响，结果表明，角蛋白海绵结构稳定且具有均匀的孔结构。角蛋白海绵对亚甲基蓝的吸附率随浓度增加而增加，当浓度为8%时，15 min达到吸附平衡，且亚甲基蓝浓度30 mg/L^-1时吸附率最大。角蛋白海绵对亚甲基蓝吸附过程符合二级动力学吸附模型，以化学吸附为主。

Abstract

To tackle the problem of rabbit hair keratin resources waste, rabbit hair keratin sponges were prepared by the freeze-thawing-drying method, and their structure and morphology were characterized by infrared spectroscopy, X-ray diffraction and scanning electron microscopy. The effects of keratin concentration, initial concentration of methylene blue and adsorption time on the adsorption performance of keratin sponge were investigated using methylene blue as the solution. The results showed that the structure of keratin sponge is stable and has a uniform pore structure; the adsorption rate of keratin sponge on methylene blue increases with the increase of concentration, and the adsorption equilibrium is reached in 15 min when the concentration is 8%, and the maximum adsorption rate is found at the concentration of methylene blue of 30 mg/L^-1. The adsorption process of methylene blue by keratin sponges is consistent with a secondary kinetic adsorption model and is dominated by chemical adsorption.

Graphical abstract

关键词

角蛋白海绵 / 微观结构 / 亚甲基蓝 / 吸附性能

Key words

keratin sponge / microstructure / methylene blue / absorbability

角蛋白主要由碳、氢、氧、氮、硫元素以及其他微量元素组成，是一种由多种氨基酸组成的硬质蛋白，多种氨基酸通过二硫键、氢键、离子键和疏水作用连接，属于外胚层分化细胞中的结构蛋白，广泛存在于人类和动物的器官中，包括表皮、蹄、角、毛、羽毛和蛋白质纤维^[1]。兔毛作为典型的特种动物纤维，资源丰富，价格低廉，是一种由角蛋白、微量色素以及灰分等组成的蛋白质纤维，其中，角蛋白含量高达90%以上^[2]。然而，兔毛由于特殊的髓质层和鳞片层结构，导致其可纺性能较差，每年在纺纱过程中都会产生大量兔毛废料，造成严重的资源浪费和环境污染，因此，将兔毛废料转化为有用的角蛋白材料引起越来越多的关注。

从兔毛中提取的角蛋白，由于胱氨酸的二硫键破坏形成大量游离巯基，这些游离巯基可以自氧化重新形成二硫键，氨基和羧基可以结合形成氢键，以及侧链基团之间相互作用可以形成离子键，具有自组装和聚合成多孔材料的内在能力^[3]。鉴于以上优点，近年来许多研究采用化学水解、氧化、还原等方法提取角蛋白^[4-6]，并尝试将角蛋白制备成多孔材料（凝胶和支架）、薄膜和纤维材料。角蛋白海绵具有三维多孔网络结构，无毒、高度柔性和亲水性，为染料及悬浮固体的去除提供了可能性。亚甲基蓝是一种广泛使用的阳离子染料，是水溶性染料的典型代表，工业上常用亚甲基蓝与氯化锌形成的复盐对纤维素纤维进行印染，印染后的废水处理不当会严重污染环境。

采用自制的兔毛角蛋白，在未添加任何化学试剂的条件下通过冻融法制备纯的角蛋白凝胶，并进行冻干处理得到海绵，对制备的角蛋白海绵结构进行了详细的表征，以亚甲基蓝为代表，探讨了角蛋白海绵的吸附性能。

1 实验部分

1.1 实验材料与仪器

材料：兔毛角蛋白（自制）

仪器：扫描电子显微镜(650 FEG, FEI Quanta)；傅里叶红外光谱仪(IR Affinity-1 FTIR，Shimadzu)；D/MAX-2500/PC X射线衍射仪（日本理学公司）；LGJ-12A真空冷冻干燥机（北京四环起航科技有限公司）；低温恒温槽（深圳瑞雪制冷设备有限公司）。

