好氧反硝化菌Pseudomonas nitroreducens PHB18的鉴定及其脱氮特性

Identification of the aerobic denitrifying bacterium Pseudomonas nitroreducens PHB18 and its characteristics of nitrogen removal

摘要

从北京市小红门污水处理厂活性污泥中筛选出一株具有高效降解硝态氮和亚硝态氮特性的好氧反硝化菌。经形态学分析和16S rRNA鉴定，将菌株命名为硝基还原假单胞菌（Pseudomonas nitritireducens）PHB18。考察了菌株PHB18的好氧反硝化特性并优化其脱氮条件。研究表明，分别以硝酸盐氮和亚硝酸盐氮为唯一氮源，在初始氮素浓度为100 mg/L的条件下，硝酸盐氮和亚硝酸盐氮的去除率分别为92.54%和99.28%，且脱氮过程中无明显中间产物累积。单因素优化环境因子实验表明，菌株PHB18在C/N为14、pH值范围在7.0~7.5、温度为30 ℃、转速为120 rpm的条件下，好氧反硝化性能最佳，其在18 h可将硝酸盐氮全部去除。硝基还原假单胞菌PHB18为强化生物脱氮工艺提供了一种新菌源。

Abstract

A strain of aerobic denitrifying bacteria with efficient degradation characteristics of nitrate and nitrite nitrogen was selected from activated sludge of Beijing Xiaohongmen Sewage Treatment Plant. The strain was named Pseudomonas nitritireducens PHB18 through morphological analysis and 16S rRNA identification. The aerobic denitrification characteristics of strain PHB18 were investigated and the optimal conditions for its nitrogen removal were determined. The study showed that at an initial nitrogen concentration of 100 mg·L^-1, the removal rates of \mathrm{N}{\mathrm{O}}_{\mathrm{3}}^{{}^{-}}-N were 92.54% with \mathrm{N}{\mathrm{O}}_{\mathrm{3}}^{{}^{-}}-N as the only nitrogen source, and the removal rates of \mathrm{N}{\mathrm{O}}_{\mathrm{2}}^{{}^{-}}-N were 99.28% with \mathrm{N}{\mathrm{O}}_{\mathrm{2}}^{{}^{-}}-N as the only nitrogen source. There was no significant accumulation of intermediates in either denitrification process. The single-factor optimization test showed that the strain PHB18 had the best aerobic denitrification performance under the conditions of C/N ratio of 14, pH range of 7.0~7.5, temperature of 30 ℃, and rotational speed of 120 rpm, and it could remove all nitrate nitrogen in 18 h.The Pseudomonas nitritireducens PHB18 provides a new source of bacteria for the enhanced biological nitrogen removal.

Graphical abstract

关键词

硝基还原假单胞菌 / 好氧反硝化 / 生物脱氮 / 单因素

Key words

Pseudomonas nitritireducens / aerobic denitrification / biological denitrification / single-factor

过量硝态氮排放至地表水中会加剧如水体富营养化等威胁水体生态环境的问题^[1]。生物反硝化技术较物理法、化学法更具经济效益和环境效益，成为污水处理厂去除水体中氮素的主要技术手段^[2]。传统反硝化菌一般为异养兼性厌氧菌，其与自养好氧型硝化菌的生态位存在明显差异，故两类微生物通常在独立构筑物中运行^[3]。

