外泌纤维素酶大肠杆菌ZH-4菌株中Ⅱ型分泌蛋白的生物信息学分析

Bioinformatics analysis of type Ⅱ secreted proteins in exocellulase Escherichia coli ZH-4

摘要

大肠杆菌作为一种重要的微生物工程研究对象，有着广泛的应用前景。课题组前期首次在牛胃中筛选分离出一株可以分泌胞外纤维素酶BcsZ的大肠杆菌ZH-4（Escherichia coli ZH-4，ZH-4）。经推测其纤维素酶可能是通过Ⅱ型分泌系统（type Ⅱ secretions system，T2SS）向胞外分泌。为明确ZH-4中存在的Ⅱ型分泌系统蛋白的数量、信号肽和跨膜结构域等信息是否与其他细菌有遗传关系，将数据库中的细菌T2SS分泌蛋白序列与ZH-4进行序列比对，筛选出7个候选的Ⅱ型分泌蛋白，并通过各种预测软件分析蛋白的亚细胞定位、跨膜结构域、信号肽、理化性质、二级结构和三级结构等特征。通过对ZH-4中可能存在的Ⅱ型分泌蛋白进行预测，为深入开展ZH-4中Ⅱ型分泌蛋白的功能研究提供基础。

Abstract

Escherichia coli is a crucial bacterium in microbial engineering research due to its extensive application space. A strain of Escherichia coli ZH-4 (ZH-4) was discovered in the bovine stomach by the research group and is known to produce cellulase BcsZ. It is believed that this cellulase may be secreted extracellularly through the type Ⅱ secretory system (T2SS). To investigate the number of T2SS inZH-4, including their signal peptides, transmembrane domains, and genetic relationships with other bacteria, this study gathered sequence information on bacterial T2SS secreted proteins in the database and compared these sequences with the ZH-4 genome. The results showed that 7 candidate T2SS secreting proteins were obtained and predicted the subcellular localization, transmembrane domains, signal peptide, physical and chemical properties, secondary structure, and tertiary structure. The possible existence of T2SS protein in ZH-4 was predicted to provide a basis for further research on the function of T2SS protein inZH-4.

Graphical abstract

关键词

大肠杆菌 / 外泌纤维素酶 / Ⅱ型分泌蛋白 / 生物信息学预测

Key words

Escherichia coli / exocellulase / type Ⅱ secreted protein / bioinformatics prediction

纤维素是一类由葡萄糖通过β-1，4糖苷键组成的化合物，是构成植物细胞壁的主要物质。随着石油等不可再生资源的日渐枯竭，开发新型可再生资源受到越来越多关注。天然纤维素是由植物合成的，是自然界存在最广泛的可再生有机物，作为供能物质开发前景巨大。目前处理纤维素的主要方法有物理法、化学法和生物酶处理法。其中，生物酶处理法具有绿色、高效等特点，是最具有潜力的处理方法。

原核纤维素降解微生物以细菌和放线菌为主。细菌的主要来源菌属为纤维黏菌属、芽孢杆菌属、热双歧菌属和欧文氏菌属^[1]等。其中，纤维黏菌属、芽孢杆菌属、欧文氏菌属是最常见的致病菌，具有一定毒性，分泌单一酶，应用pH值范围小，酶活低，产量低，提纯难度高，且多为胞内酶。而大肠杆菌是埃希氏菌属中最为常见的微生物，具有广泛的应用前景和较高的改造价值。Pang等^[2]在牛瘤胃中分离得到一株可以外泌β-1，4内切葡聚糖酶的ZH-4，这是首次筛选得到可以向胞外分泌纤维素酶的大肠杆菌，其向胞外分泌纤维素酶的能力，可以解决目前主流纤维素酶生产菌难以分离纯化的问题，应用前景巨大。前期工作已经确定该内切葡聚糖酶的分泌属于两步法，且Sec (General secretory pathway)系统在分泌过程中起到关键作用，研究^[3]表明，Ⅱ型分泌系统(type Ⅱ secretions system，T2SS)在多种微生物中参与纤维素酶的分泌，由此推测ZH-4的内切葡聚糖酶也可能通过T2SS向胞外分泌，因此，探究ZH-4中通过T2SS途径分泌的蛋白及其特征意义较大。