1.2 样品的制备

1）取定量角蛋白粉末加入去离子水分别配制成不同浓度的溶液，将配制好的角蛋白溶液取2.5 mL为一份，每个浓度取若干份放入24孔细胞板。

2）冷冻处理。将细胞板放置在低温恒温槽中，可调温度范围为0~-120 ℃，调整低温恒温槽温度到指定冷冻温度，角蛋白溶液在该冷冻条件下保存12 h。

3）解冻处理。冷冻后的样品放置在恒温箱中，调节解冻温度为4 ℃时，解冻时间为12 h，角蛋白溶液经过多次冻融循环后制备水凝胶。

4）角蛋白水凝胶冻干处理。将角蛋白水凝胶放置在真空冷冻干燥机中，在-80 ℃下冻干制得体积为13.67 cm³的角蛋白海绵，用于吸附测试，水凝胶在-80 ℃的环境下干燥，避免了抽真空对其形貌带来的影响。

1.3 样品的表征

利用傅里叶红外光谱仪对角蛋白海绵的化学结构进行了表征，红外光谱记录的波数范围为4 000~400 cm^-1，分辨率为4.0，每个试样扫描100次。用Cu Kα辐射源X射线衍射仪测定了角蛋白海绵的晶体结构，扫描速度为3°/min，步长为0.02°，扫描角范围为5°~60°。

采用FEI Quanta 650FEG型扫描电子显微镜(SEM)观察角蛋白海绵的形貌。将角蛋白海绵用锋利的刀片切成厚度为0.5 cm的薄片，露出干净的截面，切片样在18 mA下进行金溅射，在20 kV加速电压下进行扫描。

利用Nano Measurer粒径分析计算软件从扫描电镜图像中测量了角蛋白海绵微结构的孔径大小，对于孔的形状趋向于矩形的试样，选取每个孔的最长距离进行测量。每个试样测量100个孔，计算不同孔径范围内的孔占所有孔的比例。

采用无水乙醇液体置换法测定角蛋白海绵的孔隙度。将试样放入一定体积(V₁)的乙醇中，静置1 h后，记录溶液的体积(V₂)，然后取出浸渍液体的支架，记录剩余液体体积(V₃)。角蛋白海绵的孔隙度计算公式为：

porosity=\raisebox{1ex}{$(V_{\mathrm{1}}-V_{\mathrm{3}})$}\!\left/ \!\raisebox{-1ex}{$(V_{\mathrm{2}}-V_{\mathrm{3}})$}\right.\times \mathrm{100}\mathrm{\%}（1）

1.4 吸附性能评价

吸附性能以溶液中亚甲基蓝的去除来评价。取一份角蛋白海绵分别放入10 mL配制的不同浓度的亚甲基蓝溶液中振荡吸附、过滤，取吸附溶液测定亚甲基蓝溶液吸光度，按式(2)、(3)分别计算吸附率和吸附量。同时，分别优化吸附时间，染料初始浓度及角蛋白海绵浓度对吸附性能的影响。

\eta =\frac{C_{\mathrm{0}}-C_t}{C_{\mathrm{0}}}\times \mathrm{100}（2）

Q=\frac{\left(C_{\mathrm{0}}-C_t\right)V}{m}（3）

式中，η为对染料的吸附率，%；Q为角蛋白海绵的吸附量，mg/g；C₀为染料溶液的初始浓度，mg/L；C_t 为吸附t时间后染料溶液的浓度，mg/L；V为染料溶液体积，L；m为加入角蛋白海绵的质量，g。