好氧反硝化菌的发现及应用，使得硝化和反硝化过程得以同时间、同空间进行，从微生物层面实现了同步脱氮除碳。好氧反硝化菌较传统反硝化菌有着生长活性高、反应周期短、脱氮高效等优势，其在一定程度上弥补了传统生物脱氮工艺中耐负荷冲击能力较差、基建和运行成本较高等缺陷^[4]。好氧反硝化技术在治理水体氮污染问题中有着重要研究价值和应用潜力。当前，有关好氧反硝化技术的研究多以生物强化为主，即添加自然环境中存在较少的好氧反硝化菌剂并让其定植于活性污泥系统内，用以强化脱氮性能。Hong等^[5]将Pseudomonas mendocina IHB602接种于序批式生物膜反应器内，有效提高了反应器中生物膜的形成速率和脱氮效率。Lang等^[6]将好氧反硝化菌Acinetobacter sp. YS2扩培后投至5 L SBR中处理模拟石化废水，反应器稳定运行时菌株YS2成为优势菌种。Yu等^[7]将Pseudomonas brassicacearum LZ-4固定在海藻酸钠-高岭土制成的固定化小球上，用以抵抗六价铬对活性污泥系统的“冲击”。研究表明，好氧反硝化菌LZ-4的成功定植和生物强化促进了SBR反应器内微生物对Cr(Ⅵ)的还原和吸收，削减了Cr(Ⅵ)对反硝化的抑制作用，改善了反硝化系统运行的稳定性。此前文献中，对硝基还原假单胞菌的好氧反硝化性能报道较少。分离并研究该种菌株的好氧脱氮特性对进一步探索该类型菌株的应用潜能具有重要意义。

本课题从活性污泥中分离出一株具备高效降解硝态氮和亚硝态氮特性的好氧反硝化菌Pseudomonas nitritireducens PHB18，对其生理生化特性和好氧反硝化特性进行了研究，并优化了其环境因子，以期为好氧反硝化强化生物脱氮技术提供新菌种。

1 材料与方法

1.1 样品来源及培养基

菌株源自北京市小红门污水处理厂A²/O生物处理二沉池的回流污泥。

硝酸盐DM1培养基：0.64 g/L CH₃COONa，0.72 g/L KNO₃，10.60 g/L Na₂HPO₄·12H₂O，1.50 g/L KH₂PO₄，0.05 g/L MgSO₄，2 mL 微量元素。

硝酸盐DM2培养基：1.79 g/L CH₃COONa，0.72 g/L KNO₃，10.60 g/L Na₂HPO₄·12H₂O，1.50 g/L KH₂PO₄，0.05 g/L^{MgSO₄，2 mL 微量元素。}

亚硝酸盐培养基：1.79 g/L CH₃COONa，0.49 g/L NaNO₂，10.60 g/L Na₂HPO₄·12H₂O，1.50 g/L KH₂PO₄，0.05 g/L MgSO₄，2 mL微量元素。

微量元素溶液：50.00 g/L EDTA，3.92 g/L ZnSO₄·7H₂O，5.50 g/L CaCl₂，1.10 g/L (NH₄)6Mo₇O₂₄·4H₂O，5.06 g/L MnCl·4H₂O，5.00 g/L FeSO₄·7H₂O，1.57 g/L CuSO₄·5H₂O，1.61 g/L CoCl₂·6H₂O。

固体培养基加入1.75% (W/W)琼脂粉。调节以上培养基最终pH值为7.0~7.2，并在121 ℃压力蒸汽灭菌器内湿热灭菌15 min后备用。上述化学试剂均为分析纯级。

1.2 好氧反硝化菌的分离鉴定

1.2.1 分离与筛选

将5 mL样品污泥加至0.9% (W/W) 95 mL生理盐水中振荡混匀。采用稀释涂布法将稀释的样品涂布至硝酸盐DM1固体培养基平板上，之后放于30 ℃生化培养箱培养60 h。挑取平板上形态不同的单菌落纯化3~4次，然后将各菌落分别接种于100 mL的DM1液体培养基和亚硝酸盐液体培养基中，放入全温振荡培养箱，并在30 ℃、140 rpm的条件下培养。定时取样，测定各样品中硝酸盐、亚硝酸盐、COD浓度及OD₆₀₀，最终筛选出一株具有高效降解硝酸盐和亚硝酸盐特性的好氧反硝化菌PHB18。将该菌株纯化数次至形态和脱氮效果稳定，用40% (V/V)甘油保藏菌种于-80 ℃超低温冰箱内^[5]。

1.2.2 形态学特征鉴定观察

挑取菌体至DM2固体培养基上平板划线，并将其置于30 ℃恒温培养箱内培养2~3 d。采用场发射环境扫描电子显微镜（Quanta FEG250，美国FEI）观察菌株的形态尺寸并对菌株进行革兰氏染色。采用光学显微镜（BX51，日本Olympus）观察染色结果。