自20世纪80年代克雷伯氏菌属被发现以来，T2SS已在假单胞菌属、气单胞菌属、欧文氏菌属、黄单胞菌属、弧菌属和产肠毒素大肠杆菌等^[4]菌株中被鉴定和研究，为T2SS的组成和分子组织研究提供了帮助。迄今为止，基因组研究表明，在数百种细菌中存在T2SS，这些细菌属于变形菌门所有纲，但也包括衣原体、螺旋体或蓝细菌等其他主要类群。革兰氏阴性菌具有多种对其生存和致病有重要意义的蛋白分泌系统。其中，T2SS是与其生命活动相关最密切的分泌系统之一。

T2SS操纵子包含12~13个经常排列在单个操纵子中的基因，命名为gspC~gspO。T2SS可进一步细分为3个亚复合体：1) 外膜复合体，包括gspD形成的分泌通道和类菌毛gspS；2) 一个称为组装平台的内膜复合物，包括gspC、gspF、gspL、gspM和细胞质ATP酶gspE；3) 假菌毛，构成主要的假菌毛蛋白gspG，以及次要的假菌毛蛋白gspH、gspI、gspJ和gspK。前菌毛素肽酶gspO嵌入内膜，将假菌毛蛋白gspH、gspI、gspJ和gspK加工为成熟形式，为假菌毛组装做好准备。

T2SS底物的显著特征是存在一个N端信号序列，通过Sec或双精氨移位酶(twin-arginine translocase，Tat)蛋白输出系统将其靶向到周质空间中。Sec底物在伴侣蛋白、Dsb (Disulfide bond)氧化还原酶和钙离子的辅助下，以线性多肽的形式输出，以适应其在周质空间的天然状态。T2SS是已知Tat底物的唯一出路。在大肠杆菌中，对产肠毒素大肠杆菌(ETEC)的T2SS分泌蛋白研究较多，其产生的LT-IIb热不稳定肠毒素ⅡA亚单位前体利用T2SS向胞外分泌。大肠杆菌通过T2SS产生的YodA蛋白参与了该菌对上皮细胞的黏附和肠道定植^[5]。大肠杆菌K-12 (K-12)菌株内也存在Ⅱ型分泌蛋白，但在实验室培养条件下不表达。研究表明，在K-12菌株H-NS蛋白沉默突变子中成功通过T2SS向胞外表达了几丁质酶ChiA^[6]。

本研究通过对已完成基因组测序和蛋白功能注释的ZH-4基因组进行Ⅱ型分泌蛋白的检索，将其与NCBI数据库中的Ⅱ型分泌蛋白序列进行比对，筛选出与ZH-4同源的Ⅱ型分泌蛋白并明确其数量。同时，对Ⅱ型分泌蛋白的结构域、理化性质、二级结构、三级结构和亲缘关系进行研究，为进一步开展ZH-4外泌纤维素酶的研究提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 数据来源

ZH-4的基因测序采用二代Illumina平台测序技术，得到的测序结果以MG1655参考序列作为对照，将获得的原始测序结果与其进行比对，该测序结果已上传至GenBank数据库中保存，登录号为SRR11659053。

T2SS的分泌蛋白底物见表1，基因序列由National Center for Biotechnology Information (NCBI)网站获得。

1.2 实验方法

1.2.1 基因结构分析

利用ecocyc的基因组浏览器(https://biocyc.org/)对各个T2SS基因进行注释，查看ZH-4和其他微生物的T2SS基因结构。

1.2.2 同源T2SS分泌蛋白序列对比

通过NCBI Blast将表1中的T2SS分泌蛋白序列与ZH-4基因组进行比对，采用缺省阈值输出比对结果。

1.2.3 T2SS分泌蛋白中保守结构域分析

通过SMART网站(https://smart.embl.de/)对ZH-4中T2SS分泌蛋白具有的保守结构域进行预测分析。

1.2.4 T2SS分泌蛋白的疏（亲）水性、理化性质预测

利用Protscale程序(https://web.expasy.org/prot scale/)对ZH-4中所含T2SS分泌蛋白进行理化性质分析。

1.2.5 T2SS分泌蛋白的转运肽、信号肽预测

利用SignalP 6.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-6.0/)进行氨基酸信号肽的预测。

1.2.6 T2SS分泌蛋白的高级结构和跨膜区结构分析

通过PHD (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_ automat.pl?page=/NPSA/npsa_phd.html)网站对ZH-4中所含Ⅱ型分泌蛋白的二级和三级结构进行预测分析。通过Transmembrane Hidden Markov Model (TMHMM)网站(https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)对ZH-4中所含Ⅱ型分泌蛋白的跨膜结构域进行预测。