2 结果与分析

2.1 结构分析

角蛋白海绵在4 000~400 cm^-1范围的红外光谱如图1(a)所示，角蛋白显示出位于3 200~3 500 cm^-1范围内的酰胺A宽带可归因于―O―H和―N―H的伸缩振动，其最大吸收峰大约在3 309 cm^-1处，与C═O伸缩振动有关的酰胺I位于1 654 cm^-1处，酰胺Ⅱ带与N―H弯曲振动和C―H伸缩振动有关，吸收峰位于1 543 cm^-1和1 523 cm^-1处，以及与C―N伸缩振动相关的酰胺Ⅲ(1 238 cm^-1)，经过冻融循环-冻干处理得到的多孔材料，红外光谱显示吸收峰的位置无偏差。其中，酰胺II主要对N―H基团的环境变化敏感，因此，酰胺II带可以用来推断氢键微环境的变化。Belton研究发现强的N―H氢键基团在高频率被吸收，即高波数吸收越强，氢键基团越多^[7]。与角蛋白粉末相比，角蛋白海绵在1 543 cm^-1处的吸收峰明显高于123 cm^-1处，说明冻融后角蛋白大分子肽中的氢键缔合有不同程度的增强，这是由于在冻融循环过程中角蛋白分子之间的氢键重新形成，削弱了蛋白质分子与水分子之间的缔合。

角蛋白海绵的XRD如图1(b)所示，角蛋白海绵在9.22°和20.06°呈现典型的蛋白质衍射峰，前者归结为α-螺旋结晶衍射峰，后者归结为β-折叠结晶衍射峰。角蛋白海绵在20.06°处的衍射峰强度很高，由此可知，角蛋白海绵主要以β-折叠结构为主。与角蛋白粉末(2θ=9.52°)相比，角蛋白海绵α-螺旋结构对应的衍射角向较低的方向偏移，与此同时，角蛋白海绵β-折叠对应的衍射角为20.06°，而角蛋白粉末对应的衍射角却为19.44°，这是由于经过多次冻融循环后，角蛋白之间相互作用的增加所致。这些相互作用在一定程度上阻碍了α-螺旋向β-折叠的转换，但也为成簇的无规卷曲结构形成β-折叠提供了更多的机会。

2.2 外观形貌

孔形貌对角蛋白海绵的吸附性能影响很大，8%浓度的角蛋白海绵形貌和孔径如图2所示。角蛋白溶液经冻融干燥，由于其自组装特性，能够形成多孔结构，孔隙相互连通，沿着一定方向以恒定宽度排列，同一列的孔等间隔分布，且孔的形状基本成规则的方形，表现出明显的各向同性特征。孔径测试结果显示，试样的孔径分布相对集中，主要分布在20~80 µm之间，通过孔隙率测试，8%浓度的角蛋白海绵最高孔隙率为80.4%。

2.3 吸附性能研究

2.3.1 角蛋白海绵浓度的影响

常温下，实验设计了一个污水过滤系统，使用不同浓度的角蛋白海绵作为过滤元件，该系统显示了亚甲基蓝从其水溶液中的优异分离能力（图3）。

角蛋白海绵的孔径及孔隙率对亚甲基蓝的吸附影响很大，试验中选取5份不同浓度(2%、4%、6%、8%、10%)的角蛋白海绵，对12 mg/L的亚甲基蓝染料溶液进行吸附实验，吸附时间为150 min，比较角蛋白海绵浓度对亚甲基蓝的吸附效果，其吸附率曲线如图4所示。从图4可以看出，不同浓度的角蛋白海绵对同一浓度的亚甲基蓝吸附效果不同，吸附率结果显示，随着角蛋白海绵浓度的增加，亚甲基蓝的吸附率迅速升高，当浓度大于6%时，亚甲基蓝的吸附率为65%以上，随后增加幅度减缓，当浓度为8%时，吸附达到最大为68%。角蛋白海绵的互通空隙为亚甲基蓝的吸附提供了通道，根据文献[8]显示，浓度不同，制备的角蛋白海绵的孔径和孔隙率也不相同，浓度增加，孔径减小，孔隙率降低，所以吸附率的增加可归因于官能团的变化和孔径、孔隙率的变化。同时，角蛋白海绵含有大量含氧官能团和含氮官能团，如羟基、羧基、氨基、酰胺基等。亚甲基蓝与含氮官能团和含氧官能团之间可以通过π-π电子受体供体结合、离子交换作用和氨键结合^[9]。角蛋白浓度增加，含氮官能团和含氧官能团增加，所以亚甲基蓝的吸附量也随之增加。