1.2.3 16S rDNA鉴定

将菌株PHB18挑至DM2液体培养基中，连续培养12 h (30 ℃，140 rpm)，在4 ℃、12 000 rpm条件下离心5 min后收集菌体，并用无菌PBS缓冲溶液中重复冲洗3次，离心获取菌泥。采用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取DNA。将提取的DNA作为模板，使用通用引物27F/1492R进行PCR扩增^[6]，PCR反应体系和循环程序分别见表1和表2，并制作1.2%的琼脂糖进行凝胶电泳。扩增产物送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。将测得的序列与NCBI网站中的GenBank数据库已有菌株序列进行16S rDNA同源性比对，并下载与PHB18同源性较高的序列，使用MEGA软件构建菌株的系统发育树。

1.3 菌株好氧反硝化性能的检测

将菌株PHB18挑至DM2液体培养基中培养12 h(30 ℃，140 rpm)至对数期，离心(8 000 rpm，5 min)收集菌体，随后用无菌PBS缓冲溶液反复冲洗并制成OD₆₀₀约0.45 A的菌悬液作为实验接种液。取2 mL接种液，分别接种于装有98 mL已灭菌的硝酸盐培养基和亚硝酸盐培养基的锥形瓶中，并用无菌透气封口膜密封。在初始pH为7.2，温度30 ℃，摇床转速140 rpm的条件下连续培养48 h，并定时取样，测定菌液OD₆₀₀值和上清液中硝酸盐氮、亚硝酸盐氮、氨氮、COD浓度，以此表征菌株PHB18的好氧反硝性能。设置三个平行实验。

1.4 单因素法优化脱氮条件

采用单因素实验确定菌株PHB18在各环境因子（C/N、pH值、温度、转速）下的最佳生长及脱氮条件。实验原始环境条件为硝酸盐氮浓度100 mg/L、C/N=14、pH值为7.1。将2 mL活化后的菌液接种于98 mL DM2培养基中，连续培养18 h (30 ℃，120 rpm)，测定样本的OD₆₀₀值和硝酸盐氮、亚硝酸盐氮浓度。通过改变乙酸钠的投加量，将C/N分别调至8、10、12、14、16；调节初始pH值依次为：6、6.5、7、7.5、8、8.5；控制培养箱温度分别为：20、25、30、35、40 ℃；设置培养箱转速分别为：80、100、120、140、160 rpm，用以调控反应体系中溶解氧含量，并检测对数期体系内溶解氧的含量。上述所有实验除改变单影响因子外，其余实验的初始条件均保持不变。实验设置三个平行样。

1.5 分析方法

NO{}_{\mathrm{3}}^{-}-N测定采用麝香草酚分光光度法，NO{}_{\mathrm{2}}^{-}-N测定采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法，NH{}_{\mathrm{4}}^{+}-N测定采用纳氏试剂比色法，总无机氮(Total inorganic nitrogen，TIN)浓度采用上述三种氮素浓度加和进行计算。COD测定采用重铬酸钾法。pH值、DO、温度使用WTW/Multi3620便携式测定仪测定。

通过计算氮素降解平均速率及去除率[式(1)和式(2)]，对菌株的脱氮性能进行表征。

v=\frac{C_{\mathrm{0}}-C_i}{t_i-t_{\mathrm{0}}}(1)

n=\frac{C_{\mathrm{0}}-C_i}{C_{\mathrm{0}}}\times \mathrm{100}(2)

式中：v为菌株氮素降解平均速率，mg/L·h^-1；n为菌株氮素去除率，%；t₀、t_i 分别为菌株培养某时段初始时刻和结束时刻，h；C₀、C_i 分别为t₀、t_i 时刻对应样品氮素浓度，mg/L。