1.2.7 T2SS分泌蛋白的亚细胞定位预测

通过CELLO v.2.5 (http://cello.life.nctu.edu.tw/)对ZH-4中T2SS分泌蛋白开展亚细胞定位预测，预测和分析过程如图1所示。

2 结果与分析

2.1 ZH-4 T2SS的基因组成

在α-变形菌纲、β-变形菌纲和γ-变形菌纲某些种属之间，T2SS基因的存在率似乎较低，然而，在葡糖醋杆菌、伯克霍尔德氏菌和地杆菌中的研究^[7]表明，T2SS基因至少在以上变形菌中存在一些功能。

与ZH-4同源性较高的K-12拥有完整的T2SS基因结构。图2为部分菌种之间T2SS组成图。由图2可知，Ⅱ型分泌的gspG、gspH、gspI、gspJ和gspK排列顺序最保守，外膜分泌子gspD、内膜平台gspF和gspE（编码ATP酶）的排列顺序在不同物种间有差异。嗜肺军团菌缺少大部分T2SS的基因。茄科劳尔氏菌除了有1套完整的T2SS基因外，还有多个gspD、gspF、gspG和gspE基因；大肠杆菌BL21(BL21)中除了拥有1套T2SS基因外，还拥有多个gspE、gspF、gspH、gspI、gspJ和gspK基因；白菜黑腐病菌和番茄疮痂病菌均有2套T2SS基因。

2.2 ZH-4中Ⅱ型分泌蛋白的预测

研究采用的菌株有21个，分别为嗜水气单胞菌、杀鲑气单胞菌、类鼻疽伯克霍尔德菌、越南芽胞杆菌、萝卜软腐欧文氏菌、菊基腐病菌、肠出血性大肠杆菌(EHEC)、产肠毒素大肠杆菌(ETEC)、K-12、BL21、奥克西托克雷白杆菌、嗜肺军团菌、铜绿假单孢菌、黏乳产碱杆菌、恶臭假单胞菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、野油菜黄单胞菌、菊欧文氏菌、希瓦氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌。

将表1中的T2SS分泌蛋白与ZH-4基因组序列进行对比，得到7条同源序列（如表2所示）。推测同源序列数量较少的原因可能是大部分Ⅱ型分泌蛋白具有致病性的毒力因子。

2.3 分泌蛋白的跨膜结构域

将7个序列进行TMHMM Server v.2.0以及SMART预测分析，结果如图3所示。

从图3中发现7个蛋白含有跨膜结构域的概率较低，ZH-4GM002540、ZH-4GM002541、ZH-4GM003554、ZH-4GM002178几乎不存在跨膜结构域，ZH-4GM004083有29.37%的概率在序列前端存在一个跨膜结构域。ZH-4GM002719和ZH-4GM003344的序列相似性较高，预测结果也基本一致。TMHMM Server v.2.0分析结果表明，ZH-4GM002540、ZH-4GM002541、ZH-4GM003554、ZH-4GM004083、ZH-4GM002718、ZH-4GM002719、ZH-4GM003344氨基酸残基数分别为619、914、417、216、814、205、205个。此外，7个蛋白的跨膜螺旋氨基酸数分别为0.470 79、0.001 72、1.220 75、5.154 48、1.032 30、0.000 34和0.000 35。N端前60个氨基酸中跨膜氨基酸数分别为0.467 29、0、0、5.154 13、1.007 97、0.000 17和0.000 17，N端位于细胞质侧的总概率分别为0.030 63、0.000 08、0.065 37、0.293 77、0.048 83、0.057 87和0.055 89。综合分析7个蛋白均为非跨膜蛋白，符合分泌蛋白的特点。结构域预测信息表明，7个蛋白均定位于胞外，与分泌蛋白的特点一致。