2.3.2 亚甲基蓝初始浓度的影响

选取8%浓度的角蛋白海绵，吸附时间150 min，研究亚甲基蓝初始浓度对吸附性能的影响，其变化趋势如图5所示。由图5可知，在初始浓度4~30 mg/L范围内，角蛋白海绵对亚甲基蓝的吸附率η和吸附量Q都随着亚甲基蓝浓度增加呈上升趋势，当亚甲基蓝浓度为30 mg/L时，角蛋白海绵对亚甲基蓝的吸附率η达到最大为80%，吸附量Q为4.8 mg/g。由于角蛋白海绵结构中吸附位点是一定的，当亚甲基蓝增加到一定量时，吸附就会达到饱和状态。

2.3.3 吸附时间的影响

考虑到亚甲基蓝浓度与吸光度的线性关系，选择亚甲基蓝浓度为12 mg/L时，讨论吸附时间与浓度为8%的角蛋白海绵的吸附效果，结果如图6所示。在0~15 min内，随着时间的延长，角蛋白海绵的吸附率、吸附量持续增加，15 min后吸附率达到相对稳定状态，说明了角蛋白海绵的最佳吸附时间为15 min左右，此时吸附率η为66.13%，吸附量Q为1.680 5 mg/g。

用准一级动力学方程式^[10]、准二级动力学方程式^[11]分别对以上实验数据进行拟合，结果如图7所示，其动力学参数如表1所示。

\mathrm{l}\mathrm{n}\left(Q_e-Q_t\right)=\mathrm{l}\mathrm{n}{Q}_e-k_{\mathrm{1}}t(4)

\frac{t}{Q_t}=\frac{\mathrm{1}}{(k_{\mathrm{2}}\times Q_e^{\mathrm{2}})}+\frac{t}{Q_e}(5)

式中，Q_t 为t时刻的吸附量，mg/g；Q_e 为平衡时的吸附量，mg/g；k₁为拟一级吸附速率常数，min^-1；k₂为拟二级吸附速率常数，g/(mg⋅min^-1)。

由表1和图7可得出，二级动力学拟合的结果比一级动力学更好，相关系数较高为R² =0. 999 9，其理论平衡吸附量1.727 4 mg/g与实测吸附量1.726 6 mg/g更接近，即角蛋白海绵对亚甲基蓝的吸附过程符合准二级动力学模型，化学吸附起主导作用。

3 结论

1） 采用冻融-干燥技术，在不添加任何化学试剂的条件下，制备了具有均匀孔径的角蛋白海绵。通过FT-IR表征分析可知，大分子肽中有氢键形成，且角蛋白海绵的β-折叠结构增强。

2） 角蛋白海绵对亚甲基蓝的吸附研究表明，吸附率随着角蛋白海绵浓度增加而增加，其吸附准二级动力学模型显示，在亚甲基蓝浓度为12 mg/L时，最大吸附率可达68%。

3） 角蛋白海绵独特的多孔结构以及丰富的官能团特性，作为从水中去除染料的候选材料具有一定的优越性。

由于角蛋白海绵含有大量亲水基团，实验过程中发现角蛋白海绵在吸附亚甲基蓝溶液后变成胶体状态，所以是否能够重复使用还有待于继续考证。

参考文献

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基金资助

内蒙古自治区自然科学基金项目(2020LH05005)

内蒙古工业大学自然科学研究项目(ZZ201817)

内蒙古工业大学大学生创新创业

训练计划项目(2021183015)