通过计算好氧反硝化菌的比生长速率[式(3)]，进一步表征其生长代谢性能。使用分光光度计（波长600 nm）测量细胞密度(OD₆₀₀)并采用干重法获得细胞干重(DCW，mg/L)^[8]，以此表征某时刻细菌生物量，间接检测细菌生长活性。

\mu =\frac{\mathrm{l}\mathrm{n}{A}_i-\mathrm{l}\mathrm{n}{A}_{\mathrm{0}}}{t_i-t_{\mathrm{0}}}(3)

式中：μ为菌株的比生长速率，h^-1；A_{\mathrm{0}}为t₀时刻对应细胞浓度，mg/L；A_i为t_i 时刻对应细胞浓度，mg/L。

2 结果与讨论

2.1 菌株的分离与鉴定

通过分离纯化和好氧反硝化功能检测，最终分离得到氮素降解效果最好且硝酸盐去除速率和生长性能最优的菌株，命名为PHB18。其在DM2固体培养基上的群落形态如图1(a)，为白色半透明、边缘不规则圆形，表面褶皱黏稠湿润。

扫描电镜放大2万倍后的细胞形态如图1(b)，呈短杆状、无鞭毛，直径尺寸约300 nm，长度约800~1 000 nm。菌体革兰氏染色后在显微镜下观察（如图2所示）呈红色短杆状，表明PHB18为革兰氏阴性菌。

以菌株PHB18的基因组DNA为模板，采用细菌16S rRNA的通用引物27F/1492R进行扩增，图3为其扩增产物的凝胶电泳检测图谱(Marker：DM3000)。将菌株PCR扩增产物的测序结果与Genbank中已有菌株基因序列对比。结果表明，菌株与库中Pseudomonas nitritireducens WZBFD3-5A2的同源性为100%，因此将该菌种归为硝基还原假单胞菌属(Pseudomonas nitritireducens)。根据菌株的产物序列和已公开的好氧反硝化菌以及同源性较高菌株的16S rRNA部分序列，采用邻接法构建系统发育树，如图4所示。将菌株的序列提交至Genbank基因库，注册获得登录号为OM691455.1。

2.2 菌株的好氧反硝化特性

以硝酸盐氮为唯一氮源时，NO{}_{\mathrm{3}}^{-}-N和COD起始浓度分别为(104.93±2.03) mg/L和(1 532.4±34.21) mg/L，菌株PHB18降解硝酸盐过程中各指标的变化如图5所示。从图5(a)可见，经6 h的迟滞期后，菌株开始快速繁殖，进入对数生长期(6~18 h)，其平均比生长速率为0.286 h^-1，在此过程中COD和硝酸盐氮迅速消减降解，最大降解速率分别为216.80 mg/L·h^-1和7.41 mg/L·h^-1，在21 h时OD₆₀₀达到最大值(0.731±0.012) A。本实验全程没有检测出明显的亚硝酸盐氮积累(<0.6 mg/L)，这可能是由于菌株NIR活性较高，反硝化过程产生的亚硝酸盐氮被迅速还原，转化成其他氮氧化物气体和N₂。相比于Zhang等^[8]所报道的菌株Pseudomonas balearica RAD-17反应过程中出现亚硝酸盐氮积累(8.79±0.80) mg/L，以及Acinetobacter junii NP1在降解硝态氮过程中存在亚硝态氮无法及时转化，其最大积累量为8.52 mg/L，总氮去除率为86.24%^[9]，菌株PHB18具备更好的降解硝态氮的性能。稳定期24 h时，菌株的硝酸盐、TIN、COD去除率最高，分别为92.54%、91.75%、89.98%。随后细菌开始进入衰退期(27~48 h)，随着OD₆₀₀值的下降，水样中NO{}_{\mathrm{3}}^{-}-N、NH{}_{\mathrm{4}}^{+}-N浓度均略有上升，48 h时的NO{}_{\mathrm{3}}^{-}-N和TIN去除率分别为92.02%和90.31%，而氨氮仅在该阶段被检测到 (0.1~1 mg/L)，其原因可能是细胞衰老释放出胞内氮^[10]。