2.4 分泌蛋白的疏（亲）水性及理化性质分析

采用Protscale程序分析蛋白质的电负性及部分理化性质^[21]。结果表明，ZH-4中预测的7个Ⅱ型分泌蛋白在疏（亲）水性位点及数值方面均存在差异（如表3所示）。ZH-4GM003554中亲水性最强的氨基酸为164位的谷氨酸(E)，亲水性数值为-2.844，亲水性最弱的氨基酸为208位的缬氨酸(V)，亲水性数值为2.333；ZH-4GM002540中亲水性最强的氨基酸为519位的色氨酸(W)，亲水性数值为-2.822，而15、16、17、18位的4个氨基酸异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、丝氨酸(S)和丙氨酸(A)有同样的亲水性，数值为2.200；ZH-4GM002541中亲水性最强的氨基酸为207位的天冬氨酸(D)，亲水性数值为-3.211，亲水性最弱的氨基酸为505位的丙氨酸(A)，亲水性数值为2.156；ZH-4GM004083中亲水性最强的氨基酸为156位的丝氨酸(S)，亲水性数值为-2.322，亲水性最弱的氨基酸为13位的甘氨酸(G)，亲水性数值为2.989；ZH-4GM002718中亲水性最强的氨基酸为623位的天冬氨酸(D)，亲水性数值为-3.078，亲水性最弱的氨基酸为403位的甲硫氨酸(M)，亲水性数值为2.278；ZH-4GM002719中亲水性最强的氨基酸为159位的精氨酸(R)，其亲水性数值为-2.511，而95位的天冬氨酸(D)，其亲水性最弱，数值为1.478；ZH-4GM003344中47位的色氨酸(W)，其亲水性最强，数值为-2.178，而166位的酪氨酸(Y)，其亲水性最弱，数值为1.611。

对上述7个预测的Ⅱ型分泌蛋白的疏水性、亲水性数值进行统计分析，结果显示，ZH-4GM003554、ZH-4GM002540、ZH-4GM002541、ZH-4GM004083、ZH-4GM002718、ZH-4GM002719和ZH-4GM003344的蛋白总平均亲水性分别为-0.233、-0.493、-0.569、-0.574、-0.439、-0.484和-0.418。综上，7个Ⅱ型分泌蛋白全部为亲水性蛋白。此外，通过对ZH-4中的7个Ⅱ型分泌蛋白进行理化性质分析，结果显示，这7个Ⅱ型分泌蛋白的理论等电点最大为6.39，最小为4.68，均小于7，属于酸性蛋白；同时，ZH-4GM003554、ZH-4GM002718、ZH-4GM002540和ZH-4GM002541的不稳定系数均小于40，为稳定蛋白^[21]，而ZH-4GM004083的不稳定系数为47.25，半衰期为2 min，属于不稳定蛋白。ZH-4GM004083基因Blast比对发现，其为大肠杆菌锌指蛋白ZinT。研究表明，ZinT对T2SS具有依赖性^[22]。具体数值见表4。

2.5 分泌蛋白信号肽情况

采用SignalP 6.0网站对Ⅱ型分泌蛋白序列进行氨基酸信号肽预测分析，结果表明，ZH-4GM002540和ZH-4GM004083都含有Sec信号肽序列，切割位置都位于24~25之间，其信号肽序列分别为MNKKF KYKKSLLAAILSATLLAGC和LAIRLYKLAVALGV FIVSAPAFS。不同的是2种基因预测所得的信号肽切割酶类型不同，在ZH-4GM002540中预测有99.3%的概率为Sec/spⅡ，ZH-4GM004083预测有99.93%的概率为Sec/spⅠ。ZH-4GM002718有接近100%的概率存在Tat信号肽并通过Tat/spⅠ型信号肽切割酶作用，其信号肽序列为MKTKIPDAVLAAEVSRRG LVKT。ZH-4GM002719和ZH-4GM003344皆由dmsB基因序列比对获得，二者不存在信号肽的原因可能是在细胞内dmsA与dmsB结合后在信号肽的作用下转运进入细胞周质空间，而不单独进行跨细胞内膜的行为。

2.6 分泌蛋白的亚细胞定位

ZH-4中预测的7个Ⅱ型分泌蛋白有较大的概率定位于细胞外膜或胞外（如表5所示）。ZH-4GM002540与K-12外膜蛋白ssle基因同源性较高，预测定位于细胞外膜得分最高，为2.717。ZH-4GM003554由菊欧文氏菌中果胶裂解酶pel基因序列比对得到，研究表明，果胶裂解酶pel基因依赖T2SS向胞外分泌^[23]。ZH-4GM004083由致病性大肠杆菌的zinT基因序列比对得到，目前在K-12中还没有ZinT蛋白在细胞外检测到的报道，说明大肠杆菌中ZinT蛋白更有可能在细胞内发挥作用。