以亚硝酸为唯一氮源时，NO{}_{\mathrm{2}}^{-}-N和COD起始浓度分别为(101.82±2.27) mg/L和(1 533.75±24.47) mg/L，菌株PHB18还原亚硝酸盐氮的过程中，各指标的变化如图5(b)所示，相比于以硝酸盐氮为氮源，菌株PHB18降解亚硝态氮时有较长的停滞期 (0~12 h)，其原因可能是亚硝酸盐浓度过高，对菌株具有一定的毒性，抑制其生长代谢。菌株在对数期 (12~24 h)时迅速分裂，从(0.025±0.005) A增至(0.624±0.016) A，平均比生长速率为0.258 h^-1，COD和亚硝态氮在此阶段被迅速去除，最大去除速率分别为141.83 mg/L·h^-1和14.04 mg/L·h^-1。菌株在27 h时进入稳定期，生物量达到最大值为(0.639±0.010) A，对应其水样NO{}_{\mathrm{2}}^{-}-N、NO{}_{\mathrm{3}}^{-}-N、NH{}_{\mathrm{4}}^{+}-N和COD浓度为(0.73±0.09) mg/L、(0.02±0.01) mg/L、(0.45±0.02) mg/L和(170.65±8.83) mg/L，NO{}_{\mathrm{2}}^{-}-N、TIN和COD去除率达到最大值，分别为99.28%、98.82%和88.87%，随后由于有机碳匮乏耗尽，菌株进入内源代谢阶段，细菌死亡率增加，OD₆₀₀值逐渐下降，反硝化不彻底和细胞裂解等因素使样品亚氮和氨氮浓度略有上升，最终NO{}_{\mathrm{2}}^{-}-N和TIN去除率分别为99.12%和96.50%。菌株PHB18去除亚硝酸盐性能优于大多已被报道的好氧反硝化菌。在初始亚硝酸盐浓度为100 mg/L的有氧条件下，Pseudomonas mendocina X49产生了6.76 mg/L的氨氮^[11]，Acinetobacter sp. Y1亚硝态氮最终去除率为80.5%^[12]，Acinetobacter junii NP1的总氮和亚硝态氮最终去除率分别为88.31%和91.40%^[9]。

2.3 菌株好氧反硝化条件的优化

2.3.1 C/N

对于异养反硝化菌而言，C/N是影响其能量代谢的重要因素。C/N对菌株PHB18细胞增殖和反硝化性能的影响如图6所示。结果表明，菌株PHB18在高C/N条件具备良好的脱氮性能，其在C/N为14和16的条件下，均可实现氮素的完全降解，这暗示了其在处理高C/N废水，如养殖废水方面，具有可观的应用潜能。在对微生物脱氮及生长效果相当的情况下，过量乙酸钠将会导致碳源浪费，因此，选用C/N为14作为菌株PHB18的最佳碳氮比。

2.3.2 pH值

不同初始pH值条件下，菌株PHB18的细胞生长和硝酸盐去除率情况如图7所示。实验表明，菌株PHB18在pH值为7~8.5时的硝酸盐降解性能良好，但通过检测样品中的亚硝态氮浓度发现，菌株的亚硝酸盐还原酶对pH值较为敏感，其在初始pH值为8和8.5条件下分别有11.54 mg/L和16.74 mg/L的亚硝酸盐被释放且无法被进一步还原，而在pH值为6~7.5时未检测出亚硝酸盐氮。总的来说，菌株PHB18在中性和弱碱性环境下，脱氮性能良好，其最适pH值为7~7.5。

2.3.3 温度

反硝化细菌通过反硝化酶系将硝态氮催化还原成亚硝态氮等氮氧化合物或N₂，其功能酶活性受温度影响显著^[13]。图8显示了培养箱温度为20~40 ℃时，其对菌株PHB18生物量和反硝化能力的影响。实验结果表明，菌株PHB18的代谢性能受温度影响显著，其在20、40 ℃其氮代谢和生长代谢均受到严重抑制，尤其在40 ℃时，OD₆₀₀值仅为0.016 A，细菌活性几乎被完全抑制。菌株PHB18的脱氮性能与细胞增殖在30~35 ℃时达到最优值，这与已公开的好氧反硝化菌类似^[14-18]。考虑35 ℃时所需能耗较大，故选用30 ℃作为菌株PHB18的最佳温度。

2.3.4 转速（溶解氧）

无论作为外界环境条件还是作为电子受体，溶解氧对好氧反硝化过程影响显著^[4,19-20]。本研究通过调控振荡培养箱转速参数控制溶解氧。图9结果显示，80~160 rpm条件下菌株PHB18的生长活性随转速的增加升高，160 rpm时OD₆₀₀值为0.580 A，其对应细胞浓度为473.61 mg DCW/L，是80 rpm时的3.37倍。但其反硝化性能在过低或过高的转速条件下表现不佳。转速为80 rpm时，菌株PHB18在对数期存在较长时间的缺氧阶段（溶解氧<0.5 mg/L），细菌的生长代谢能力欠佳，这导致氮素降解缓慢，第18 h时去除了97%的硝酸盐氮。在转速为100、120 rpm时菌株降解硝态氮的能力优越，18 h内将硝酸盐全部去除，其对数期溶解氧含量为0.3~1.8 mg/L。反应体系内溶解氧含量过高时，细菌反硝化功能受抑制。在转速为140 rpm或160 rpm时，反应体系内的溶解氧从初始8.97 mg/L，到对数期降至最低，分别为2.98 mg/L和5.84 mg/L。分析其原因可能为：过高的溶解氧使得菌株PHB18将更多的电子由复合体Ⅰ转移至细胞色素aa3，表现出生长活性提高，反硝化性能减弱的生理现象。综合考量，菌株PHB18的最适转速为120 rpm。

3 结论

1) 从污水厂回流污泥中分离出好氧反硝化菌PHB18，其菌落呈半透明不规则圆形，细胞形态呈短杆状，为革兰氏阴性菌。结合16S rRNA鉴定和同源性分析，将其归为Pseudomonas nitritireducens属。

2) 菌株PHB18具有高效好氧反硝化的能力。以乙酸钠为碳源，初始氮素浓度为100 mg/L条件下，采用硝酸盐为唯一氮源时，菌株PHB18在24 h时NO{}_{\mathrm{3}}^{-}-N、TIN和COD去除率分别为92.54%、91.75%和89.98%，脱氮过程无明显NH{}_{\mathrm{4}}^{+}-N和NO{}_{\mathrm{2}}^{-}-N积累，对数期平均比生长速率为0.286 h^-1；采用亚硝酸盐为唯一氮源时，27 h时NO{}_{\mathrm{2}}^{-}-N、TIN和COD去除率分别达到99.28%、98.82%和88.87%，脱氮过程中无明显NH{}_{\mathrm{4}}^{+}-N和NO{}_{\mathrm{3}}^{-}-N积累，对数期平均比生长速率为0.258 h^-1。

3) 单因素优化环境因子实验表明，菌株PHB18的最佳脱氮条件为：C/N为14，pH值范围在7.0~7.5，温度为30 ℃，转速为120 rpm，此时好氧反硝化性能最佳，可在18 h内将硝酸盐全部降解。

参考文献

[1] CAMARGO J A, ALONSO A. Ecological and toxicological effects of inorganic nitrogen pollution in aquatic ecosystems: a global assessment[J]. Environment International, 2006, 32(6): 831-849.

[2] ZHANG S, ALI A, SU J F, et al. Performance and enhancement mechanism of redox mediator for nitrate removal in immobilized bioreactor with preponderant microbes[J]. Water Research, 2022, 209: 117899.

[3] RAJTA A, BHATIA R, SETIA H, et al. Role of heterotrophic aerobic denitrifying bacteria in nitrate removal from wastewater[J]. Journal of Applied Microbiology, 2020, 128(5): 1261-1278.

[4] SONG T, ZHANG X, LI J, et al. A review of research progress of heterotrophic nitrification and aerobic denitrification microorganisms (HNADMs)‍[J]. Science of the Total Environment, 2021, 801: 149319.