希瓦氏菌依赖MtrAB结合脂蛋白不仅能利用不溶性金属呼吸，还能利用胞外二甲基亚砜(DMSO)进行呼吸。dmsA和dmsB是大肠杆菌DMSO还原酶（含钼辅因子的dmsA和含亚基dmsB的铁硫簇）2个亚基的同源基因，分别编码MtrA和MtrB，即Fe (Ⅲ)氧化呼吸模块的周质和外膜组分。希瓦氏菌的DMSO呼吸既依赖于DMSO还原酶，也依赖于完整的T2SS。T2SS缺陷型的希瓦氏菌不能利用DMSO进行呼吸，从侧面反映出T2SS对细菌生命活动的重要性^[24]。

2.7 分泌蛋白的高级结构

ZH-4中预测的Ⅱ型分泌蛋白均含有比例较低的β-转角结构（如表6所示），7个Ⅱ型分泌蛋白均不含有跨膜螺旋结构（如图3所示）。一般而言，胞外蛋白倾向于富含β-转角，根据目前已知的结构^[25]，β链互补可能在Ⅱ型分泌过程的早期起重要作用。在分泌蛋白信号肽中，延伸区域通常是保守且功能未知的。有研究表明，自转运蛋白EspP信号肽附近的延伸区域缺失，会导致信号肽的错误折叠并严重影响其跨外膜转运作用^[26]。

同时，对上述7个Ⅱ型分泌蛋白进行三级结构预测，结果显示，7个Ⅱ型分泌蛋白均具有螺旋结构和无规卷曲结构，而只有ZH-4GM002540不存在β-转角结构（如图4所示）。

上述7个Ⅱ型分泌蛋白在模型尺寸上也不相同（图4）。ZH-4GM002719和ZH-4GM003344通过同一个基因比对得到，3D结构较为接近。

2.8 分泌蛋白同源序列进化树

将上述预测得到的7个Ⅱ型分泌蛋白导入NCBI官网中进行Blastp，筛选同源性高的序列构建系统发育树（图5）。结果表明，7个Ⅱ型分泌蛋白位于4个不同的基因簇中，每个基因簇又分为几个亚簇。其中ZH-4GM002540和ZH-4GM002541亲缘关系较近，与大肠杆菌脂蛋白ssle基因家族同源性较高，其余5个基因与ZH-4GM002540和ZH-4GM002541之间亲缘关系较远，ZH-4GM003554与大肠杆菌中丝氨酸羟甲基转移酶亲缘关系较近。ZH-4GM002719与部分大肠杆菌中dmsB基因的亲缘关系较近，ZH-4GM002719与大肠杆菌中DMSO呼吸复合体亚基ynfg基因亲缘关系较远。

3 结论

部分微生物，尤其是植物病原菌中常含有1~2套T2SS基因，但它们之间的功能分工尚不清楚^[27]。Ferrandez等^[28]发现达旦提狄克氏菌的第2套T2SS可分泌一种能固定于细菌表面的果胶裂解酶同源蛋白PnlH。同样，有报道发现大肠杆菌B系菌株内存在2套T2SS转运系统，其中1套受到HNS蛋白的抑制在实验室条件下被沉默。高冬芳等^[29]在研究芽孢杆菌的纤维素酶催化结构域Cel-CD时，同时敲除B系菌株的2套T2SS转运系统以验证Cel-CD的分泌方式。

大多数Ⅱ型分泌蛋白是在20世纪末鉴定的，经过几十年的研究，现在对于T2SS分泌系统的各个组成部分了解得较为清楚，但是关于T2SS如何识别分泌蛋白仍不清楚。相比于常见的致病性细菌，非致病性大肠杆菌Ⅱ型分泌蛋白的研究报道较少。在此基础上，本文中对目前已知的致病菌T2SS分泌体系进行了初步解析，并通过生物信息学手段，对ZH-4中具有高度同源性的Ⅱ型分泌蛋白进行蛋白特性和特征分析，筛选得到7个同源性较高的序列，通过亚细胞定位基本确定其中4个较大概率为胞外蛋白，符合分泌蛋白的特征。其余3个预测结果表明更有可能为周质蛋白；预测这7个分泌蛋白均不存在跨膜结构域，其中2个预测到存在Sec信号肽，1个预测到存在Tat信号肽；同时明确7个蛋白均具有较高比例的α-螺旋和较低比例的β-转角，并且总亲水性数值均为负值，表明7个蛋白均为亲水性蛋白。此外，预测结果表明，6个蛋白半衰期超过10 h，稳定性较高。这些信息可为深入研究大肠杆菌Ⅱ型分泌蛋白的特点提供理论依据。

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基金资助

国家自然科学基金项目(32060017)