[5] HONG P, WU X Q, SHU Y L, et al. Bioaugmentation treatment of nitrogen-rich wastewater with a denitrifier with biofilm-formation and nitrogen-removal capacities in a sequencing batch biofilm reactor[J]. Bioresource Technology, 2020, 303: 122905.

[6] LANG X D, LI Q W, JI M M, et al. Isolation and niche characteristics in simultaneous nitrification and denitrification application of an aerobic denitrifier, Acinetobacter sp. YS2[J]. Bioresource Technology, 2020, 302: 122799.

[7] YU X, SHI J J, KHAN A, et al. Immobilized-microbial bioaugmentation protects aerobic denitrification from heavy metal shock in an activated-sludge reactor[J]. Bioresource Technology, 2020, 307: 123185.

[8] ZHANG Y, WANG X J, WANG W Q, et al. Investigation of growth kinetics and partial denitrification performance in strain Acinetobacter johnsonii under different environmental conditions[J]. Royal Society Open Science, 2019, 6(12): 191275.

[9] 杨垒, 陈宁, 任勇翔, 等. 异养硝化细菌Acinetobacter junii NP1的同步脱氮除磷特性及动力学分析[J]. 环境科学, 2019, 40(8): 3713-3721.

[10] WANG X J, WANG W Q, ZHANG Y, et al. Simultaneous nitrification and denitrification by a novel isolated Pseudomonas sp. JQ-H3 using polycaprolactone as carbon source[J]. Bioresource Technology, 2019, 288: 121506.

[11] RUAN Y, TAHERZADEH M J, KONG D, et al. Nitrogen removal performance and metabolic pathways analysis of a novel aerobic denitrifying halotolerant pseudomonas balearica strain RAD-17[J]. Microorganisms, 2020, 8(1): 72.

[12] XIE F X, THIRI M, WANG H. Simultaneous heterotrophic nitrification and aerobic denitrification by a novel isolated Pseudomonas mendocina X49[J]. Bioresource Technology, 2021, 319: 124198.

[13] LIU Y X, HU T T, SONG Y J, et al. Heterotrophic nitrogen removal by Acinetobacter sp. Y1 isolated from coke plant wastewater[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2015, 120(5): 549-554.

[14] FANG H, OLSON B H, ASVAPATHANAGUL A, et al. Molecular biomarkers and influential factors of denitrification in a full-scale biological nitrogen removal plant[J]. Microorganisms, 2019, 8(1): 11.

[15] ZHAO B, CHENG D Y, TAN P, et al. Characterization of an aerobic denitrifier Pseudomonas stutzeri strain XL-2 to achieve efficient nitrate removal[J]. Bioresource Technology, 2018, 250: 564-573.

[16] HUANG T L, GUO L, ZHANG H H, et al. Nitrogen-removal efficiency of a novel aerobic denitrifying bacterium, Pseudomonas stutzeri strain ZF31, isolated from a drinking-water reservoir[J]. Bioresource Technology, 2015, 196: 209-216.

[17] 杜丛, 崔崇威, 邓凤霞, 等. 基于响应面法对一株好氧反硝化菌脱氮效能优化[J]. 微生物学通报, 2015, 42(5): 874-882.

[18] BARMAN P, BANDYOPADHYAY P, KATI A, et al. Characterization and strain improvement of aerobic denitrifying EPS producing bacterium Bacillus cereus PB88 for shrimp water quality management[J]. Waste and Biomass Valorization, 2018, 9(8): 1319-1330.

[19] REN J, MA H, LIU Y, et al. Characterization of a novel marine aerobic denitrifier Vibrio spp. AD2 for efficient nitrate reduction without nitrite accumulation[J]. Environmental Science and Pollution Research, 2021, 28: 30807-30820.

[20] FENG L, YANG J X, MA F, et al. Characterisation of Pseudomonas stutzeri T13 for aerobic denitrification: stoichiometry and reaction kinetics[J]. Science of the Total Environment, 2020, 717: 135181.

基金资助

江苏省自然科学基金项目(BK20210896)